BAB IV METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian Eksperimental, dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah penelitian Posttest Only Control Design ( Gliner,2000 ) dengan kultur in vitro . Skema rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut P0
P1

O1 O22

P$pulasi

Sampel

P2 O3

P3

!and$m

O4

Bagan 4. Skema !ancangan Penelitian In Vitro "eterangan # P0 # "el$mp$k "$ntr$l yang hanya diberi medium %&E& P # "el$mp$k Perlakuan yang diberi medium %&E& ' G&()S* ' +G* ,
60

P2 # "el$mp$k Perlakuan yang diberi medium %&E& ' G&()S* ' -cti.in -. P/ # "el$mp$k Perlakuan yang diberi medium %&E& 'G&()S* ' +G* , ' -cti.in -

1.2 Lokasi an !akt" Penelitian a.

Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di 0ab$rat$rium 1nstitut +r$pical %isease , "ampus ) 2ni.ersitas -irlangga 3ln &uly$re4$ Surabaya.
b.

!akt" Penelitian sampai dengan bulan &ei

Penelitian dilaksanakan selama 0 minggu se4ak bulan &aret 20 20 . 4.3 Penent"an #"$%e& Data 4.3.1 '&ite&ia #"%(ek

Pada penelitian ini sub4eknya adalah %arah Peri5er yang mengandung Hematopoetic Stem cell, yang memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi 4.3.1.1 '&ite&ia Inkl"si

Hematopoetic Stem cell %e6asa dari darah peri5er

Sehat +idak sedang 5lu, atau sakit

4.3.1.2 '&ite&ia Ekskl"si #

+er4adi apabila %arah 7em$lysis

4.3.1.3 '&ite&ia D&o) O"t

+er4adi apabila Sel &ati dalam "ultur. +idak dapat dinilai sel yang bermakna

4.3.2 Besa&an #a$)el Pada penelitian in vitro ini sampel diperhitungkan dengan !umus *ederer ( 89/) (:athasa, 200;) # (n( )<(t= )> ? n @ 4umlah replikasi t @ 4umlah perlakuan :ilai n yang diper$leh dari rumus ini adalah ? sampel, dengan 4umlah perlakuan / perlakuan. 4.3.3 Teknik )enent"an sa$)el

+eknik penentuan sampel penelitian in vitro dilakukan dengan cara berikut #

1. -spirasi sampel dari %arah Peri5er &anusia 2. "ultur sel 7emat$p$etik 3. Pemurnian sel 4. *asil k"lt"& ke$" ian i )anta" an i +a&i ke , i%e&i )e&lak"an. 4.4 Va&ia%el

Penelitian ini terdiri dari .ariabel bebas dan tergantung. Selain itu ada .ariabel yang dikendalikan. Berikut uraian klasi5ikasi .ariabel. 4.4.1 'lasi-ikasi Va&ia%el Aariabel dalam penelitian ini adalah #
1. Aariabel Bebas ( independent .ariable ) # d$sis mit$gen +G* B , -cti.in - , dan

G&()S*
2. Aariabel tergantung ( dependent .ariable ) # tumbuhnya sel langerhans kulit

dengan indikat$r. Baitu #

a. 3umlah sekresi 10 2 b. 3umlah sekresi 1nter5er$n Gamma

/. Aariabel kendali # suhu penyimpanan sel /;0), medium biakan, sterilitas, gas )C2 4.4.2 De-inisi O)e&asional . 1nter5er$n( D # 1nte&-e&on.ga$$a ( I/N.0 ) adalah sebuah dimeriEed larut sit$kin yang satu(satunya angg$ta kelas 11 4enis inter5er$n . 1nter5er$n ini a6alnya disebut makr$5ag(

mengakti5kan 5akt$r , istilah yang sekarang digunakan untuk menggambarkan sebuah keluarga besar pr$tein yang 1*:( D miliki. 2. Sel 0angerhans # Sel e5ekt$r pemba6a antigen imun pada kulit epidermis maupun di dermis. /. 10( 2 ( 1nterleukin 2 ) adalah suatu sit$kin pleitr$pik interleukin yang secara natural dipr$duksi $leh dendritic cells, macr$phage dan human B-lymphoblastoid cells (NC-3 ! dalam resp$n terhadap stimulasi antigen.
(

4., *"%"ngan Anta& Va&ia%el

A-!1-BE0 BEB-S %$sis +G*(, %$sis -cti.in %$sis G&()S* A-!1-BE0 +E!G-:+2:G Sekresi 10( 2 Sekresi 1*:(D

A-!1-BE0 "E:%-01 "ualitas dari &edium "ultur

Bagan 4.2 "erangka 7ubungan -ntar Aariabel 4.1 Alat an Ba+an Penelitian

4.1.1. Alat Penelitian -lat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut#
1. &icr$sc$pe 1n.erted 2. 1ncubat$r )C2 3. 0aminar 5l$6 4. +abung Erleinme4er 2 buah 5. Beker Glass 6. Pipet Glass ? = 0cc 7. Sentri5uge 8. Spuit 0 cc untuk ambil darah 9. Petridish 10. &icr$plate 24 6ell 11. )$n4ugated -nti 1nter5er$n Gamma atau bisa dengan )yt$kin 12. E01S- !eader 13. +abung centri5uge ? ml, dan ?0 ml 14. Bell$6 +ip 15. Blue +ip 16. *ic$l

7 17. PBS 18. Eppend$r5 tube 19. Pipet Single )hannel 20. Pipet &ultichannel 21. Pipet -ut$matic untuk Glass Pipet 22. )$n4ugated -nti 10( 2p;0

4.1.2 Ba+an )enelitian . Bahan 7uman +G* Beta ( sediaan st$k # Fg )

&erk ! G % System dengan :$ "atal$g # 00B Perhitungan # *$rmulasi dalam bentuk beku ( *reEEe dry ) dari 0,2F& s$luti$n didalam larutan acet$n nitrite dan +*- dengan BS- ( B$.ine Serum -lbumin ) sebagai carrier protein. )ara Pengenceran adalah dengan 0, H BS-. %$sis yang direk$mendasikan # 0,04 = 0,2 ngIml %$sis yang digunakan # 0,0? ngIml
3. Bahan -cti.in - ( sediaan st$k # ? Fg )

dengan membuat larutan 4m& 7cl lalu ditambahkan

&erk ! G % System dengan :$ 00/(-)+1A1: a Perhitungan #

St$k ?Fg ditambahkan dengan 00 Fl air sehingga men4adi k$nsentrasi ?000ng dalam 00Fl dalam 0m& citric acid, p7 /. Pengenceran ini tahan selama 4 bulan dalam suhu 4$). 3ika akan digunakan maka diencerkan dengan PBS yang mengandung 2 mgIml -lbumin dan disimpan di suhu = J0$). %$sis yang direk$mendasikan # 0,2 = 2 ngIml %$sis -cti.in - yang digunakan dalam penelitian ini adalah # 0,2 ngIml
4. Bahan G&()S* ( Sediaan 0Fg )

&erk !G% system dengan No katalog 2 D321, Perhitungan # +erlebih dahulu diencerkan dengan 00Fl PBS yang terdiri dari 0, H 7umanIBS%$sis yang direk$mendasikan # 9 = /0 pgIml %$sis yang digunakan adalah # 0 pgIml
5. %&E&

&erk G1B)C %&E&I* 2 dengan n$ katal$g 2 // (020 pr$duksi 1n.itr$gen (G1B)C) 4.4 Al"& an P&ose "& Penelitian 4.4.1 . P&ose "& Penelitian a. Pengambilan sampel penelitian @ darah peri5er b. "ultur sel 7emat$p$etic c. Pemurnian sel

d. Pengukuran 1ndikat$r Peningkatan sel 0angerhans setelah diberikan "ito#en e. -lat dan Bahan 5. -nalisis 7asil perlakuan. Pasase #el *e$ato)oetik

Supernatan diambil dari kultur hemat$p$etik dan dimasukkan dalam tube ? cc %ilakukan sentri5ugasi 900 rpm, ? menit , dalam suhu 2J$). "emudian supernatannya dibuang, pelletnya di resuspensi dengan medium penumbuh sebanyak 2cc.

0alu kita bagi men4adi 2 petri dish 0 cm, dan kedalam masing masing petri dish ditambahkan 8 cc medium %&E&, kita masukkan inkubat$r

Pasase ini kita lakukan tiap / sampai 4 hari , karena bila lebih dari ? hari maka sel(sel tersebut akan tumbuh terlalu padat sehingga nutrisi untuk sel 4uga semakin berkurang.

P&ose "& Pe&lak"an

Sampel dibagi dalam micr$plate 24 6ell dan dibagi men4adi 4 kel$mp$k yaitu . "el$mp$k "$ntr$l 2. "el$mp$k perlakuan /. "el$mp$k perlakuan 2 4. "el$mp$k perlakuan / # hanya diberi %&E& # %&E& ' +G*(, ' G&()S*

# %&E& ' G&()S* ' -cti.in # %&E& ' G&()S* ' +G*(, ' -cti.in -

&asing(masing kel$mp$k diamati tiap / hari dan diambil supernatannya untuk mengetahui kadar sekresi 10( 2 dan 1*:(D

10

%iambil 5$t$ mikr$sk$p dengan pembesaran 200<.

Pengambilan Sampel

4.4.2 Al"& Penelitian

Kultur dengan Media yang berbeda

Penelitian

Pengukuran ndikat!r "#12$ %&#' untuk Sel "anger(an)

*nali)i) +ata

Bagan 4.3 #ke$a Al"& )enelitian

4.8. Analisis Data

-nalisa data pada penelitian ini menggunakan #

4.8.1. -nalisa deskripti5 dengan E01S4.8.2. -nalisa :$rmalitas data dengan Shapiro $il% &est 4.8.3. -nalisa 7$m$genitas %ata dengan 'evene(s test 4.8.4. -nalisa "$mparati5 yang meliputi #

4.J.4.

)ne $ay *nova

4.J.4.2 'east Si#ni+icant ,i++erence( test ( 0S% ) 4.J.4.2 "ultivariete &est ( &an$.a )

11

4.5.1 P&otokol ELI#A %engan menggunakan merk ebi$science 7uman 10( 2 p;0 Platinum E01SB&S2/JIB&S2/J+E: dan ebi$science 7uman 1*:(D Platinum E01S- B&S22J)E.