PROCEDIMIENTO

Extracción de proteínas Preparación del gel

1.- Colocar unas cuantas semillas en un 1.-Montar la cámara de electroforesis,
mortero y moler hasta obtener una limpiar antes la superficie del vidrio
harina muy fina. expuesta al gel con SDS 0.1%.
2.- Pesar 50 mg de harina y 2.- Preparar el gel separador de
transfererirla a un tubo para poliacrilamida al 10%.
microcentrifuga.
Solución de 13.33 ml
3.- Añadir 400ul del buffer de acrlamida
extracción. Tris-HCL pH 8.8 15.05 ml
Agua desionizada 11.18 ml
4.- Homogenizar con varilla de vidrio. SDS 20% 0.2 ml
TEMED 0.04 ml
5.- Incubar en baño de hielo por 40
Persulfato de 0.2 ml
minutos, agitar en vortex cada 5
amonio 10%
minutos.
3.- Vaciar el gel separador hasta 2 cm
6.- Centrifugar 10 minutos a 12 000 antes del borde.
RPM.
4.- Cubrir la superficie con 4 ml de
7.- Recuperar el sobrenadante de un isopropanol frío retirándolo cuando
tubo limpio. polimerice el gel.
Nota: el sobrenadante contiene las 5.- Preparar el gel concentrador. (para 1
proteínas totales de la semilla. Guardar gel)
el tubo a -20° C hasta su uso.
Solución de 1.34 ml
acrilamida
Tris-HCL pH 6.8 1.0 ml
M
Agua desionizada 5.6 ml
SDS 20 % 0.04 ml
TEMED 0.008 ML
Persulfato de 0.04 ml
amonio 10 %

6.- Vaciar el gel y colocar el peine.

Esperar la polimerización.
 Electroforesis
1.- Tomas 20ul de la solución de proteínas y mezclarlas con 20ul de buffer de
muestra 2X .
2.- Cargar el gel con las muestras y marcadores.
3.- Correr a 40 V hasta que el frente entre al gel separador.
4.- Correr a 90 V hasta que le frente quede a 0.5 cm del borde inferior del gel.
5.- Teñir 2 horas.
6.- Desteñir hasta que las bandas sean visibles.

1.- ¿Qué es la electroforesis?

Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada
con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa.
2.- ¿Cuál es la base de la electroforesis para la separación de moléculas
biológicas?
Las moléculas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee
carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El
movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales:
la fricción con el solvente, movimiento browniano.
3.- ¿Para qué sirve el buffer que se coloca en la cámara?
Para que la conductividad eléctrica sea optima.
4.- ¿Qué moléculas, además de proteínas se pueden estudiar con esta técnica?
Carbohidratos, lípidos