Anda di halaman 1dari 32

I. TUJUAN PERCOBAAN Mahasiswa mampu menerapkan prinsip maserasi dan kolom kromatografi. II. DASAR TEORI 2.

1 Klasifikasi Curcuma domesticae Rhizhoma Divisi Sub Divisi Kelas Ordo Familia Genus Spesies : Spermatophyta : Angiospermae : Monocotyledoneae : Zingiberales : Zingiberaceae : Curcuma : Curcuma domestica Val. (Backer and R.C. Bakhuizen van den Brink, 1968) Struktur Kurkumin:

(Anonim, 2011) 2.2 Maserasi Maserasi merupakan suatu proses ekstraksi cair padat menggunakan suatu pelarut selama waktu tertentu dengan sesekali diaduk atau dikocok pada suhu kamar (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam alam pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam, karena dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder (Lenny, 2006). 1

Waktu maserasi pada umumnya 5 hari, setelah waktu tersebut keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan luar sel telah tercapai. Dengan pengocokan dijamin keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif (Indraswari, 2008). 2.3 Kromatografi Kolom Pada proses pemisahan dengan kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas kolom adsorben yang berada dalam suatu tabung (gelas, logam, ataupun plastik). Pelarut sebagai fase gerak karena gaya berat atau didorong dengan tekanan tertentu dibiarkan mengalir melalui kolom membawa serta pita linarut yang bergerak dengan kecepatan berbeda. Linarut yang telah memisah dikumpulkan berupa fraksi yang keluar dari bagian bawah kolom, sehingga metode ini merupakan kromatografi elusi. Dewasa ini bentuk akhir pengembangan metode kromatografi kolom adalah kromatografi cair kinerja tinggi, merupakan metode kromatografi yang paling canggih. Pada metode pemisahan ini interaksi yang terjadi antara larutan senyawa yang dianalisis dengan fase stasioner dapat terjadi dalam beberapa cara yaitu interaksi langsung antara senyawa dengan permukaan fase, atau fase stasioner hanya bersifat menyangga cairan kedua sehingga pemisahan terjadi berdasarkan partisi antara dua fase cairan. Faktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan jenis adsorben antara lain ialah sifat tidak boleh bereaksi dengan senyawa yang akan dianalisis, tidak bersifat sebagai katalis yang menyebabkan dekomposisi zat, tidak larut dalam pelarut yang digunakan, sedapat mungkin tidak berwarna atau tidak mengganggu pengamatan hasil pemisahan zat yang berwarna, mempunyai sifat yang stabil selama berlangsungnya pemisahan. Pemilihan pelarut dilakukan berdasarkan atas faktor-faktor seperti polaritas dan kelarutan (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992).

2.4

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapis tipis, yaitu berupa

lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangansecara menurun (descending) (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Plat KLT yang siap untuk dikembangkan umumnya dimasukkan secara vertikal ke dalam bejana komatografi dan pengembangan dikerjakan secara menaik. Harga Rf antara lain dipengaruhi oleh derajat kejenuhan ruangan di dalam bejana kromatografi. Untuk itu dinding sebelah dalam bejana dilapisi dengan kertas saring yang telah dibasahi dengan sistem pelarut sehingga udara di dalam bejana tersebut tetap jenuh pelarut. Pada KLT, pelarut bergerak dengan cepat pada pelat dan biasanya diperlukan jarak rambat 10-12 cm dari titik penotolan (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif atau fluorosensi sinar ultraviolet (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi Rf :

(Sudjadi, 1986)

III. ALAT DAN BAHAN 1. Alat Alat-alat gelas Batang pengaduk Chamber Cawan Porselin Batang Bambu Sarung Tangan Masker Botol Vial yang sudah dikalibrasi dengan volume 5 mL dan diberi nomor I-X Kertas Saring Kolom Kromatografi Toples Kaca Spektrofotometri UV Plastik Ikan Alumunium Foil

2. Bahan Serbuk Kunyit Etanol 96% Silika Gel N-Heksana Kloroform Plat KLT

IV.

PROSEDUR KERJA 4.1 Pembuatan Rhizoma Ditimbang 10 gram serbuk kering Curcumae domesticae Rhizoma. Ekstrak Curcumae domesticae

Dimasukkan dalam wadah (toples kaca) terlindung cahaya kemudian ditambah dengan 100 ml etanol 96%.

Ditutup dan didiamkan selama 5 hari sambil berulang diaduk (setiap 1 hari sekali). Setelah 5 hari sari disaring, ampas diperas (sebelum penyaringan, kertas saring ditetesi etanol 96 %).

Ampas ditambah 25 ml etanol 96%, diaduk dan dibiarkan 2 hari lalu disaring.

Ekstrak yang diperoleh lalu diuapkan di atas water bath menggunakan cawan porselin (yang sudah ditimbang sebelum digunakan) sampai didapat ekstrak kental.

Ditimbang cawan porselin yang berisi ekstrak kental. Dihitung ekstrak kental yang diperoleh.

4.2 Pemisahan dengan Kolom Kromatografi 1. Pembuatan Kolom Kromatografi Disiapkan 100 ml kloroform. Ditimbang 15 gram silika gel dalam beker gelas.

Glass wool dimasukkan ke dalam kolom setinggi 11,2 cm dengan diameter 2,5 cm.

50 ml kloroform dimasukkan ke dalam beker gelas yang berisi silika gel. Diaduk sampai terbentuk cairan seperti bubur.

10 ml kloroform dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding.

Bubur silika dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom. Hati-hati jangan sampai terbentuk gelembung/rongga.

Dinding kolom dibilas dengan kloroform. Sisa kloroform dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding. Kolom disimpan selama 1-2 hari sebelum siap digunakan.

2. Pengisian Cuplikan/Sampel ke dalam Kolom Disiapkan eluen (N-Heksana : kloroform : etanol 96% = 45 : 45 : 10). Ekstrak kental yang diperoleh ditambahkan 5 ml etanol 96%, dimasukkan ke dalam kolom kromatografi sedikit demi sedikit melalui dinding.

Wadah ekstrak dibilas dengan sedikit eluen, lalu dituangkan kembali ke kolom.

Biarkan cairan mengalir ke bawah sampai terserap semua.

3. Pemisahan Kolom dielusi dengan eluen sampai keluar eluatnya atur kecepatan elusi kurang lebih 1 mL per menit.

Eluat ditampung dalam 10 vial sampai tanda batas (sebanyak 5 mL).

Pekatkan eluat sampai setengah volum.

4.3 Identifikasi Kurkumin dengan KLT Semua fraksi yang sudah dipekatkan ditotolkan sebanyak 10 KLT silika gel GF254. Masukkan plat KLT ke dalam chamber, elusi sampai jarak pengembangan 1 cm dari tepi atas. pada plat

Angin-anginkan plat selama 10 menit. Amati di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm dan pada sinar matahari.

Tandai spot/noda dan hitung Rf masing-masing spot serta tentukan spot yang diduga kurkumin.

V. HASIL a. Bobot serbuk kunyit: 10 gram b. Volume etanol 96 % yang digunakan untuk maserasi: 100 ml c. Lama proses maserasi: 5 x 24 jam maserasi ditambah 2 x 24 jam remaserasi. d. Bobot ekstrak kental: 0,721 gram e. Rf dan warna spot kurumin: o Fraksi I Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda hijau muda Rf 0,425 hRf 42,5 Ket kurkumin Deteksi Sinar Matahari Warna kuning 0,44 45 kurkumin muda kecoklatan 0,45 45 kurkumin Rf hRf Ket -

o Fraksi II Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning 0,20 20 muda kecoklatan kuning 2 coklat 0,275 27,5 *Bis-des muda kecoklatan coklat tua kuning 0,3625 36,25 *Des muda kecoklatan 0,343 34,3 *Des 0,262 26,2 *Bis-des 0,20 20 Rf hRf Ket

o Fraksi III Spot Deteksi UV366 Warna coklat 1 muda kehijauan 0,2125 21,25 Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning muda kecoklatan kuning 2 coklat 0,2625 26,25 *Bis-des muda kecoklatan 3 coklat 0,29 29 *Bis-des coklat muda coklat muda 0,293 29,3 *Bis-des 0,25 25 *Bis-des 0,206 20,6 Rf hRf Ket

coklat tua

0,35

35

*Des

0,325

32,5

*Bis-des

o Fraksi IV Spot Deteksi UV366 Warna coklat 1 muda kehijauan *Bisdes *Bisdes *Des 0,2125 21,25 Rf hRf Ket Warna kuning muda kecoklatan kuning muda kecoklatan coklat muda coklat muda 0,25 25 *Bis-des 0,2125 21,25 *Bis-des 0,162 16,2 Deteksi Sinar Matahari Rf hRf Ket

coklat

0,25

25

coklat

0,3

30

coklat tua

0,35

35

0,325

32,5

*Bis-des

o Fraksi V Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning 0,225 22,5 muda kecoklatan kuning 0,275 27,5 *Bis-des muda kecoklatan 0,35 35 *Bis-des coklat muda 0,356 35,6 *Des 0,275 27,5 *Bis-des 0,225 22,5 Rf hRf Ket

coklat muda

coklat

o Fraksi VI Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda coklat 2 muda kehijauan 3 coklat 0,36 36 *Des 0,2875 28,75 *Bis-des Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning 0,23 22,5 muda kecoklatan kuning muda kecoklatan coklat muda 0,362 36,2 *Des 0,287 28,7 *Bis-des 0,243 24,3 Rf hRf Ket

o Fraksi VII Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda coklat 2 muda kehijauan 3 coklat 0,36 36 *Des 0,2875 28,75 *Bis-des Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning 0,2375 22,5 muda kecoklatan kuning muda kecoklatan coklat muda 0,362 36,2 *Des 0,287 28,7 *Bis-des 0,25 25 *Bis-des Rf hRf Ket

10

o Fraksi VIII Spot Deteksi UV366 Warna coklat 1 muda kehijauan coklat muda 0,23 23 Rf hRf Ket Deteksi Sinar Matahari Warna kuning muda kecoklatan kuning 0,2875 28,75 *Bis-des muda kecoklatan 0,356 35,6 *Des coklat muda 0,362 36,2 *Des 0,287 28,7 *Bis-des 0,25 25 *Bis-des Rf hRf Ket

coklat

o Fraksi IX Spot Deteksi UV366 Warna hijau muda coklat 2 muda kehijauan coklat muda 0,25 25 *Bis-des Rf 0,2375 hRf 23,75 Ket Warna kuning muda kuning muda kuning 0,406 40,6 kurkumin muda kecoklatan 0,406 40,6 kurkumin Deteksi Sinar Matahari Rf 0,25 hRf 25 Ket *Bis-des

0,318

31,8

*Bis-des

o Fraksi X Spot Deteksi UV366 Warna Rf hRf Ket Warna Deteksi Sinar Matahari Rf hRf Ket -

*keterangan : - Bis-des = Bisdesmetoksicurcumin - Des = Desmetoksicurcumin 11

5.1 Pembuatan Ekstrak Curcumae domesticae Rhizoma Tabel Penimbangan Maserasi dan Remaserasi No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Nama Bahan Serbuk kunyit Etanol 96% Etanol 96% Cawan porselin kosong Cawan + ekstrak kental Ekstrak kental Jumlah 10,0151 gram 100 ml 25 ml 67,0210 gram 7,7420 gram 0,721 gram Paraf

5.2

Kromatografi Kolom Tabel Pengambilan Bahan No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Silika gel Kloroform Tinggi kolom Diameter kolom Etanol 96% Kloroform N-Heksana Etanol 96% Nama Bahan Jumlah 15 gram 100 ml 11,2 cm 2,5 cm 5 ml 45 ml 45 ml 10 ml Paraf

o Perhitungan pembuatan eluen pada Kromatografi Kolom Eluen dibuat sebanyak 100 ml. N-Heksana Kloroform Etanol 96%

12

Tabel Pengamatan Elusi Kromatografi Kolom No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Fraksi Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Warna kuning bening kuning kecoklatan*** kuning kecoklatan** kuning kecoklatan* kuning jingga** kuning jingga* kuning keemasan kuning keemasan kuning keemasan kuning keemasan Paraf

10. Fraksi 10

Keterangan: tanda * menunjukkan warna yang semakin pekat.


5.3 Kromatografi Lapis Tipis Tabel Pengambilan Bahan

No 1. 2. 3.

Nama Bahan N-Heksana Kloroform Etanol 96%

Jumlah 9 ml 9 ml 2 ml

Paraf

o Perhitungan pembuatan eluen pada Kromatografi Kolom Eluen dibuat sebanyak 20 ml. N-Heksana Kloroform Etanol 96%

13

VI. PERHITUNGAN Perhitungan Rf dan hRf pada pemisahan dengan metode klt pada pengamatan dengan sinar UV366 nm

hRf = Rf x 100

Jarak pengembangan pada praktikum ini adalah 8 cm. o Fraksi I Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf ; hRf ; hRf

o Fraksi II Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi III Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf Spot 4 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf ; hRf ,3

o Fraksi IV Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf ; hRf ; hRf

14

Spot 3 : Rf Spot 4 : Rf

; hRf ; hRf

o Fraksi V Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VI Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VII Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf 75 ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VIII Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi IX Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf ; hRf ; hRf

15

Spot 3 : Rf

; hRf

o Fraksi X Perhitungan Rf dan hRf pada pemisahan dengan metode klt pada pengamatan dengan sinar matahari

hRf = Rf x 100

Jarak pengembangan pada praktikum ini adalah 8 cm. o Fraksi I Spot 2 : Rf ; hRf

o Fraksi II Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi III Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf Spot 4 : Rf ; hRf ; hRf 3 ; hRf ; hRf 3

o Fraksi IV Spot 1 : Rf ; hRf

16

Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf Spot 4 : Rf

; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi V Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VI Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VII Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf 5 ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi VIII Spot 1 : Rf Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf ; hRf ; hRf ; hRf

o Fraksi IX Spot 1 : Rf ; hRf

17

Spot 2 : Rf Spot 3 : Rf

; hRf ; hRf

o Fraksi X -

VII. PEMBAHASAN Praktikum kali ini mengidentifikasi secara kualitatif adanya senyawa kurkumin dalam serbuk Curcumae domesticae Rhizoma. Analisis kualitatif merupakan analisis untuk melakukan identifikasi elemen, spesies, dan/atau senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel. Dengan kata lain, analisis kualitatif berkaitan dengan cara mengetahui ada atau tidaknya suatu analit yang dituju dalam suatu sampel (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Teknik analisis yang dilakukan adalah dengan mengunakan metode ekstraksi cara dingin (maserasi), kromatografi kolom, dan kromatografi lapis tipis (KLT). Curcuma domestica dicirikan oleh senyawa fenol turunan diarilheptanoid atau kurkuminoid dan senyawa sesquiterpen. Oshiro (1990) dan Park (2002) melaporkan bahwa dalam C. domestica ditemukan tiga zat warna fenol turunan kurkuminoid. Ketiga senyawa fenol tersebut, yang merupakan senyawa fenol utama masing masing adalah bisferoloimetan atau kurkumin, 4-hidroksi sinamoil feruloil metan atau desmetoksikurkumin dan bis(4-hisroksisinamoil)-metan atau bisdesmetoksikurkumin. Kandungan utama dari kurkuminoid adalah kurkumin yang berwarna kuning jingga. Kandungan kurkumin di dalam kunyit berkisar 34%. Tiga varietas unggul kunyit menurut Balitro memiliki kadar kurkumin cukup tinggi yaitu 8,7% (Rahayu, 2010). Maserasi merupakan suatu proses ekstraksi cair padat menggunakan suatu pelarut selama waktu tertentu dengan sesekali diaduk atau dikocok pada suhu kamar (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam

18

karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempuma karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan (Lenny, 2006). Maserasi merupakan metode ekstraksi cara dingin dimana serbuk simplisia direndam dalam pelarut tertentu dan didiamkan dalam wadah tertutup rapat (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Metode maserasi digunakan untuk mengektraksi senyawa kurkumin dari serbuk Curcumae domesticae Rhizhoma berdasarkan sifat kurkumin yang sensitif terhadap cahaya. Bila kurkumin terkena cahaya, akan terjadi dekomposisi struktur berupa siklisasi kurkumin atau terjadi degradasi struktur (Kiswanto, 2005). Hal ini karena adanya gugus metilen aktif (-CH2-) diantara dua gugus keton pada senyawa tersebut (Rahayu, 2010). Produk degradasinya yang utama adalah asam ferulat, aldehid ferulat, dehidroksinaftalen, vinilquaikol, vanilin dan asam vanilat (Anonim, tt). Sebanyak 10 gram serbuk Curcumae domesticae Rhizoma direndam dalam 100 ml etanol 96 % selama 5 hari dalam toples yang tertutup rapat (ditutup dengan alumunium foil dan dilapisi dengan kain hitam). Faktor utama sebagai pertimbangan dalam pemilihan cairan penyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Hudayani, 2008). Penggunaan etanol sebagai cairan penyari didasarkan pada sifat fisiko kimia kurkumin yang tidak larut dalam air dan eter, tetapi larut dalam etil asetat, metanol, etanol, benzena, asam asetat glasial, aseton dan alkali hidroksida (Anonim, tt). Secara umum pelarut etanol merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam, karena dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder (Lenny, 2006). Selama perendaman dilakukan pengadukan setiap sehari sekali. Pengadukan ini bertujuan untuk meratakan konsentrasi larutan diluar butir-butir simplisia, sehingga dapat menjaga perbedaan konsentrasi sekecil-kecilnya antara didalam dan diluar sel (Sudjadi, 1986). Maserat disimpan di dalam toples yang tertutup rapat dan terhindar dari sinar matahari untuk mencegah terdekomposisinya senyawa kurkumin saat proses maserasi.

19

Waktu maserasi pada umumnya 5 hari, setelah waktu tersebut keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan luar sel telah tercapai. Dengan pengocokan dijamin keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif (Indraswari, 2008). Setelah 5 hari ekstrak disaring dengan kertas saring yang sebelumnya sudah ditetesi dengan etanol 96 % yang berfungsi untuk menghilangkan zat pengotor dan untuk proses penjenuhan. Proses penjenuhan bertujuan untuk mempercepat proses penyaringan, dengan cara membuat keadaan kertas saring sama dengan keadaan larutan campuran yang akan disari. Ampas yang diperoleh kemudian diperas dan dilakukan remaserasi dengan menambahkan 25 ml etanol 96 % pada ampas. Maserat dimasukkan di dalam botol yang dilapisi dengan alumunium foil kemudian disimpan di tempat terlindung cahaya. Sedangkan ampas yang ditambahkan 25 ml etanol kembali disimpan dalam toples terlindung cahaya dan didiamkan selama 2 hari. Proses remaserasi bertujuan untuk memperoleh zat-zat aktif yang lebih optimal kemurniaanya. Waktu kontak yang lama antara etanol dengan serbuk simplisia akan mengoptimalkan pelarutan zat-zat yang diinginkan. Setelah proses remaserasi, maserat kemudian diuapkan di atas waterbath dengan cawan porselin (yang sebelumnya sudah ditimbang bobotnya) sampai didapat ekstrak kental. Pada proses penguapan ekstrak, pengadukan dilakukan agar suhu dapat menyebar dengan merata akibat adanya panas yang akan memperluas permukaan kontak. Pembuatan ekstrak kental bertujuan agar pada saat pengelusian dengan kromatografi kolom, volume ekstrak yang dielusi tidak terlalu besar sehingga akan mempermudah proses pengelusian. Ekstrak kental adalah sediaan kental yang memiliki kandungan pelarut kurang dari 10 %. Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Hudayani, 2008). Ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 0,721 gram. Ekstrak kental kemudian ditutup dengan alumunium foil dan disimpan pada tempat terlindung cahaya.

20

Tahap selanjutnya adalah pemisahan dengan menggunakan metode kromatografi kolom. Pemisahan ini dilakukan untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni dari proses maserasi untuk diidentifikasi lebih lanjut dengan metode kromatografi lapis tipis. Kromatografi adalah suatu proses migrasi differensial dimana komponen-komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam. Kromatografi merupakan cara pemisahan yang mendasari partisi cuplikan antara fase gerak dan fase diam (Rahayu, 2010). Pada prinsipnya ada dua cara pengemasan kolom, yaitu cara basah dan cara kering. Untuk pengemasan kolom cara basah, fase diam (adsorben) yang digunakan adalah silika gel dan untuk pengemasan kolom cara kering, fase diam (adsorben) yang digunakan adalah alumina (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Pada praktikum kali ini pengemasan kolom dilakukan dengan cara basah. Mulamula glass wool dipasang pada dasar kolom kemudian dimasukkan 10 ml kloroform untuk memastikan bahwa glass wool tidak akan menimbulkan gelembung. Kemudian dibuat campuran bubur dari serbuk silika gel dengan 50 ml kloroform. Campuran bubur dituang ke dalam kolom dengan cara diaduk lalu langsung dituang. Silika gel yang menempel pada dinding dibilas dengan sisa kloroform dan sisa kloroform dimasukkan ke dalam kolom. Bagian atas kolom dan kran pada bagian bawah kolom ditutup dengan plastik ikan. Pemilihan pengemasan kolom dengan cara basah bertujuan untuk memperoleh kolom yang kompak dibandingkan cara kering. Selain karena metode ini memang paling sering digunakan, pembuatan kolom dengan cara basah memiliki resiko kerusakan yang lebih kecil. Dasar kolom diisi dengan glass wool yang berfungsi untuk mencegah adsorben keluar dari dalam kolom saat keran dibuka. Sebelum memasukkan bubur silika gel dan eluen ke dalam kolom, keadaan kolom harus diperhatikan. Kolom yang dipasang harus benar-benar dalam keadaan kering, karena apabila kolom dalam keadaan basah (terdapat air) silika sebagai adsorben akan mengalami reaksi pendeaktivasian sisi aktif silika akibat adanya air yang diserap pada permukaan silika gel. Silika gel merupakan adsorben yang bersifat polar akibat adanya gugus -OH di dalam struktur kimianya. Permukaan polar pada silika gel berfungsi melalui titik-titik permukaan

21

teroksiginase, terutama gugus hidroksi. Gugus ini menarik molekul linarut akibat campuran yang rumit dari interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen (Gritter, 1991). Hal tersebut menyebabkan sisi aktif dari silika gel dapat berikatan dengan molekul air yang ada dan menyebabkan silika gel menjadi tidak aktif. Ada beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan adsorben antara lain sifat tidak boleh bereaksi dengan senyawa yang akan dianalisis, tidak bersifat sebagai katalis yang menyebabkan dekomposisi zat, tidak larut dalam pelarut yang digunakan, sedapat mungkin tidak berwarna atau tidak mengganggu pengamatan hasil pemisahan zat berwarna, mempunyai sifat yang stabil selama berlangsungnya proses pemisahan dan mempunyai ukuran partikel yang seragam (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Silika gel adalah fase diam yang paling sering digunakan untuk pemisahan produk alam. Silika gel memberikan area permukaan yang sangat luas. Rata-rata ukuran partikel silika gel yang digunakan dalam kolom kromatografi adalah 40 200 m dengan ukuran pori sebesar 40 hingga 300 . Seberapa kuat senyawa tertahan dalam silika gel tergantung pada polaritas fase gerak. Semakin kuat kemampuan ikatan hidrogen suatu solven, semakin baik eluen untuk mengelusi senyawa polar yang teradsorb pada kolom silika gel. Pengembangan kolom biasanya meliputi peningkatan prosentase polar solven selama kromatografi berlangsung (Noviyanti, 2010). Kolom yang telah dibuat didiamkan selama 1 hari untuk memperoleh kolom yang kompak. Selama 1 hari pendiaman kolom harus selalu diperhatikan jangan sampai kolom kering karena kekurangan pelarut sehingga terjadi keretakan yang dapat merusak kolom dan mengganggu proses pengelusian sehingga merusak hasil pemisahan. Kolom juga ditutup pada ujung atas dan keran yang berada dibawah dengan plastik ikan berlapis-lapis untuk mencegah terjadinya penguapan pelarut selama pendiaman. Setelah satu hari pendiaman kolom, kemudian dilakukan pengembangan sampel. Kolom yang baik untuk pengelusian adalah kolom yang kompak dan tidak terdapat rongga/gelembung yang bisa mengganggu proses pengelusian sehingga hasil pemisahan yang diperoleh kurang baik. Pada praktikum kali ini, kolom yang diperoleh memiliki rongga/gelembung

22

udara di dalamnya. Hal ini disebabkan kurang hati-hatinya praktikan saat mengeluarkan kloroform dari dalam kolom karena keran yang dibuka tidak diatur alirannya serta dalam meletakkan glass wool yang kurang sempurna sehingga memicu adanya gelembung udara. Eluen yang digunakan pada pengelusian disiapkan sebanyak 100 ml. Kloroform dan N-heksana masing-masing sebanyak 45 ml dipipet lalu ditempatkan pada beker gelas. Kemudian ditambah 10 ml etanol 96 % dicampur pada beker gelas. Sebanyak 25 ml eluen dimasukkan ke dalam kolom dengan hatihati. Kloroform yang sebelumnya dipakai untuk pelarut silika gel dikeluarkan dengan hati-hati sampai eluen mencapai batas tepat di atas silika gel. Ekstrak kental yang didapat dilarutkan dengan 5 ml etanol 96 % kemudian dimasukkan ke dalam kolom dengan hati-hati dan dibiarkan turun berdasarkan gaya gravitasi. Kemudian eluen ditambahkan pada cawan porselin untuk melarutkan sisa ekstrak dan kembali dituangkan ke dalam kolom. Selama proses pengelusian dilakukan, eluen tetap ditambahkan sedikit demi sedikit dan kolom pada bagian atas ditutup sedikit dengan plastik ikan dan aluminium foil untuk mencegah penguapan yang berlebihan pada pelarut. Tetesantetesan yang keluar diatur sedemikian rupa agar tidak terlalu cepat atau terlalu lambat. Tetesan-tetesan dari keran ditampung sebagai fraksi-fraksi dan ditempatkan pada 10 buah vial (diberi nomor I-X) yang masing-masing telah dikalibrasi 5 ml. Prinsip sorpsi yang digunakan pada pemisahan dengan kromatografi kolom adalah adsorpsi dimana terjadi interaksi dengan permukaan fase diam. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol dan penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan absorben (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Tingkat adsorpsi komponen tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak cair. Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel (Noviyanti, 2010). Prinsip pemisahan kolom kromatografi juga di dasarkan pada

23

afinitas kepolaran senyawa yang akan dielusi, dimana fase diam yang bersifat polar akan mengelusi senyawa senyawa yang non polar turun bersama fase gerak yang digunakan, sedangkan senyawa senyawa non polar akan tertahan pada fase diamnya. Pada praktikum ini fase gerak (eluen) yang digunakan adalah campuran dari N-heksana, kloroform dan etanol 96 % yang bersifat non polar. Sedangkan fase diamnya adalah silika gel yang bersifat polar. Senyawa kurkumin bersifat non polar karena tidak larut dalam air (Anonim, tt) sehingga senyawa kurkumin akan mudah mengalir mengikuti fase gerak dan tidak teradsorpsi serta tidak tertahan pada fase diam. Penampungan fraksi-fraksi dilakukan setelah seluruh kolom mulai berubah warna menjadi kekuningan, khususnya pada bagian yang mendekati keran pada bawah kolom. Keran dibuka secara perlahan serta diatur alirannya kemudian fraksi ditampung satu persatu dengan kecepatan tetesan yang sama hingga diperoleh 10 fraksi. Pada praktikum ini sepuluh fraksi yang didapatkan menghasilkan warna yang berbeda-beda, yaitu fraksi I berwarna kuning muda bening, fraksi II, III, dan IV berwarna kuning kecoklatan dimana fraksi II memiliki kepekatan paling tinggi diantaranya. Fraksi V dan VI berwana kuning jingga namun fraksi V memiliki warna kuning jingga yang lebih pekat jika dibandingkan dengan fraksi VI. Fraksi VII, VIII, IX, dan X berwarna kuning keemasan. Dari kesepuluh fraksi yang diperoleh, fraksi II memiliki warna yang paling pekat. Setelah kesepuluh fraksi tertampung, semua eluen dalam kolom dikeluarkan dan silika gel dikeluarkan dari dalam kolom. Kesepuluh fraksi kemudian dipekatkan dan disimpan dalam tempat terlindung cahaya untuk nantinya diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis. Kromatografi Lapis Tipis (KLT), salah satu alat pemisah dan alat uji senyawa kimia secara kualitatif dan kuantitatif. Senyawa yang diuji dapat berupa senyawa tunggal maupun senyawa campuran dari produk pabrik, hasil sintesis, isolasi dari hewan percobaan, maupun dari tanaman dan mikroorganisme (Stahl, 1985). Pelacak bercak dengan menggunakan bantuan spektroskopis umumnya menggunakan sinar UV atau sinar tampak. Uji kualitatif digunakan parameter Rf (Retardation factor), harga Rf senyawa tersebut dibandingkan dengan harga

24

standar (Rahayu, 2010). Secara garis besar, fase diam yang umum digunakan ada 2 jenis. Fase diam yang polar (mengikuti fase normal) dan fase diam yang non polar (fase terbalik). Fase diam yang sering digunakan adalah silika gel. Silika yang digunakan merupakan silika yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit asam, dan merupakan fase diam yang paling populer digunakan. Silika digunakan untuk kromatografi dengan fase normal. Silika gel GF254 bersifat polar, dimana G berarti Gypsum (pengikat), biasanya pengikat yang digunakan adalah kalsium sulfat (CaSO4.1/2 H2O), F adalah Flouresency (panjang gelombang) yaitu lempeng KLT ditambahkan bahan yang berfluoresensi seperti seng silikat teraktivasi mangan, dan 254 menunjukkan panjng gelombang eksitasi senyawa berfosforisensi yang ditambahkan. Jadi GF254 adalah adsorben silika gel dengan pengikat kalsium sulfat dengan ditambahkan indikator yang dapat berflouresensi jika dideteksi pada sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Indikator flouresensi ialah senyawa yang memancarkan sinar tampak jika disinari dengan sinar ultraviolet (Gritter, 2011). Selain fase diam juga digunakan fase gerak sebagai pengelusi. Pemilihan fase gerak baik tunggal maupun campuran tergantung pada sampel yang dianalisis dan fase diam yang digunakan (Rahayu, 2010). Pada praktikum ini fase gerak (eluen) yang digunakan merupakan pelarut organik yang bersifat non polar, yaitu N-heksana, kloroform, dan etanol 96% dengan perbandingan 45:45:10. Pada prinsipnya pengerjaan KLT meliputi tahap-tahap sebagai berikut: pembuatan plat, penotolan cuplikan, pemilihan adsorben, pemilihan pelarut, pemilihan sistem pengembang, pengamatan lokasi bercak, deteksi, dan identifikasi (Kusmardiyani dan A. Nawawi, 1992). Penyiapan atau preparasi fase diam yang berupa plat silika gel GF254 dilakukan dengan pemotongan plat dengan ukuran 10 cm 10 cm. Pemotongan

plat dilakukan dengan menggunakan cutter dengan cara plat dibalik sehingga permukaan silika berada di bawah. Sebelumnya lapisi permukaaan bawah silika dengan kertas bersih. Hal ini bertujuan agar permukaan silika tidak terkelupas saat pemotongan sehingga tidak mengganggu proses pengembangan sampel. Pada teori yang sebenarnya harus dilakukan pencucian plat dan pengaktivasian plat

25

sebelum dilakukan penotolan. Namun karena keterbatasan waktu proses ini tidak dilakukan pleh praktikan. Proses pencucian plat bertujuan untuk membersihkan plat dari pengotor-pengotor yang menempel pada plat. Pencucian dilakukan dengan cara mengisi chamber dengan metanol kemudian plat KLT ditempatkan di dalam chamber dan tutup chamber. Bagian atas plat dilapisi dengan tisu yang berfungsi untuk menangkap pengotor pada saat proses pengelusian plat. Sebelumnya plat diberi tanda batas atas dan tanda batas bawah. Tanda batas bawah sebagai batas atau tempat penotolan sampel dan tanda batas atas sebagai penanda diakhirinya proses pengelusian. Pemilihan metanol sebagai pelarut dalam pencucian plat dibandingkan dengan etanol karena sifat semipolar metanol (CH3OH). Metanol mengandung tiga atom H dan satu gugus OH. Dengan sifatnya yang semipolar, maka metanol lebih mampu membersihkan zat-zat pengotor dibandingkan dengan etanol yang bersifat lebih nonpolar. Selain itu kemampuan metanol untuk menguap lebih besar dibandingkan etanol. Setelah proses pencucian selesai plat silika gel GF254 diaktivasi pada suhu 110C selama 30 menit yang bertujuan untuk menjaga kelembaban dan menghilangkan sedikit kandungan air serta uap air (plat menjadi aktif) agar tidak mempengaruhi proses pengelusian. Pengaktivasian plat tidak boleh dilakukan pada suhu lebih dari 110C karena bisa terjadi degradasi yang tak bolak-balik pada penjerap dan menyebabkan pemisahan kurang efektif (Gritter, 1991). Plat silika gel memiliki gugus OH sehingga apabila diaktivasi pada suhu tinggi, akan menyebabkan plat kehilangan sejumlah kandungan air yang akan membuat permukaan plat terkelupas sehingga tidak bisa dilakukan proses penotolan. Namun karena keterbatasan waktu praktikan, proses pengaktivasian tidak dilakukan. Pemilihan sistem pengembang (fase gerak) tergantung pada sifat campuran senyawa yang akan dipisahkan dan media pemisahan yang digunakan. Pada umumnya polaritas pelarut dan polaritas senyawa disesuaikan untuk mendapatkan sistem pengembang yang yang akan digunakan. Pelarut yang bersifat lebih polar umumnya memberikan daya migrasi yang lebih besar, di samping itu penggunaan kombinasi dua pelarut atau lebih akan memberikan hasil pemisahan lebih baik dari pelarut tunggal (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Fase gerak berupa larutan

26

N-heksana, kloroform, dan etanol 96 % bersifat nonpolar. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai Rf (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Fase gerak disiapkan dengan mencampur 9 ml N-heksana, 9 ml kloroform dan 2 ml etanol 95 %. Setelah campuran homogen, fase gerak kemudian dijenuhkan di dalam chamber. Kertas saring sebagai indikator penjenuhan dimasukkan ke dalam chamber, dengan cara menempelkan pada dinding chamber. Penjenuhan dilakukan untuk memperoleh uap dan tekanan yang merata/homogen di dalam chamber yang nantinya berfungsi untuk membuat pengelusian berjalan baik dan hasil yang didapat dari pengelusian diharapkan mampu untuk mengidentifikasi senyawa yang terkandung di dalam sampel yang di uji. Apabila cairan dalam chamber telah merambat naik secara sempurna pada kertas saring maka dapat dikatakan chamber telah jenuh. Proses penotolan pada plat KLT dilakukan saat proses penjenuhan chamber. Sampel biasanya ditotolkan sebagai bercak bulat atau garis 1,5-2 cm dari tepi bawah. Pada penotolan sampel jarak penotolan antara sampel yang satu dengan sampel yang lain adalah 1 cm. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Bercak sebaiknya berukuran 3-6 mm. Penotolan dapat dilakukan dengan mikropipet atau microsyiringe, biasanya diperlukan 1-20 l (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Pada praktikum ini dilakukan penotolan sampel sebesar 10 l. Penotolan sampel sebanyak 10 l berdasarkan rekomendasi untuk penotolan secara manual baik untuk data KLT kualitatif dan kuantitatif (Dekker, 2003). Praktikan melakukan 5 kali penotolan karena yang ditotolkan sebanyak 10 sedangkan mikropipet memiliki kapasitas 2 sekali penotolan (5

kali penotolan pada titik yang sama). Penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkab bercak yang menyebar dan puncak ganda serta terbentuknya tailing (pemisahan

27

yang berekor) (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Kelebihan beban menyebabkan bercak asimetri dan perubahan harga Rf (Stahl, 1985). Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah

mengembangkan sampel tersebut dalam chamber yang telah jenuh. Tepi bagian bawah plat yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam chamber harus di bawah plat yang berisi totolan sampel untuk mencegah adanya reaksi yang terjadi antara fase gerak dan totolan. Selama proses pengelusian, chamber ditutup rapat untuk menjaga kestabilan fase gerak yang ada di dalamnya. Chamber harus tertutup rapat dan sedapat mungkin menggunakan sedikit fase gerak (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng hingga ketinggian yang ditentukan) untuk memaksimalkan dan efesiensi proses pengelusian (Gandjar dan A. Rohman, 2007). Fase diam silika gel yang bersifat polar akan menjerap fase gerak yang bersifat nonpolar yang nantinya mampu menggerakkan senyawa yang bersifat nonpolar sehingga terjadi pergerakan senyawa dari titik asalnya. Pergerakan senyawa ini diakibatkan oleh adanya perbedaan afinitas dan pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending). Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan yang didasarkan atas afinitas suatu analit terhadap fase diam dan fase gerak yang diukur berdasarkan kepolaran. Setelah proses pengelusian selesai plat dikeluarkan dari dalam chamber kemudian diangin-anginkan selama 10 menit agar eluen yang digunakan menguap. Spot (bercak) pemisahan pada KLT merupakan spot yang berwarna kuning kecoklatan jika diamati pada sinar matahari. Untuk mengetahui spot secara pasti plat kemudian diamati di bawah sinar UV366. Identifikasi kurkumin dan turunannya dilakukan dengan membandingkan harga Rf dengan pustaka. Kandungan hRf Warna pada UV366 Warna pada sinar matahari kurkumin desmetoksikurkumin 40-45 35-40 merah darah salmon merah-jingga muda Jingga Jingga kuning terang (Stahl, 1985 ) 28

bisdesmetoksikurkumin 25-35

Saat diamati pada UV366 hasil fluoresensi menampakkan banyak spot berwarna hijau muda, coklat muda kehijauan, coklat hingga coklat tua. Berdasarkan perbandingan Rf dan hRf yang diperoleh, spot yang diduga kurkumin terdapat pada fraksi I spot pertama dan kedua dengan harga hRf berturut-turut 42,5 dan 42,5; serta fraksi IX spot ketiga dengan harga hRf 40,6. Sedangkan desmetoksikurkumin terdeteksi pada fraksi II spot ketiga dengan harga hRf 36,25, fraksi III spot keempat dengan harga hRF 35, fraksi IV spot keempat dengan harga hRf 35, fraksi V spot ketiga dengan harga hRf 35, fraksi VI spot ketiga dengan harga hRf 36, dan fraksi VII spot ketiga dengan harga hRf 36. Dan bisdesmetoksikurkumin terdeteksi pada fraksi III spot kedua, dan ketiga dengan harga hRf masing-masing 26,25; 29,3, fraksi IV spot kedua dan ketiga dengan harga hRf 25 dan 30, fraksi V spot kedua dengan harga hRf 27,5, fraksi VI spot kedua dengan harga hRf 28,75, serta pada fraksi VII dan VIII masing-masing terdapat pada spot kedua dengan harga hRf 28,75. Pada fraksi X tidak ditemukan spot karena hasil pemisahan yang tidak sempurna sehingga pemisahan yang terbentuk tidak lurus melainkan miring ke kiri dan mengganggu proses pemisahan fraksi IX. Pemisahan yang tidak sempurna ini kemungkinan disebabkan oleh pemotongan plat yang tidak sempurna, sehingga plat KLT bergerigi pada pinggirnya. Selain itu eluen yang tercampur kurang sempurna ikut mempengaruhi ketidaksempurnaan pemisahan fraksi X. Namun hal utama yang menyebabkan ketidaksempurnaan pemisahan pada fraksi X adalah pemotongan plat. Dengan membandingkan harga Rf dan fluoresensi warna pada spot yang diperoleh dengan pustaka, maka senyawa yang diuji diduga mengandung kurkumin,

desmetoksikurkumin, dan bisdesmetoksikurkumin. Sedangkan berdasarkan pengamatan dibawah sinar matahari ditinjau dari warna spot yang terjadi sesuai dengan pustaka yang digunakan sebagai pembanding yaitu berkisar dari warna kuning muda, kuning muda kecoklatan, hingga coklat muda. Sedangkan berdasarkan harga Rf dan HRf yang diperoleh tidak berbeda jauh dengan pengamatan pada deteksi dengan sinar UV366, yaitu diduga terdapat kandungan kurkumin pada fraksi I pada spot kedua dengan nilai hRf 45 dan fraksi IX pada spot ketiga dengan nilai hRf 40,6. Kandungan

29

desmetoksikurkumin terdeteksi pada fraksi III spot keempat dengan nilai hRf 36,25, fraksi V spot ketiga dengan nilai hRf 35,6, fraksi VI spot ketiga dengan nilai hRf 36,2, fraksi VII spot ketiga dengan nilai hRf 36,2, dan fraksi VIII spot ketiga dengan nilai hRf 36,8. Sedangkan bisdesmetoksikurkumin terdeteksi pada fraksi II spot kedua dengan nilai hRf 26,2, fraksi III spot ketiga dengan nilai hRf 29,3, fraksi IV spot ketiga dan keempat dengan nilai HRf berturut-turut 25 dan 32,5, fraksi V spot kedua dengan nilai hRf 27,5, fraksi VI spot kedua dengan nilai hRf 28,7, fraksi VIII spot pertama dan kedua dengan nilai hRf berturut turut 25 dan 28,7, dan fraksi IX spot kedua dengan nilai hRf 31,8. Pemisahan yang kurang sempurna disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya akibat pemisahan pada kromatografi kolom yang kurang sempurna karena kolom yang bergelembung, dan akibat pemotongan plat KLT yang tidak bagus. Ketidaksesuaian warna yang dihasilkan saat diamati pada sinar UV366 antara pustaka dengan hasil percobaan disebabkan oleh kondisi praktikum yang berbeda (suhu, kelembaban, pH). Hasil yang kurang sesuai dengan pustaka juga dapat disebabkan oleh perbedaan eluen yang digunakan pada saat pengembangan sampel, kualitas pelarut, kualitas adsorben, ketebalan lapisan adsorben, kejenuhan bejana, dan proses preparasi KLT (waktu aktivasi, waktu penjenuhan). Selain itu, kurkumin akan memberikan warna merah darah pada suasana basa, sedangkan pada praktikum ini digunakan plat KLT silika gel GF254 yang bersifat sedikit asam sehingga tidak memberi fluoresensi warna merah darah pada waktu pengamatan dengan sinar UV366.

30

Berikut adalah spot hasil pengamatan dibawah sinar UV366 dan sinar matahari: UV366

Sinar matahari

31

VIII.

KESIMPULAN

8.1

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pemgadukan pada temperatur kamar. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama. Dengan

perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik. 8.2 Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan menggunakan suatu kolom adsorben di dalam suatu tabung kaca yang dilengkapi keran tertentu. Pemisahan ini menggunakan prinsip adsorpsi dimana terjadi interaksi dengan permukaan fase diam dan prinsip partisi, dimana terjadi distribusi diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak sesuai dengan kelarutan relatifnya diantara kedua fase tersebut.. Adsorpsi pada permukaan
melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol dan penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan absorben.

8.3

Kromatografi lapis tipis adalah adalah suatu metode pemisahan secara fisiko-kimia dengan menggunakan lempengan tipis adsorben sebagai media pemisahan. Prinsip KLT adalah adsorpsi, didasarkan atas afinitas suatu analit terhadap fase diam dan fase gerak yang diukur berdasarkan kepolaran dimana senyawa yang memiliki afinitas lebih besar terhadap fase diamnya akan menempel pada fase diamnya, dan yang memiliki afinitas kecil pada fase diamnya akan mengalir bersama fase geraknya.

8.4

Serbuk simplisia Curcumae domesticae Rhizhoma diduga mengandung senyawa kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin, desmetoksikurkumin, dan bisdesmetoksikurkumin.

32