Laporan Praktikum Biokimia

Hari/tanggal Waktu PJP Asisten

: Senin/ 18 November 2013 : 09.00-10.40 WIB : Inda Setyawati, S.TP., M.Si. : Lusianawati, S.Si. Sari Yuniarini, S.Si.

ISOLASI DNA KROMOSOM UMBI BAWANG MERAH Kelompok 10 Bhisma Damareka J3L212190 Winarsih J3L212191 Gemala Noriah J3L212193 Seto Aji P J3L212195

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Pendahuluan Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit

mononukleotida, jika unit - unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat(RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya (Lehninger 1982). Sentrifugasi merupakan suatu metode yang digunakan dalam pencapaian sedimentasi dimana partikel-partikel yang ada di dalam suatu bahan yang dipisahkan dari fluida oleh gaya sentrifugasi yang dikenakan pada partikel. Dalam penggunaan metode sentrifugasi ini terdapat sebuah alat yang penting. Alat yang diperlukan dalam metode ini adalah sentrifugase. Yang dimaksudkan agar segala bentuk proses pemisahan zat dapat dipercepat. Prinsip kerjanya yaitu dimana objek diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik dimana dititik tersebut dikenekan gaya. Pada saat objek diputar, partikel-partikel yang ada akan berpisah dan berpencar sesuai berat jenis masing-masing partikel. Dengan gaya yang paling berperan adalah gaya sentrifugal. Dengan adanya teknik ini, proses pengendapan suatu bahan akan lebih cepat dan optimum dibandingkan dengan teknik biasa (Khopkar 1990) Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik, tetapi hanya pada sistem-sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan dan non bonding elektron .Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io)

melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It) (Khopkar 1990)

Tujuan Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi DNA kromosom. Metode Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala 100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air. Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%, Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH. Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 1,5 gram garam dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60C dalam water bath selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian ditambahkan 1 gram NaCl, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan dipindahkan ke dalam 4 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom. Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.

Data dan Hasil Pengamatan Tabel 1. Data Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA dari umbi Bawang A Terkoreksi [DNA] Larutan A260 A280 (g/mL) A260 A280 Blanko (TE) 0,2843 0,2095 Sampel 0,3636 0,3025 0,0793 0,0930 101,1075 0,852

Rasio A260:A280

Contoh perhitungan A terkoreksi (A260) = Asampel Ablanko = 0,3636 0,2843 = 0,0793 A terkoreksi (A280) = A sampel Ablanko = 0,3025 0,2095 = 0,0930 [DNA] = A260 terkoreksi x 50 g/mL x Fp = 0,0793 x 50 g/mL x 25,5 = 101,1075 g/Ml
= A260 Terkoreksi

FP = 100L + 2,45mL = 2,55 ml 2,55 ml/0,1ml = 25,5 x pengenceran

Rasio A260 : A280

: A280 Terkoreksi = 0,0793 : 0,0930 = 0,852

Pembahasan Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel, menghilangan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang diperoleh (Albert 1994). Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Prinsip dari proses isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease, seharusnya (yang berfungsi

mendegradasi protein) tetapi digunakan kristal NaCl dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 60C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase) (Yuwono 2009) Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air . Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini. Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah diisolasi. Beberapa pereaksi digunakan dalam proses isolasi DNA kromosom dari umbi bawang merah, diantaranya garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel, SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein merusak interaksi polar pada membran sel, penambahan alkohol dingin berfungsi untuk mengikat DNA dan membentuk suatu matriks kental seperti lem putih akibat pemekatan DNA, dan larutan buffer TE atau dH2O untuk merutkan DNA kromosom. Garam yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan menyebabkan DNA menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan)

dengan kutub negatif fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekulmolekul saling tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Murray 2000). Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Benang-benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar

setelah disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril. Adapun komposisi larutan lisis ialah tris HCL yang mengandung glukosa konsentrasi tinggi dan asam kuat serta EDTA. Berdasarkan tabel 1, sampel isolasi DNA hanya 1 sampel. A260 adalah Absorbansi DNA, sedangkan A280 adalah Absorbansi Protein, maka dari itu pengukuran digunakan kedua panjang gelombang tersebut. Pada perhitungan [DNA] yaitu dipakai A260 terkoreksi, karena perhitungan konsentrasi DNA hanya memerlukan absorbansi DNA, bukan absorbansi protein/kontaminan lain. Rasio A260
:

A280 merupakan gambaran tingkat kemurnian DNA. Adapun range Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan

kemurnian DNA yaitu 1,8 s.d. 2,0 (DNA murni) (Murray 2000)

senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh (Jusuf 2001). Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.

Simpulan Isolasi DNA kromosom dari umbi bawang adalah murni (bebas RNA dan Protein) karena masih mencakup range / nilai ambang batas kemurnian dengan rasio 0,852. Adapun konsenterasi DNA dalam kromosom umbi bawang merah yaitu 101,1075 g/mL.

Daftar Pustaka Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta. Jusuf, M. 2001. Genetika I. Jakarta : PT Sagung Seto Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Ed ke-3. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta : Penerbit Erlangga Jakarta. Terjemahan dari : Fundamentals of Biochemistry 3rd edition. Murray, Robert K. 2000. Biokimia Kedokteran. Terjemahan: Andry Hartono. Jakarta : Penerbit Erlangga Jakarta Yuwono T. 2009. Biologi Molekuler. Jakarta: Penerbit Erlangga Jakarta.