DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului

Rolul proteinelor: - surs de energie - surs de aminoacizi eseniali - meninerea sntii - component major al alimentelor - utliziat ca i ingredient - confer alimentelor proprieti speciale. 1.

Determinarea cantitativ a proteinelor - informaii nutriionale - aspect legal 2. Identificarea proteinelor - analize de expertiz - depistarea falsurilor

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Metode - chimice - fizice - fizico-chimice METODE CHIMICE - se bazeaz de determinarea coninutului de azot. - mai multe tipuri de azot n alimente

Nt = Na + No = Na + Nnep + Np
- anorganic : NO3-, NH4+ - organic : proteic i neproteic. (De regul speciile anorganice sunt solubile n ap putnd fi uor de ndeprtat din aliment prin simpla dizolvare n ap)

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR 1. METODA KJELDAHL - elaborat n 1883 de ctre Johann Kjeldahl (berar)

Principiu Alimentul este mineralizat n mediu acid puternic, azotul proteic fiind transformat n ion amoniu determinat ulterior prin titrare cu un acid tare. Metoda nu msoar direct coninutul de protein - factor de conversie. Factorul de conversie F=6,25 (Proporia de azot, in majoritatea proteinelor, este de aproximativ 16%). F variaz n funcie de secvena de aminoacizi specific fiecrei proteine : - cereale (proteine cu coninut ridicat n glutamin) F=5,7. - carne F=6,25 - lapte F= 6,38

- ou F=6,68.
- Aceasta presupune c proporia de azot neproteic este nesemnificativ astfel nct determinarea azotului s reprezinte doar coninutul total de proteine. - De regul se determin azotul total

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Analiza decurge n 3 etape: - mineralizarea/digestia - neutralizarea/distilarea

- titrarea

Mineralizarea/digestia - are loc la cald cu acid sulfuric cnd are loc reacia : aliment + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 (1) - reacia este nsoit de o degajare de SO2 i SO3, conform reaciilor: H2SO4 H2O + SO3 2SO3 2SO2 + O2 Amoniacul format n mediu acid nu este eliberat ca i NH3 gazos, deoarece este captat n soluie sub form de (NH4)2SO4 .

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Mineralizarea probei se face n majoritatea cazurilor cu H2SO4 i diferite adaosuri menite s faciliteze aciunea oxidant a acestuia (ap oxigenat). Alegerea H2SO4 nu este fcut ntmpltor, deoarece el beneficiaz de avantajul unui punct de fierbere superior, care permite nclzirea prelungit la temperaturi relativ nalte, fr pierderi importante de soluie. Pentru accelerarea procesului de mineralizare se adaug de obicei sruri ale metalelor grele cu aciune catalizant, cum ar fi Ag+ , Cu2+ , Se3+ , Hg2+ . Adaosul srurilor mercurice, creeaz ns inconvenientul formrii combinaiilor amidomercurice, ceea ce determin pierderi de NH3, ce trebuie ulterior surmontate prin adugarea Na2S2O3 (acesta determin distrugerea combinaiilor amidomercurice, n timpul distilrii amoniacului). Se mai adaug sruri ale metalelor alcaline, cum ar fi K2SO4 sau Na2SO4, n vederea creterii temperaturii de fierbere, respectiv creterea eficienei procesului de mineralizare. Mineraizarea se realizeaz n baloane speciale, Kjeldahl, cu gt lung, nclzite n pozitie nclinat fa de direcia flcrii i prevzute cu o mic plnie, care funcioneaz ca un refrigerent de aer, permind refluxarea permanent a acidului sulfuric, eventual evaporat.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR 1 - 5 g aliment, prob care conine cca. 0,03 - 0,04 g N se cntresc ntr-un balon Kjeldahl, se adaug 20 mL acid sulfuric concentrat.

nclzirea se realizeaz lent, pn la carbonizarea complet i innegrirea puternic a soluiei. Oxigenul rezultat oxideaz treptat substanele organice, fapt observat prin modificrile de culoare care apar n soluie. Culoarea neagr iniial se atenueaz i se modific treptat, ajungnd pn la decolorarea complet, sau la o slab nuan galben (dac exist n prob cantiti mari de fier), ceea ce indic terminarea procesului.
Dac proba conine mult zahr, spumeaz puternic la nceput, provocnd astfel debordarea amestecului i eventuale pierderi. Pentru evitarea acestui fenomen se utilizeaz fie adaosul a ctorva picturi de alcool octilic, fie introducerea ctorva bile de sticl, cu ajutorul crora spuma se sparge mecanic. Uneori spumarea este evitat dac se las proba cu acid peste noapte, nainte de nclzire.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR

Cnd exist cantiti mari de elemente ale grupei metalelor alcalinopmntoase, sulfaii acestora precipit provocnd pierderi prin coprecipitare. Operaia dureaz de obicei mult, n funcie de cantitatea i de natura substanei oxidate (mai ales n cazul probelor bogate n grsimi).

n cazul n care se urmrete determinarea azotului total trebuie remarcat faptul c n procesul de mineralizare nu se relizeaz trecerea n sruri de amoniu a combinaiilor azotate oxigenate cum ar fi, nitraii, nitriii sau a unor combinaii organice nitro, notrozo, nitril. Astfel se adaug la proba de analizat acid sulfuric conc rcit la ghea, acid salicilic i se agit bine balonul timp de 10 min. Se adaug apoi Na2SO4 anh, Na2S2O3 sau granule de Zn, compui cu caracter reductor. Se mineralizeaz apoi proba n mod obinuit.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Neutralizarea/distilarea Dup ce digestia s-a terminat (culoare alb-galbuie a soluiei), balonul de mineralizare este conectat la un balon colector, prin intermediul unui tub. Soluia din balonul de mineralizare este alcalinizat prin adiie de NaOH i supus nclzirii :

(NH4)2SO4 + 2 NaOH

2NH3 + 2H2O + Na2SO4

Amoniacul gazos format este captat n balonul de captare, ce conine o soluie de acid boric, de concentraie i volum riguros cunoscut. Amoniacul este reinut n soluie sub form de sare:

NH3 + H3BO3

NH4+ + H2BO3-

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Titrarea Coninutul de azot este estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu o soluie titrimetrica de acid silfuric sau clorhidric, n prezena unui indicatpr potrivit pentru evidenierea punctului final al titrrii.

NH4+ + H2BO3- + H+ + Cl-

H3BO3 + NH4+ + Cl-

Volumul soluiei de acid necesar la titrare este echivalent cu cantitatea de amoniac eliberat n etapa anterioar. n general alturi de proba de analizat se efectueaz i o prob blank pentru a putea fi luat n considerare orice cantitate de azot rezidual din reactivii utilizai pentru analiza.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Avantaje i dezavantaje Avantaje: Metoda Kjeldahl este utilizat pe plan internaional i este nc metoda standard de comparaie pentru alte metode de determinare a proteinelor. Faptul c poate fi aplicat pentru orice tip de protein, datrorit preciziei i reproductibilitii nalte ii confer poziia de lider ntre metodele de determinare a proteinelor. Dezavantaje: Nu d informaii despre coninutul de protein real, deoarece azotul din alimente nu provine numai de la proteine. Diferite proteine au factori de conversie diferii deoarece au secvene diferite de aminoacizi. Utilizarea att acidului sulfuric la temperaturi nalte ct i a srurilor cu rol catalitic ridic factorul de risc al analizei. Este o tehnic care necesit mult timp, mineralizarea necesitnd cel puin 2-3 ore.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR METODA DUMAS Este o tehnic automat instrumental, capabil s msoare rapid coninutul proteic. Se bazeaz pe metoda descris pentru prima dat de Dumas, acum un secol. Metoda concureaz cu metoda Kjeldahl ca metod standard pentru analiza proteinelor datorit rapiditii ei.

Principii generale O cantitate cunoscut de prob este ars la temperaturi mari (900 oC) n prezen de oxigen. n urma arderii are loc eliberarea de CO2, H2O i N2. CO2 i H2O sunt nlturate prin trecerea gazelor prin coloane speciale care le absorb. Coninutul de azot este apoi determinat prin cromatografie de gaze. Coloana are ca scop separarea azotului de CO2 i H2O rezidual, ca detector se utilizeaz detectorul de conductivitate termic. Instrumentul este calibrat prin analizarea unui material aflat n stare pur i cu un coninut binecunoscut de azot, cum ar fi EDTA ( 9.59%N). Astfel semnalul de la detector poate fi transformat n coninut de azot. Ca i n metoda Kjeldahl concentraia de azot determinat este transformat n coninut propteic utiliznd factorul de conversie specific.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR

Avantaje i dezavantaje Avantaje: Este mult mai rapid dect metoda Kjeldahl (sub 4 min/determinare). Nu necesit reactivi toxici, msurarea se poate face automat, este simplu de utilizat.

Dezavantaje: Cost per analiz mare, nu d o valoare adevrat a coninutului proteic deoarece este analizat azotul total din aliment. Deasemenea proteine diferite necesit factori de conversie diferiti. Metoda necesitnd cantiti mici de probe ceea ce face dificil etapa de obinere a unei probe reprezentative.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR

MSURAREA ABSORBIEI RADIAIEI

UV-ViZ: concentraia proteinelor poate fi determinat prin msurarea absorbiei radiaiei din domeniul UV-VIZ. IR: msurarea absorbanei n domeniu IR al spectrului poate fi utilizat pentru determinarea coninutului proteic din alimente. n mod natural proteinele absorb radiaia IR datorit vibraiilor caracteristice a gruprilor chimice specifice scheletului polipeptidic. Analizele prin absorbia n IR sunt utile n special pentru analizele on-line rapide. Sunt de asemenea avantajoase deoarece necesit o cantitate mic de prob i sunt nedistructive. Dejavantajul major l reprezint costul ridicat al aparaturii i calibrarea destul de laborioas. Rezonana magnetic nuclear: RMN poate fi utilizat la determinarea coninutului total proteic. Acesta este determinat prin msurarea ariei de sub picul corespunztor fraciei proteice din spectrul RMN.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR METODE SPECTROFOTOMETRICE UV-VIZ Aceste metode utilizeaz abilitatea proteinelor att n stare natural ct i n stare chimic sau fizic modificat de a absorbi/mprtia lumina din domeniul UV-VIZ a spectului electromagnetic. Principiul de baz a fiecrui astfel de test este similar. n primul rnd este elaborat o curb de calibrare absorban (turbiditate) n funcie de concentraia de protein, pe baza unor soluii proteice de concentraie cunoscut. Se msoar apoi absorbana (turbiditatea) soluiei de analizat la aceeai lungime de und i se determin concentraia pe baza curbei de calibrare. Diferenele principale dintre metode constau n grupele chimice care sunt responsabile de absorbie/mprtierea radiaiei, cum ar fi legtura peptidic, gruprile aromatIce din lantul lateral, gruprile bazice sau agregatele proteicie.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Msurarea direct la 280 nm Triptofanul i tirozina absorb puternic lumina UV la 280 nm. Coninutul de triptofan i tirozin din multe proteine este aproape constant, deci absorbana soluiilor proteice la 280 nm poate fi folosit pentru determinarea concentraiei proteice.

Avantajele acestei metode sunt: procedur simpl, nedistructiv, nu necesit reactivi speciali.
Dezavantajul major este acela c acizii nucleici absorb deasemenea puternic la 280 nm i pot astfel interfera n determinarea proteinelor dac acetia sunt n concentraie suficient de mare. Chiar i n aceast situaie au fost dezvoltate metode pentru a preveni aceste probleme, de exemplu msurarea absorbanei la dou lungimi de und diferite.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Metoda biuretului n condiii alcaline ionul cupric reacioneaz cu gruprile din legturile peptidice rezultnd un compus colorat violet-purpur. Dup amestecarea reactivului cu soluia proteic se las s se dezvolte culoarea timp de 15-30 min dup care se citete absorbana la 540 nm. Avantajul major al acestei tehnici este acela c nu exist interfereni provenii din chimicale care s absoar la aceast lungime de und iar tehnica este mai puin sensibil la tipul de protein deoarece utilizeaz absorbia implicnd legtura peptidic comun tuturor proteinelor dect pe gruprile laterale specifice. Reactivul biuret care conine toate chimicalele necesare analizei poate fi procurat din comer. Dezavantaje: sensibilitatea este mai mic dect metodele de absorbie direct n UV-VIZ.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Metoda Lowry Metoda Lowry combin reactivul biuret cu un alt reactiv - FolinCiocalteau (reactiv specific pentru grupele fenolice) care reacioneaz cu tirozina i triptofanul. n urma reaciei rezult un compus albastru a crui absorban poate fi citit n intervalul 500 - 750 nm n funcie de sensibilitatea necesar. Exist un mic pic n jur de 500 nm care poate fi utilizat n cazul concentraiilor mari de protein i un pic mai mare n jur de 750 nm care poate fi utilizat pentru determinarea concentraiilor mai mici de protein. Aceast metod este mai sensibil la concentraii mai mici de protein dect metoda biuretului.

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Metoda cu colorani O cantitate cunoscut i n exces de colorant anionic (ncrcat negativ) se adaug la soluia proteic a crui pH este ajustat astfel nct proteina s fie ncrcat pozitiv (mai mic dect punctul izoelectric). Proteina i colorantul formeaz un complex insolubil n ap datorit interaciunilor electrostatice. Colorantul anionic se leag de gruprile cationice a reziduurilor bazice ale aminoacizilor (histidin, arginin i lisin) i la gruprile amino terminale libere. Colorantul nelegat rmne n soluie i este determinat prin msurarea absorbanei, dup separarea complexului insolubil prin centrifugare. Cantitatea de protein din soluia analizat este proporional cu cantitatea de colorant legat care se calculeaz prin diferen.

Colorantlegat = colorantiniial - colorantliber

DETERMINAREA CANTITATIV A PROTEINELOR Avantaje i dezavantaje Avantaje: Tehnicile UV-VIZ sunt rapide i simple i sunt sensibile pentru concentraii proteice mici. Dezavantaje: Pentru majoritatea tenicilor UV-VIZ sunt necesare utilizarea soluiilor diluate i transparente, care nu conin substane contaminante care s absoarb sau s imprtie radiaia la aceeai lungime de und ca i proteina analizat. Necesitatea soluiilor transparente presupune faptul c majoritatea alimentelor trebuie s parcurg o serie de etape de pregtire a probei nainte de analiz, cum ar fi: omogenizare, extracie cu solveni, centrifugare, filtrare, operaii care pot fi laborioase i consumatoare de timp. n plus este extrem de dificil extracia cantitativ a proteinelor din cteva tipuri de alimente, mai ales dup ce acestea au fost procesate astfel proteinele devenind agregate sau legate covalent de alte substane. n plus absorbana depinde de tipul proteinei analizate proteine diferite avnd secvene diferite de aminoacizi.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor

Analiza alimentelor este interesat i de tipul proteinelor prezente, deoarece fiecare protein are caracteristicile nutriionale i fizicochimice unice. Tipul proteinei este de obicei determinat prin separarea i izolarea proteinei individuale din amestecul complex de proteine, astfel nct s poat fi identificat i caracterizat. Proteinele sunt separate pe baza diferenelor dintre proprietile fizicochimice, cum ar fi mrime, sarcin, solubilitate, stabilitaze termic i parametrii de adsorbie. Unul dintre factorii care trebuie luai n considerare n procesul de separare este posibilitatea alterrii structurii tridimensionale a proteinei native.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Exist metode de separare la scal macro pentru izolarea proteinelor care se gsesc n cantitate mare, n timp ce pentru proteinele aflate n cantiti mici sau sunt scumpe exist metode la scal micro.

Alegerea celei mai potrivite tehnici de separare depinde de o serie de factori, cum ar fi: cantitatea de prob disponibil, echipamentul disponibil, tipul de protein existent, costul de analiz, inclusiv motivul pentru care se efectueaz analiza. Cunoaterea apriori a efectelor condiiilor de mediu asupra structurii proteinei i a interaciunilor acesteia cu mediul este foarte util pentru alegerea celei mai potrivite tehnici de separare. n primul rnd pentru c ne ajut s determinm condiiile cele mai potrivite pentru izolarea unei anumite proteine dintr-un amestec (pH, for ionic, tip solvent, temperatur) i n al doilea rnd sunt importante condiiile care nu au efect negativ asupra structurii proteice (protejare).

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Metode bazate de diferena de solubilitate Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferenelor de solubilitate n soluii apoase. Solubilitatea unei molecule de protein este determinat de : - mrime, - form, - hidrofobicitate - sarcina electric. Proteinele pot fi selectiv precipitate sau solubilizate prin modificarea pHului, forei ionice, constantei dielectrice sau temperatura soluiei. Aceste variabile, reflectri ale faptului c proteinele sunt electrolii de mas molecular mare, pot fi utilizate la separarea amestecurilor de proteine, deoarece fiecare protein are compoziia sa proprie de aminoacizi, care determin comportarea ca electrolit. Tehnicile de separare sunt simplu de utilizat cnd sunt implicate cantiti mari de prob, deoarece ele sunt relativ rapide, ieftine i nu sunt influenate n mod particular de ctre ceilali componeni alimentari. Sunt des utilizate ca un prim pas n procedurile de seaprare deoarece majoritatea componenilor contaminani pot fi uor nlturai.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Salefierea proteinelor Srurile neutre au efecte puternice asupra solubilitii proteinelor globulare. n concentraii mici, srurile cresc solubilitatea proteinelor, fenomen cunoscut ca salting-in. Srurile ionilor divaleni MgCl2 i (NH4)2SO4 sunt mult mai eficiente n acest sens dect cele monovalente KCl, NaCl, NH4Cl. Capacitatea srurilor neutre de a influena solubilitatea proteinelor este n funcie de fora ionic, mrime care msoar att concentraia ct i numrul de sarcini electrice. Pe msur ce tria ionic continu s creasc solubilitata proteinelor ncepe s scad. La o trie ionic suficient de mare, o protein poate fi precipitat aproape complet din soluie, fenomen cunoscut sub numele de salting-out. Principiile fizico-chimice care stau la baza acestui proces sunt complexe. Unul din factorii care intervin este ndeprtarea apei de hidratare din molecula proteinei de ctre concentraia mare de sare, ceea ce duce la scderea solubilitii. Fiecare protein rspunde diferite la concentraia srurilor neutre.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Precipitarea izoelectric Solubilitatea celor mai multe proteine globulare este puternic influenat de pH-ul sistemului, indiferent de concentraia NaCl. De ambele pri ale pH-ului critic solubilitatea crete forte brusc. Aproape toate proteinele globulare au un minim de solubilitate, pH-ul corespunztor diferind de la o protein la alta. pH-ul la care o protein este cel mai puin solubil este pH-ul su izoelectric, definit ca pH-ul la care molecula nu are ncrcare electric i nu se deplaseaz n cmp electric. n aceste condiii nu sxist respingere electrostatic ntre molecule proteice nvecinate, care tind s se aglomereze i s precipite. La valori de pH deasupra sau sub pI toate moleculele de protein au ncrcare electric net de acela semn, deci ele se vor respinge prevenind aglomerarea, n agregate insolubile.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Deoarece proteinele au valori deferite ale pH-ului izoelectric, datorit coninutului lor diferit de aminoacizi cu grupri R ionizabile pot fi separate prin precipitare izoelectric.

Protein pH-izoelectric Pepsin 1 Ovalbumin 4.6 Albumin seric 4,9 -lactoglobulin 5,2

Protein 1- globulin Hemoglobin Mioglobin Ribonucleaz

pH-izoelectric 6,6 6,8 7 9,6

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Fracionarea cu solveni Solubilitatea proteinelor depinde de constanta dielectric a soluiei deoarece altereaz amplitudinea interaciunilor electrostatice dintre grupele cu sarcin. Pe msur ce constanta dielectric scade intensitatea interaciunilor electrostatice crete. Aceasta duce la scderea solubilitii proteinelor n soluie deoarece ele sunt mai puin ionizate, i astfel repulsiile electrostatice dintre ele nu sunt suficient de mari pentru a preveni agregarea. Constanta dielectric a soluiilor apoase poate fi sczut prin adugare de solveni organici solubili, cum ar fi etanol i aceton. Cantitatea de solvent organic necesar precipitrii depinde de tipul proteinei, i prin urmare aceasta poate fi separat prin precipitare de restul proteinelor. Cantiatea optim de solvent organic necesar precipitrii proteinei variaz ntre 5-60%. Operaia se realizeaz de obicei sub 0oC pentru a preveni denaturarea proteinelor prin creterea temperaturii la amestecarea solvetului organic cu apa.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor

Separarea proteinelor prin cromatografie de adsorbtie Cromatografia de adsorbie implic separarea compuilor prin adsorbia/desorbia selelctiv a compuilor pe suprafaa unui adsorbant reinut n interiorul unei coloane prin care proba i faza mobil trec. Separarea se bazeaz pe diferenele de afinitate a proteinelor fa de faza staionar. n funcie de tipul fazei staionare exist dou tipuri de mecanisme de separare care se pot aplica n cazul separrii proteinelor: - cromatografia prin schimb ionic - cromatografia de afinitate. Separarea si caracterizarea se poate realiza atat pe pe coloane deschise cat si inchise, de inalta performanta.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Cromatografia prin schimb ionic Cromatografia prin schimb ionic se bazeaz pe fenomenele reversibile de adsorbie/desorbie respectiv schimb ionic a ionilor din soluie i gruprile ionice ale unei matrici solide sau reea polimeric. Aceast tehnic este cea mai utilizat tehnic cromatografic pentru separarea proteinelor. Un sorbent capabil sa schimbe anionii proprii cu cei ai probei se numeste anionit. Faza mobil este format dintr-un electrolit avnd o anumit for ionic i un anunmit pH, astfel nct s favorizeze un numr maxim de legturi ntre faza staionar i proteina de interes. Proteinele contaminante trebuie s se lege mai puin puternic, astfel nct s treac mai repede prin coloan. Proteina de interes este apoi eluat cu o alt soluie tampon care s favorizeze desorbia.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Cromatografia de afinitate n cromatografia de afinitate, ca faz staionar se utilizeaz supori solizi de care se leag chimic-covalent un ligand. Ligandul este o molecul care prezint afinitate specific pentru o protein dat. Proba de analizat este trecut prin coloan, iar proteina de interes este reinut pe suprafaa sorbentului, n timp ce proteinele contaminante trec nereinute. Proteina de interes este apoi eluat cu cu o soluie tampon care favorizeaz desorbia. Aceast tehnic este cea mai eficient metod de separare a proteinelor individuale dintr-un amestec de proteine, dar este i cea mai scump metod, deoarece necesit coloane cu faze staionare specifice.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Separri bazate pe diferenele de mas Proteinele pot fi separate pe baza masei moleculare. Aceasta variaz ntre 10.000 i 1.000.000 daltoni. In practic, separarea depinde de raza Stokes a proteinei, mai degrab dect masa molecular. Raza Stokes reprezint raza medie pe care molecula proteic o are n soluie i depinde de structura ei tridimensional.

Dializa Dializa este folosit pentru separarea moleculelor din soluie. Se bazeaz pe utilizarea unor membrane semipermeabile care permit trecerea moleculelor mai mici dect o anumit mrime dat. Soluia proteic este plasat n tubul de dializ care este nchis i plasat ntr-un volum mare de ap sau tampon i care este agitat uor continuu. Moleculele mici trec prin pereii tubului iar cele de protein vor fi reinute n interiorul lui. Dializa este o metod lent, necesitnd pn la 12 ore. Este utilizat frecvent n laborator pentru nlturarea srurilor dup separarea prin salefiere.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor Ultrafiltrarea

Soluia proteic este plasat ntr-o celul ce conine o memdran semipermeabil i apoi este aplicat o presiune sau este supus centrifugrii. Moleculele mici i apa trec prin membran, moleculele de protein fiind reinute. Principiul de separare este similar dializei, dar datorit aplicrii presiunii separarea este mult mai rapid. Sunt disponibile membrane semipermeabile cu dimensiunile critice cuprinse ntre 500 i 300.000.

DETERMINAREA CALITATIV - separarea i caracterizarea proteinelor

Cromatografia prin excludere molecular Aceast tehnic cunoscut i sub numele de filtrare prin gel separ proteinele pe baza mrimii lor. Soluia proteic este introdus ntr-o coloan a crei umplutur este format dintr-un polimer reticulat (dextrin, agaroz). Moleculele mai mari dect porii polimerului sunt excluse i ies rapid din coloan. Moleculele mai mici pot intra n pori, deci viteza lor de deplasare prin coloan este retardat. Astfel moleculele sunt eluate din coloan n ordinea scderii dimensiunilor. Exist faze staionare care prezint mrimi diferite ale porilor astfel nct permit seaprarea proteinelor cu diferite mase moleculare. Fabricantul acestor faze staionare dau informaii asupra domeniului de greuti moleculare pentru care acestea sunt cele mai potrivite. Masa molecular a proteinelor necunoscute poate fi determinat prin compararea volumului de eluie cu cel al unor molecule proteice cu masa cunoscut: reprezentare grafic a volumunlui de eluie funcie de logaritmul masei moleculare trebuie s fie o linie dreapt. O problem asociat acestei metode este c masa molecular nu este direct corelat cu raza Stokes pentru diferite forme ale proteinelor.

ANALIZA AMINOACIZILOR
Analiza aminoacizilor depinde de muli factori: - matricea probei, - concentraia de aminoacizi, - sensibilitatea ceruta, - tipul analizei. In urma analizei se determina: - profil de aminoacizi liberi - profil total de aminoacizi (dup hidroliz). ETAPE 1. Pregtirea probei Tratamentul probelor difer, depinznd de scopul analizei. - Pentru determinarea aminoacizilor liberi este necesara obinerea unui extract, purificare si derivatizare nainte de determinare. - Pentru determinarea coninutului total de aminoacizi - etapa de hidroliz. Extracia - se poate realiza in cazul matricilor insolubile (peste, carne, cereale, etc.) si de obicei se realizeaz prin omogenizarea probei mrunite sau mcinate ntr-un solvent potrivit. Exist aparate specializate (Polytron Stomacher) sau dispozitive mai simple care presupun agitarea cu sau fr nclzire. Aminoacizii sunt solubili n ap, cisteina i tirozina avnd solubilitatea mai mic. De regula se utilizeaz ap sau o soluii de acid sulfosalicilic 4%, acid tricloracetic 5%, HCl 0,1 N. Se pot utiliza de asemenea i soluii alcoolice (etanol, metanol) care prezint avantajul de a nu extrage proteinele (nu mai este necesar purificarea ulterioara a extractului). Solidele solubile necesit doar dizolvare preliminar. In cazul probelor lichide nu se mai pune n discuie extracia.

ANALIZA AMINOACIZILOR
2. Purificarea probei - izolarea aminoacizilor de ali compui extrai (proteine, carbohidrai, grsimi) - este necesar pentru a evita probleme poteniale cum ar fi colmatarea coloanei analitice i/sau interaciunea cu ali compui extrai cum ar fi proteinele. Prezena grsimilor nu ridic probleme pentru extracie dar trebuie ndeprtate pentru a preveni interferenele sau deprecierea coloanei. Grsimile sunt extrase din probe solide cu un amestec cloroform : acetona (1:3), sau extractul poate fi splat succesiv cu acetat de etil i dietileter. Extractul obinut este centrifugat la rece (4 C) iar supernatantul filtrat prin vat de sticl cnd se rein materiile grase de pe suprafaa supernatantului. Separarea de proteine i polipeptide - deproteinizare. - chimic se realizeaz cu soluii concentrate de acizi tari, acid sulfosalicilic, percloric, trifluoracetic, picric, fosfomolibdenic, soluii concentrate saline, solveni organici (metanol, etanol, acetonitril). n aceste condiii proteinele precipita prin denaturare n timp ce aminoacizii rmn n soluie. - fizic presupune centrifugarea prin filtre membrane limitative (CUT-OFF) care permit trecerea aminoacizilor n timp ce compuii cu masa moleculara mare sunt reinui. Diferena dintre aceste metode consta in: - diferena ntre masa moleculara a moleculelor excluse, - grad de recuperare a aminoacizilor, - compatibilitatea cu condiiile de derivatizare i cele necesare separrii analitice.

ANALIZA AMINOACIZILOR
Exemple: - Acidul fosfomolibdenic este foarte eficient dar produce pierderi de aminoacizi cu caracter acid si/sau bazic n special lizin. Acizii tari scad foarte mult valoarea pH-ului n contextul n care derivatizarea se realizeaz n medii bazice pentru analizele prin derivatizare precoloan. ndeprtarea acidului se realizeaz prin evaporare i/sau ajustarea pH-ului. n cazul n care analiza se realizeaz prin cromatografie de schimb ionic i derivatizare postcoloan nu mai apar probleme. Chiar dac acidul sulfosalicilic este cel mai utilizat agent de deproteinizare s-au constatat unele interferene i grade sczute de recuperare. - Utilizarea solvenilor organici prin amestecarea a 2-3 volume solvent organic cu un volum extract are rezultate foarte bune, gradul de recuperare fiind aproape de 100%. Prezint avantajul c este uor de ndeprtat prin evaporare. - Soluiile saline concentrate nu sunt utilizate la deproteinizare deoarece interfer n procesul de derivatizare i hidroliz. Purificarea probelor utiliznd rini schimbtoare de cationi (cationii) rein aminoacizii din medii acide n timp ce ali interfereni cum ar fi carbohidraii trec prin coloana nefiind reinui. Ulterior aminoacizii sunt desorbii cu o baz volatil care apoi este nlturat prin evaporare. n cazul extraciei pe faz solid cu C18 compuii cum ar fi grsimile, proteinele i peptidele sunt reinute, n timp ce compuii polari i aminoacizii trec nereinui. Metoda nu este foarte bun deoarece aminoacizii hidrofobi se pot reine (grade mici de recuperare) iar compuii hidrofili nu se rein, impurificnd extractul.

ANALIZA AMINOACIZILOR
Hidroliza 1. Hidroliza acid - proba este tratat cu HCl 6N la 110C timp de 20-96 h sau 145C timp de 4 h. n aceste condiii dure poate avea loc degradarea unor aminoacizi. Digestia se realizeaz n recipiente nchise n atmosfer inert de azot, pentru a minimiza degradrile. Hidroliza poate fi realizat att cu metode n faz lichid ct i gazoas. n metodele n faz lichid HCl este n contact direct cu proba, fiind potrivit pentru probe complexe (cereale etc.). Hidrolizatul contine multi interferenti, de aceea analiza necesita metode cromatografice prin schimb ionic i derivatizare postcoloan. Digestia n faz gazoas reduce zgomotul de fond. n cazul cantitilor limitate de probe se utilizeaz hidroliza n faz de vapori. n aceast metod n tubul de hidroliz este plasat proba i apoi totul ntr-un vas mare ce conine HCl. Atmosfera oxidant (oxigen) este nlocuit cu azot inert. n urma nclzirii numai vaporii de HCl vin n contact cu proba, fiind astfel exclus contaminarea cu compui nevolatili. Aceast metod este mai potrivit pentru determinrile cu derivatizare precoloan. Hidroliza poate fi mbuntit prin optimizarea temperaturii i a timpului de hidroliza, sau prin adugarea de compui protectori ai aminoacizi labili (tirosin, serin, treonin, metionin, triptofan-foarte sensibil n probele cu coninut ridicat de carbohidrai) cum ar fi: fenol, Na2SO3, triptamin, mercaptoetanol, acid mercaptoetenoic, acid tio- i ditiodipropionic. De asemenea HCl poate fi nlocuit cu acid metansulfonic 4 N. Se utilizeaz agenii de alchilare pentru a stabiliza aminoacidul (cisteina) rezultat n urma hidrolizei: acid brompropionic, acid iodoacetic bromopropilamina, vinilpiridina. Glutamina i asparagina sunt dezaminate n timpul hidrolizei i sunt codeterminate cu acidul glutamic i aspartic. O alt problema de care trebuie inut cont este rmnerea intact a unor peptide chiar dup 24 de ore de hidroliz. Aceste polipeptide sunt formate n principal de ctre aminoacizii hidrofobi cum ar fi valina, leucina, isoleucina, i fenilalanina. Aceste peptide sunt mult mai rezistente fa de hidroliz i necesit o perioad mai lung. Dar aceste condiii ar duce la degradarea altor aminoacizi.

ANALIZA AMINOACIZILOR
Aa cum se observ nu exist nici un set de condiii experimentale care s ndeplineasc toate condiiile metodele utilizate reprezint un compromis pentru obinerea unui numr ct mai mare de aminoacizi. Se realizeaz o hidroliza la 110 C 22-24 h, de preferat n stare de vapori, n prezen de ageni protectivi (fenol). Pentru analiza triptofanului i cisteinei sunt necesare proceduri speciale. 2. Hidroliza alcalin se realizeaza cu soluii 4,2 M de NaOH, KOH, LiOH sau Ba(OH)2 cu sau fr adiie de 1% (m/v) tioglicol timp de 18 h la 110 0C. 3. Hidroliza enzimatic - se realizeaz cu enzime proteolitice cum ar fi tripsina, chimotripsina, carboxipeptidaz, papain, thermolizin. Trebuie sa se tina cont de activitatea specific a enzimei utilizate.

ANALIZA AMINOACIZILOR
DETERMINAREA CANTITATII TOTALE DE AMINOACIZI Cea mai simpla sarcina este determinarea continutului total de aminoacizi, fara a face discriminare unii de altii. Sunt metode spectrofotometrice, care se bazeaza pe reactia gruparilor -aminice cu reactivi: - o-ftaldialdehida, - ninhidrina - acid trinitro-benzen-sulfonic. Exista o corelatie liniara intre intensitatea absorbtiei/emisiei si concentratia gruparilor aminice. Se aplica pentru: - obtinerea indexului protelitic, - controlul gradului de hidroliza a proteinelor alimentare, - controlul procesului de eliminare a proteinelor din vin, - controlul proceselor de fabricatie (branza), - dezvoltarea aromei pe baza aminoacizilor care in urma transformarilor genereaza compusi ce comfera aroma, etc.

ANALIZA AMINOACIZILOR
METODE DE DETERMINARE CARE IMPLICA TEHNICI DE SEPARARE Analiza aminoacizilor individuali necesit o separare prealabil mai puin cazul in care se utilizeaz metode selective de determinare. Separarea aminoacizilor din amestec necesita tehnici de separare foarte eficiente cum ar fi cromatografia (HPLC, CG) sau electroforeza capilara. Alegerea tehnicii de analiza depinde in principal de echipamentul disponibil i de preferinele personalului, deoarece fiecare metoda prezint avantaje si dezavantaje. A) Cromatografia de lichide 1. Metode prin schimb cationic - se bazeaz pe faptul ca aminoacizii au sarcin electric. Ca faz staionar se utilizeaz polistirenul sulfonat cu soluii apoase tampon de citrat de sodiu ca faze mobile. Elutia se realizeaz cu gradient, creterea att a pH-ului ct si a concentraiei. In aceste condiii aminoacizii cu caracterul cel mai acid vor iei primii iar cei cu doua sau mai multe grupri amino primare vor fi eluati mai trziu. Dup separare aminoacizii sunt derivatizai pentru detecie fie in VIZ fie in fluorescen. Se pot utiliza de asemenea si detectori electrochimici. Avantajul metodei este ca da rezultate foarte precise pentru toate tipurile de probe cunoscute. Este considerat metoda de referint. Fiecare metod noua trebuie sa se raporteze la aceast metod. Dezavantajul major const in costul ridicat al aparaturii, a fazelor mobile complexe i a timpului lung de analiz.

ANALIZA AMINOACIZILOR
2. Crompatografie de lichide cu faz invers (RP-HPLC) - este foarte utilizata deoarece poate fi folosita i pentru alte aplicaii. n acest caz aminoacizii trebuie derivatizai nainte de separare pentru ai transforma n molecule hidrofobe, astfel nct s poat participa la procese de repartiie ntre faza stationar i cea mobil. Totodat derivatizarea va permite o detectie mai bun. - Faza mobil trebuie s dizolve proba pentru a fi transparent pentru sistemul de detectie. Faza mobil este o combinaie de tampon apos cu un solvent organic ca metanol, acetonitril, tetrahidrofuran. Tamponul este format din soluii cel mult 100mM de acetat sau fosfat. De regul eluia se realizeaz cu gradient. - Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel chimic modificate cu grupri alchil, n principal C18. Selectivitatea obinut cu coloane provenite de la productori diferiti este diferit datorit metodelor diferite de atasare a lantului alchil de suprafata suportului de silicagel, de densitatea acoperirii care comfera un grad mai mare sau mai mic de hidrofobicitate. Deasemenea gruprile silanol nereactionate pot interaciona cu moleculele aminoacidului ducnd la aparitia picurilor cu cozi. Pentru a preveni acest inconvenient se poaze aduga trietilamin.

Analiza aminoacizilor
Derivatizarea - are ca scop mbuntirea :
- separarii,

- deteciei.
Eficiena agentului de derivatizare este evaluat pe baza urmtoarelor aspecte: - s reacioneze att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari, - s dea un singur derivat cu fiecare aninoacid, - s reacioneze cantitativ i reproductibil, - produsul rezultat s fie stabil, - s nu existe interferene ale produilor secundari sau a excesului de agent de derivatizare, - s necesite condiii simple i blnde de reacie, - s prezinte posibilitate de automatizare.

Analiza aminoacizilor
DERIVATIZARE N VEDEREA MBUNTIRII DETECIEI - sensibilitatea i selectivitatea deteciei sunt influentate de proprietile spectrale i electrochimice a derivailor obinui. Alegerea agentului de derivatizare este fosrte important.

Detecie spectroscopic - se bazeaza pe ataarea de molecula aminoacidului grupri care confer moleculei derivate proprieti absorbante (UV/Viz) sau fluorescente. Derivatizarea se poate realiza naintea separrii - derivatizare precoloan sau dup separare - derivatizare postcoloan. Derivatizarea precoloan att on-line ct i off-line iar cea postcoloan se realizeaz on-line.

1. Derivatizarea precoloan: pe lng mbuntirea selectivitii i sensibilitii n urma

derivatizrii moleculele de aminoacid devin mai hidrofobe, fcndu-le potrivite i pentru separarea prin cromatografie de lichide pe faz invers RP18. Ca reactivi de derivatizare se utilizeaz: a. Fenil-iso-tiocianat reacioneaz att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari, formnd derivatul feniltiocarbamil, detectabil n UV la 245 nm. Derivatul rezist la temperatura camerei 1 zi i o durat mai lung de timp n frigider, mai ales n absenta apei. Prepararea probei este laborioasa, necesit mediu bazic (trietilamina, pH 10,5) i include cteva etape de uscare, ultima etap fiind cea de nlturare a excesului de reactiv, care poate distruge coloana. Derivatul apare n cel mult 10 min, deci un timp de reacie de 20 de min este suficient pentru reacia total. Compoziia reactivului de derivatizare este esenial pentru determinarea acidului glutamic i aspartic. Prezena cationilor mono i bivaleni (provenit din sticlrie n timpul hidrolizei) i a srurilor (NaCl) pot cauza insolubilizarea derivailor acidului aspartic i glutamic. Pentru ceilali aminoacizi concentraia NaCl nu prezint importan C6H5-N=C=S + H2N-HCR-COOH C6H5-NH-CS-NH-HCR-COOH

Analiza aminoacizilor
b. Clorura de 4-dimetil-aminobenzen-4-sulfonil (Dabsyl-Cl sau DBS) - detecie n domeniul vizibil la 448-468 nm. Lungimea de unda mare de absorbie face ca linia de baz a cromatogramei s fie stabil pentru multe sisteme de solveni. Limita de detecie n domeniul picomolilor. Derivaii sunt foarte stabili (1 sptmn) i pot fi formai att de aminioacizii primari ct i cei secundari. Timpul de reacie este de aprox. 15 min la 70 C, are loc n mediu bazic cu exces de reactiv. Eficiena reaciei depinde foarte mult de matrice i variaz funcie de tipul aminoacidului i prezena clorurilor n concentraie mare.
O HN
2

R
2

N N

S Cl + H N CH O -HCl COOH

O H2N N N S O

R HN CH COOH

Analiza aminoacizilor
c. Clorura de 1-dimetilamino-naftalen-5-sulfonil (Dansyl-Cl) - este mult folosit pentru determinarea azotului terminal din proteine i peptide. Reacioneaz cu aminoacizii primari i secundari dnd un derivat puternic fluorescent (detecie prin excitare la 350 nm i msurarea emisiei la 510 nm sau detecie la 250 nm). Derivatul este stabil 1 zi sau 7 zile la ntuneric i la 40 C. Derivatizarea este simpl, necesit mediu bazic pH-9,5 timp de reacie 1 h la temperatura camerei la ntuneric / 15 min la 60C sau 2 min la 100C. Poate forma derivai multiplii cu histidina, lisina i tirosina, deci condiiile de reacie trebuie optimizate i atent controlate.

N(CH3)2 R + SO Cl
2

N(CH3)2 H N CH
2

COOH

-HCl SO
2

R NH CH COOH

Analiza aminoacizilor
d. 5-5'-ditio-bis(nitrobenzoic acid) (DTNB) - utilizat pentru aminoacizii cu sulf
HOOC HOOC ON
2

HOOC +

S S + HS R O2N S S R

O2N HOOC

ON
2

S H

e. 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) - da derivai stabili att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari, lungimea de excitare la 470 nm i cea de emisie 530 nm. Timp de reacie 1 min la 60 0C f. 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) - se utilizeaz la determinarea cantitativ a tiolilor i aminelor reacioneaz cu cisteina in mediu acid dnd un produs verde cu maximul de absorbie la 410 nm.

Analiza aminoacizilor
g. 9-fluorenilmetil-cloroformate (F-MOC) - d derivai fluorescenti atat cu aminele primare cat si cu cele secundare, lungimea de und de excitare 265nm, emisie 315 nm. Dezavantajul cel mai mare este ca reactivul de derivatizare este fluorescent i poate interfera in determinare. Este extras nainte de analiz. Reactioneaza cu amine puternic hidrofobe rezultnd compui cu timp de retenie mare. Timp de reacie 45-90s fara incalzire.

O O C Cl +

R H2N CH COOH - HCl O C

O NH

R CH COOH

h. Aldehida o-ftalica (o-phthaldialdehyde OPA) reactioneaza cu aminoacizii primari in prezenta mercaptanului pentru a da un compus cu fluorescenta ridicata. Fluorescenta este msurata la 455nm sau 470 nm dup excitare la 230 respectiv 330 nm. Reactivul in sine nu este fluorescent. Derivaii pot fi detectai si in absorbie la 338 nm. Tipul mercaptanului utilizat influenteaza stabilitatea selectivitatea cromatografica si intensitatea fluorescentei. Dintre cei mai utilizati: 2-mercaptoetanol, etantiol, si acidul 3-mercaptopropionic. Derivatizarea este rapida (1-3 min) la temperatura camerei si in mediu alcalin (tampon pH=9,5). Dezavantajul major este ca aceti derivai nu sunt stabili, problema fiind parial rezolvata prin controlarea stricta a timpului dintre etapa de derivatizare si cea de injectie. Nu reactioneaza cu aminele secundare. Acest dezavantaj poate fi surmontat prin transformarea aminelor secundare in amine primare prin oxidare cu hipoclorit sau cloramina nainte de derivatizare.

Analiza aminoacizilor
2. Derivatizarea postcoloan - implic separarea aminoacizilor liberi prin cromatografie de
lichide, introducerea n efluent a agentului de derivatizare potrivit, amestecarea i trimiterea lor cu ajutorul unei pompe n camera de reacie i n final pomparea derivatului obinut n detector. Principalul dezavantaj al acestui tip de derivatizare este c necesit echipament adiional: o pomp pentru introducerea i amestecarea agentului de derivatizare i eventual un dispozitiv de nclzire. Un alt dezavantaj este lrgirea picului la baz produs de ctre volumul mort introdus dup coloan. Ca i reactivi de derivatizare se utilizeaz: ninhidrina, fluorescamina i aldehida o-ftalic. a. fluorescamina nu este fluorescenta, derivatul se masoara la 475 excitare la 390nm. Un dezavantaj major este acela c reacia are loc n mediu bazic, n contextul n care separarea prin schimb ionic are loc n mediu acid. Aceasta face necesar adaugarea unei pompe suplimentare pentru a introduce un tampon bazic nainte de a reactia cu fluorescaina. Se folosete numai n cazul derivatizrilor speciale.

R R HC NH2 COOH O + O O O O HOOC C H N O OH OH

Analiza aminoacizilor
b. ninhidrina - reacioneaz cu toi cei 20 de aminoacizi dnd compui colorai fr a produce compui secundari sau mai muli compui de derivatizare. Derivaii provenii de la amine primare dau un produs albastru cu maximul de absorbie la 570 nm, iar cei provenii de la amine secundare dau un compus brun cu maximul de absorbie n jur de 440 nm.
O OH + OH O O NH2 O O NH O + OH O O OH
2 2

O R H N CH COOH O R N CH COOH

O + R C H + CO2

O N O

2H O 2

Analiza aminoacizilor
DERIVATIZARI IN VEDEREA OBTINERII UNEI SEPRARI MAI BUNE Scopul acestor derivatizari este de a obtine compusi volatili si termostabili in vederea analizei GC. Derivatizarea se realizeaza in doua etape: - esterificare cu alcooli acidulati cu HCl 3M, de exemplu: metanol, i-propanol, ibutanol, n-propanol, n-butanol si alcool i-amilic (gruparea COOH). - N-acilare cu o anhidrida acida in mediu anhidru : anhidrida trifluoracetica, anhidrida pentafluoropropionica, N-tert(butildimetilsilil)trifluoracetamida (gruparea NH2).