Anda di halaman 1dari 3

ZytoFast PLUS CISH Implementation Kit AP-Permanent Red Kit:

Alat & Bahan : Alat Sarung tangan Waterbath Hot plate Hybridization oven Humidity chamber Staining jars (50-80ml) Pipet (10l; 1000l) Tip (10l; 1000l) Coverslip (22x22mm, 24x32mm) Mikroskop cahaya Timer Cara kerja: Preparatory steps a. Heat Pretreatment Solution EDTA (PT2): Panaskan dengan water bath suhu 95OC dalam staining jar tertutup b. 1x Wash Buffer TBS: Encerkan 1 bag. 20x Wash Buffer TBS (WB5) dengan 19 bag. Akuades. Dapat bertahan sampai 1 minggu dengan penyimpanan pada suhu 2-8OC Bahan Sampel FFPE (ukuran 3-5m) Ethanol 100%, denaturated Xylene 100% Digoxigenin-labeled ZytoFast CISH Probe Akuades

*Hybridization oven, hot plate & humidity chamber bisa diganti dengan hybridgear

Siapkan 1x wash buffer TBS dalam staining jar, kemudian panaskan dalam water bath suhu 55OC c. Sebelum digunakan, tempatkan ZytoFast DNA (+) control probe (PF23), ZytoFast DNA (-) control probe (PF24), ZytoFast RNA (+) control probe (PF32) dan Zytofast RA (-) control probe (PF33) pada suhu hibridisasi d. Tempatkan pada suhu ruang sebelum Pepsin solution (ES1), Mouse-anti-DIG (AB1), Anti-mouse-HRP-polymer (AB2), Nuclear blue solution (CS2) dan Mounting solution (alcoholic) (MT4) digunakan. e. Permanent Red Solution: Tuangkan 16l Permanent Red Solution A (SB8a) ke dalam graduated cup, kemudian tambahkan Permanent Red Solution B (SB8b) sampai 1ml dan dihomogenkan Pretreatment (Dewax/Proteolysis) Inkubasi slide pada suhu suhu 70OC selama 10 menit (hot plate) Inkubasi pada xylene 100% 2x5 menit Inkubasi pada ethanol 100% 3x3 menit dan keringkan. Teteskan Pepsin Solution (ES1) pada sampel dan inkubasi di suhu 37OC pada humidity chamber selama 10-20 menit e. Celupkan slide dalam akuades f. Panaskan Heat pretreatment solution EDTA (PT2) dengan water bath sampai suhu 95OC dalam staining jar tertutup. Letakan slide dalam Heat pretreatment solution EDTA (PT2) dan inkubasi 15 menit g. Celupkan slide dalam akuades dan keringkan a. b. c. d. Denaturation & Hybridization a. Vortex ZytoFast CISH probe, kemudian pipetkan 10l pada masing-masing sampel b. Tutup dengan coverslip, hindari terbentuknya gelembung, kemudian seal dengan rubber cement c. Denaturasi slide pada suhu 75OC selama 5 menit dengan hot plate d. Pindahkan slide pada humidity chamber dan hibridisasi selama 60 menit 37OC untuk DNA-targeting probes 55OC untuk RNA-targeting probes Penting: jaga kelembaban sampel selama proses hibridisasi Post-Hybridization & Detection a. Hilangkan rubber cement dengan hati-hati, kemudian lepas coverslip dengan mencelupkan slide pada 1x Wash buffer TBS b. Cuci slide pada 1x Wash buffer TBS pada suhu 55OC selama 5 menit Tahap ini tidak disarankan untuk dilakukab pada penggunaan ZytoFast RNA (+) control probe (PF32) karena dapat menurunkan intensitas signal c. Cuci dengan 1x Wash buffer TBS selama 5 menit pada suhu ruang

d. Teteskan Rabbit-anti-DIG (AB11) 3-4 tetes pada setiap slide dan inkubasi selama 30 menit suhu 37OC pada humidity chamber e. Cuci slide dengan 1x Wash buffer TBS selama 3x1 menit f. Teteskan Anti-rabbit-HRP-polymer (AB12) 3-4 tetes pada setiap slide dan inkubasi selama 30 menit suhu 37OC pada humidity chamber g. Cuci slide dengan 1x Wash buffer TBS selama 3x1 menit Pada tahap pencucian, siapkan Permanent red solution dengan menambahkan Permanent red solution B (SB1b) 1ml kemudian tambahkan 1 tetes Permanent red solution A (SB1a). h. Teteskan Permanent red solution 3-4 tetes pada setiap slide dan inkubasi 15-30 menit di suhu 37OC. Sangat direkomendasikan untuk melihat perubahan warna setiap 5-10 menit dengan bantuan mikroskop i. Cuci slide dengan akuades selama 3x1 menit j. Teteskan counterstain pada sampel (Mayers hematoxylin solution, CS1) selama 10-30 detik k. Cuci slide selama 2 menit pada air mengalir l. Dehidrasi slide 3x ethanol 100%, masing-masing 30 detik m. Inkubasi pada xylene 2x30 detik n. Tutup slide dengan coverslip (22x22mm, 24x32mm) menggunakan Mounting solution (alcoholic) (MT4) dan keringanginkan selama 30 menit o. Evaluasi hasil menggunakan mikroskop cahaya Interpretation of Result