Universit Paris 12 IUP SIAL Mlle ROUX

21/11/03 NOVELLO Clia TAP Julien

TP de microbiologie : RECHERCHE SALMONELLA

SOMMAIRE

INTRODUCTION ........................................................................3 I.ENRICHISSEMENT ET SELECTION ......................................4

A.DESCRIPTION DES MILIEUX UTILISES ............................................................................................................... 4 1.Le diluant Eau Peptone Tamponne ......................................................................................................... 4 2.Bouillon de Rappaport ............................................................................................................................... 4 3.Bouillon au slnite .................................................................................................................................... 4 B.MISE EN SOLUTION DE LA FLORE BACTERIENNE : PRE-ENRICHISSEMENT......................................................... 4 C.ENRICHISSEMENT SELECTIF ............................................................................................................................. 5

II.ISOLEMENT............................................................................5
A.DESCRIPTION DES MILIEUX UTILISES ............................................................................................................... 5 1.Kristensen (BGA)........................................................................................................................................ 5 2.Rambach ............................................................................................................................................... 5 3.Glose Hektoen........................................................................................................................................... 6 B.DISCUSSION DE LISOLATION........................................................................................................................... 6

III.IDENTIFICATION...................................................................6
A.GALERIE DIDENTIFICATION ............................................................................................................................ 6 1.Description du milieu Hajna-Kliger........................................................................................................... 6 2.Prparation du test. .................................................................................................................................... 7 3.Rsultats. ............................................................................................................................................... 7 B.LE TEST DU PHAGE........................................................................................................................................... 7 1.Descriptions des milieux utilises............................................................................................................... 7 2.Description et prparation du test.............................................................................................................. 7 3.Rsultats ............................................................................................................................................... 8 C.SEROLOGIE .................................................................................................................................................... 8 1.Dfinitions ............................................................................................................................................... 8 2.Prparation du test ..................................................................................................................................... 8

CONCLUSION ...........................................................................9 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................9

Introduction
Dcouverte en 1880 par Eberth, les Salmonella sont des entrobactries msophiles mobiles Gram - dont les caractres essentiels sont de ne pas fermenter le lactose et de ne pas produire d'urase. Les Salmonella sont des parasites de l'homme, des mammifres (rongeurs), des oiseaux (volailles) et des animaux sang froid (reptiles). Elles sont responsables, aprs pntration par voie orale, de nombreuses infections (salmonelloses), notamment des fivres typhode et paratyphodes, des gastro-entrites et des toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Le principal mode de contamination chez l'homme est l'ingestion partir de l'eau (S.typhi surtout), des aliments (ex. produits laitiers, oeufs, viande) ou d'animaux familiers porteurs (tortues). Les travaux rcents de taxonomie, en particulier par hybridation de l'ADN, ont permis de conclure que le genre Salmonella ne comportait qu'une seule espce, Salmonella enterica. Cette espce comprend 7 sous-espces diffrencies par leurs biotypes. Les sous-espces sont subdivises en prs de 2 000 srovars sur la base de leurs antignes O, H et de capsule. Les srovars taient auparavant considrs comme des espces distinctes. La presque totalit (99,8%) des souches responsables d'infestations humaines appartiennent une sous- espce galement dnomme enterica. Le but de ce TP est deffectuer une recherche de salmonella dans un plat cuisine dorigine animale : Le hachis Parmentier. En effet celui-ci permet la croissance de salmonelle avec un pH proche de la neutralit et un riche apport nutritifs (source de carbone, dazote et de facteurs de croissances). La norme stipule une absence totale de salmonelle dans 25g daliment. La recherche de salmonelle se ralise en trois tapes : Un enrichissement du milieu permettant la croissance slective de salmonella, Un isolement sur milieu spcifique permettant de mettre en vidence les caractres cataboliques de Salmonella, Une identification par une galerie de tests biochimiques.

I. Enrichissement et slection
A. Description des milieux utiliss
1. Le diluant Eau Peptone Tamponne
Leau peptone est un milieu liquide qui permet la croissance des bactries sans exigences particulires. Les peptones trypsiques sont un apport en azote. [1]

2. Bouillon de Rappaport
Le milieu, dcrit initialement par Rappaport, permet lenrichissement des Salmonelles. Il reprsente un compromis entre le dveloppement optimal des Salmonelles et linhibition de la flore contaminante. Le bouillon Rappaport est plus slectif que les bouillons denrichissement habituellement utiliss grce la prsence de : Chlorure de magnsium une concentration de 30 g/L, qui ralentit la croissance des germes autres que les Salmonelles, Vert malachite, qui inhibe la culture de Salmonella typhi et des Shigella et qui ralentit aussi la croissance des germes autres que les Salmonelles, tampon phosphate (abaissement du pH 5,5). Lutilisation en parallle de bouillon slnite et de bouillon Rappaport est recommande pour les prlvements contamins par Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis et par dautres srotypes de Salmonelles. [1]

3. Bouillon au slnite
Le bouillon slnite est utilis pour lenrichissement slectif des salmonelles dans les produits alimentaires[1]. Ce bouillon contient : Des tryptones : source azot Du lactoses* : source de carbone (*Salmonella est lactose -) Du slnite : pour inhiber la croissance des bactries coliformes et des entrocoques tout en slectionnant Salmonella et Proteus. Du phosphate disodique : pour contribuer maintenir le pH de 7 et rduire la toxicit du slnite pour augmenter la capacit de rcupration du milieu.

B. Mise en solution enrichissement

de

la

flore

bactrienne :

Pr-

La prparation de la suspension mre seffectue le plus souvent laide deau peptone tamponne (E.P.T.) : En milieu aseptis, sous hotte flux laminaire, on pse sur une balance tare 10g de hachis Parmentier dans un sac stomacher, On verse ensuite 90mL deau peptone tamponne (E.P.T.) dans le sac stomacher, Le sac scell est plac dans lappareil stomacher pour effectuer ltape de broyage. Cette tape permet de faire passer les microorganismes en solution. La solution ainsi obtenue est verse prcautionneusement dans un flacon strile qui sera mis incuber ltuve 37C pendant 24 heures. Cette phase vise permettre aux bactries lses (ou stresses) de rcuprer leur stabilit.

C. Enrichissement slectif
Aprs ltape de prenrichissement on repique un volume variable du milieu de prenrichissement, dans les milieux slectifs suivant : Bouillon slectif Bouillon au slnite Bouillon de rappaport Volume repiquer 1 mL* 0.1mL* Incubation 24h/37C 24h/42C

*pour les besoins du TP les volumes ont t diviss par deux car ce sont des volumes de 5ml de bouillons qui ont t ensemenc. Ltape denrichissement slectif permet la croissance et la slection des bactries du genre salmonella pour pouvoir tre isoler par la suite.

II. Isolement
Nous allons donc ensemencer les milieu BGA, Rambach, et hekton partir des bouillons denrichissement. Lensemencement se fait daprs la mthode des cadrans. Lincubation des milieux slectifs se fait 37C pendant 48h.

A. Description des milieux utiliss

1. Kristensen (BGA)
Ce milieu est rendu slectif par la prsence de vert brillant. En effet le vert brillant inhibe la flore Gram positive, partiellement les coliformes et les Proteus, mais galement les Shigella et mme certaines souches fragiles de salmonelle (Salmonella typhi). [1] Lattaque des sucres (lactose et saccharose) est visualise par le virage au jaune du rouge de phnol. La slectivit du milieu peut aussi se traduire par la prsence de 0.2% de dsoxycholate. Le dsoxycholate de sodium inhibe la flore Gram positive. Observation : Lapparition de colonies plates dans un milieu rouge montre quil ny a pas eu acidification et donc pas dutilisation du lactose et du saccharose.

2. Rambach
La spcificit du Rambach repose sur la capacit des salmonelles mtaboliser le propylne glycol en produisant de lacide rvl par un indicateur de pH donnant aux colonies une couleur rouge caractristique. Les coliformes pouvant aussi ragir avec le propylne glycol sont diffrencis par un chromogne spcifique rvlant leur enzyme caractristique galactosidase par une coloration bleue-violette. Les autres entrobactries et les bactries Gram ngatives, telles que les Proteus, Pseudomonas, Shigella, Salmonella typhi et Salmonella paratyphi A donnent des colonies incolores jaune. La prsence de dsoxycholate rend aussi ce milieu slectif des Gram -. [1] Observation : Croissance de colonies plates rouge tmoignant de la mtabolisation du propylne glycol.

3. Glose Hektoen
La glose Hektoen est un milieu de choix pour lisolement des entrobactries pathognes : La prsence dextrait de levures et de sucres, et la qualit des peptones favorisent la croissance des Salmonella et des Shigella mme fragiles. Des sels biliaires assurent le pouvoir slectif en limitant le dveloppement des coliformes et des Proteus. Lorientation de lidentification des bactries isoles est fonde sur lattaque de trois sucres, le lactose, la salicine et le saccharose, permettant un reprage plus prcis des Salmonella et des Shigella qui nattaquent aucun de ces sucres Deux indicateurs permettent de visualiser la raction : o Le bleu de bromotymol qui vire au jaune lacidit o La fuchsine qui se colore en prsence daldhyde (do une teinte saumone si la souche utilise lun ou plusieurs des sucres prsents) Une diffrenciation supplmentaire reposant sur la production dH2S est galement possible grce la prsence de thiosulfate et de citrate de fer : elle se traduit par des colonies centre noir, coloration due la formation de sulfure de fer. [1] Observation : Croissance de colonies noires plates tmoignant de la production d H2S dans un milieu bleu tmoignant une basification consquence de lutilisation des peptones.

B. Discussion de lisolation.
La bactries mises en vidence sont lactose -, saccharose -, H2S +, et mtabolisent partir du propylne glycol. Ces constats nous permettent de nous orienter vers le genre Salmonella enterica. Nous allons maintenant effectuer partir de ces colonies caractristiques une galerie de tests biochimiques spcifiques Salmonella. [2]

III.Identification
A partir des colonies isoles nous allons raliser plusieurs tests : Une galerie didentification avec lensemencement dune glose Hajna-Kliger, Un test de phage avec lensemencement dun milieu trypticase soja, Un test de srologie partir dun ensemencement dune glose G.T.S.

A. Galerie didentification
1. Description du milieu Hajna-Kliger
Cest un milieu didentification des entrobactries, bas sur une fermentation de deux sucres (glucose et lactose) et sur la production dhydrogne sulfur H2S. Quand une bactrie est capable de cataboliser deux glucides dont le glucose, elle utilise dans un premier temps exclusivement le glucose jusqu son puisement dans le milieu et dans un deuxime temps le lactose : cest la diauxie. [1] Lindicateur color utilis est le rouge de phnol. Le milieu Hajna-Kliger est ensemenc sur la pente et dans le culot. Sur la pente, lutilisation de la source de carbone est arobie si la capsule est correctement dvisse, le dioxyde de carbone est volatil et peut schapper. Sur le culot, lutilisation de la source de carbone est anarobie, il y a production dacides organiques non volatils. 6

 La fermentation du glucose se traduit par le virage au jaune du culot (acidification du rouge de phnol). La fermentation du lactose se traduit par le virage au jaune de la pente. Il est aussi possible de dtecter la production de gaz par dcollement de la glose. La prsence de thiosulfate de sodium et de Fe3+ dans le milieu permet dapprcier la capacit des bactries produire de lH2S partir du thiosulfate. Il y a apparition dun prcipit noir la limite de la pente et du culot.

2. Prparation du test.
Pour effectuer une galerie didentification Hajna-Kliger, on doit : Prlve une colonie caractristique de chaque milieu disolation, que lon repique sur la glose Hajna-Kliger. Pour cela on ensemence abondamment la surface de la pente, puis le culot par piqre laide dune ose, Il ne faut pas visser compltement le bouchon, de faon permettre laration du milieu, On incube les trois tubes 24 heures 37C.

3. Rsultats.
On observe un prcipit noir avec un culot jaune et une pente rouge. Ceci confirme que la bactrie ensemence est H2S+, glucose + et lactose -.

B. Le test du phage
Cette technique permet didentifier une bactrie par lutilisation dun bactriophage. Les bactriophages ou phages sont des virus qui peuvent infecter les bactries et provoquer leur lyse.

1. Descriptions des milieux utilises

Bouillon trypticase soja : Ce bouillon permet la croissance abondante de la plupart des bactries arobies et anarobies, sans adjonction de substances nutritives. La glose trypticase soja nest quun bouillon trypticase soja solidifi par laddition dagar-agar. [1] Le milieu Mueller-Hinton : contient de lamidon qui joue un rle protecteur. Il neutralise les substances toxiques auxquelles sont sensibles certaines bactries fragiles. Cest galement une source dnergie. [1]

2.

Description et prparation du test

Le phage 0 : 1 est un bactriophage actif sur la plupart des Salmonella. Ce phage se fixe sur les rsidus N-Actyl-Glucosamine de polyosides externes. Certaines Salmonella nen possdent pas et sont donc rsistantes. Lorsque le phage pntre lintrieur de la bactrie, il y a lyse de la cellule. Apres croissance sur le bouillon trypticase soja, on verse la totalit du tube sur la glose Mueller-Hinton. On laisse sch puis on enlve lexcdant laide dune pipette pasteur. On dpose une goutte de phage au centre de la boite de ptrie et on laisse incub 24h 37C. Une zone sans colonie lemplacement du dpt de phage tmoignera de la lyse bactrienne. Si la souche est rsistante, il y aura un tapis bactrien. 7

3. Rsultats
On observe lendroit du dpt des colonies clairsemes et autour un tapis bactrien avec par endroit des zones sans colonie. On ne peut donc conclure car le test nest pas valable. Le schage et le phage qui tait prim sont les deux lments remettre en cause.

C. Srologie
Lors de ce TP nous avons seulement effectu ltude srologique sur lantigne O.

1. Dfinitions
Ltude de la srologie va nous permettre deffectuer la classification de KauffmannWhite. Cette classification repose sur la dtermination des antignes O et H : les antignes O ou somatiques, correspondent aux polyosides fixs sur les lipopolysaccharides. Ils sont thermostables et rsistent lalcool. Les bactries portant des antignes O sont agglutines par les anticorps correspondants ; les agglutinats sont fins, lents se constituer et difficilement dissociables par agitation (agglutination "corps corps"). On les dtermine par agglutination sur lame l'aide d'immuns srums spcifiques. les antignes H ou flagellaires n'existent que chez les souches mobiles. Constitus de protines spcifiques dnommes flagelline, ils sont thermolabiles et inactivs par l'alcool. Ils provoquent une agglutination floconneuse (accolement des bactries par leurs flagelles), rapidement constitue mais facilement dissociable par agitation (rupture des flagelles). Les antignes H sparent les srovars l'intrieur de ces groupes. On les met galement en vidence par agglutination sur lame. Les anticorps anti-H rendent immobiles les bactries qui portent sur leurs flagelles les spcificits qui leur correspondent.

2. Prparation du test
On ensemence les colonies caractristiques sur une glose GTS en pente. Puis aprs incubation 24h 37C, on repique les colonies sur une lame o se trouve une goutte dimmuns srums spcifique. Nous allons tous dabords raliser les tests avec les srums OMA et OMB dcrit dans le tableau suivant [3] : Srum OMA: OMB: Groupes correspondants A, B, D, E, L C, F, G, H Antigne O 1,2,3,4,5,9,10,12,15,19,21,46 6, 7, 8, 11, 13, 14, 20, 22,23, 24

On observe une agglutination avec le srum OMA : les groupes C, F, G et H sont carts, alors on continue les tests avec les srums O4,5 et O9,12. On constate alors une agglutination avec le srum O9,12. On dduit alors que la salmonelle mise en vidence est du groupe D. En effet, les sous-espces typhi et paratyphi nont pas mise en vidence lors de lisolement sur Rambach.

Conclusion
Le plat cuisin dorigine animale, le hachis Parmentier, est non conforme vis--vis des normes en vigueur (absence de salmonelle dans 25g daliment). La souche incrimine est Salmonella enterica subsp enterica srovars 9,12 (groupe D). Cette catgorie de salmonella est dite mineure . La consommation simultane par plusieurs personnes d'un aliment massivement contamin par des Salmonella mineures entrane une pidmie de gastro-entrite et provoque, dans le cas dun empoisonnement une toxi-infection alimentaire collective (TIAC). La priode d'incubation est de 10 18 heures. Les troubles durent en gnral 2 5 jours. Les complications sont rares sauf chez les sujets immunodpressifs (nourrissons, personnes ges, femmes enceintes, etc.). L'aliment responsable est identifi par enqute pidmiologique. Le diagnostic se fait par recherche de la Salmonella dans les selles des malades et dans l'aliment incrimin (s'il est encore accessible).Le traitement est le mme que celui des gastro-entrites. La prvention repose essentiellement sur : l'hygine des cuisines collectives et dtection des porteurs sains parmi le personnel des cuisines ou des industries alimentaires : une coproculture systmatique annuelle est prconise. contrle bactriologique des denres alimentaires. respect de la chane du froid [2]

Bibliographie
[1] N. Marchal, J.L. Bourdon, Cl. Richard, Les milieux de culture pour lisolement et lidentification biochimique des bactries. Biologie applique, 1991, nouvelle dition, p.30, 239-240, 261. [2] Collge bactriologie virologie de Lyon. Fiches bactries : Salmonella. [En ligne] disponible sur : http://lyon-sud.univ-lyon1.fr/bacterioviro/DESLYON/Fiches/chapitre1/Salmonella.html (consult en novembre 2004) [3] Biochemicals dianostics. Antisoros de salmonella. [En ligne] disponible sur : http://www.biochemical.com.br/microbio_alim.htm (consult en novembre 2004)