Anda di halaman 1dari 59

CARA MEMPELAJARI SEL

Monica

Besar sel
Mikroskopik (kebanyakan) Ukuran mikron m (mikrometer) m : 1 / sejuta m 10-9 m = 1 / seribu mm

Besar sel
Sel manusia terbesar = ovum Diameter = 1000 m (1 mm)

Besar sel
Sel manusia terkecil = sel sperm

Bagaimana Mempelajari Sel ?


Problem: Ukuran : mikroskopik!

Solusi: 1. Teknik Biofisika Mikroskopi 2. Teknik Biokimia Cara Analitik 3. Teknik Biakan sel Teknik Biologi

Bagaimana Mempelajari Sel ?


Problem: Ukuran : mikroskopik!

Solusi: 1. Teknik Biofisika Mikroskopi 2. Teknik Biokimia kok 3. Teknik Biakan sel jij

MIKROSKOP
Cahaya Mikroskop cahaya Mikroskop elektron Pengamatan Mikroskop diseksi Mikroskop monokuler / binokuler Kegiatan pengamatan Mikroskop sederhana Mikroskop riset : Mikroskop dark filed Mikroskop fluoresens Mikroskop fase kontras Mikroskop Nomarski DIC Mikroskop konfokal

MIKROSKOP
Cahaya Mikroskop cahaya Mikroskop elektron Pengamatan Mikroskop diseksi Mikroskop monokuler / binokuler Kegiatan pengamatan Mikroskop sederhana Mikroskop riset : Mikroskop dark filed Mikroskop fluoresens Mikroskop fase kontras Mikroskop Nomarski DIC Mikroskop konfokal

Mikroskop Cahaya
Cahaya melalui spesimen Fokus dengan lensa kaca
eye ocular lens light rays

Gambar dibentuk oleh retina


objective lens

Pembesaran maksimal : 1000 X Tebal spesimen 0.2 mm, 500 X > mata manusia

specimen condenser lens

light source

Mikroskop Elektron
Prinsip = mikroskop cahaya, KECUALI : Pancaran elektron cahaya Pancaran elektron : 0.01 nm resolusi 1 2 nm (TEM) atau 10 20 nm (SEM) Fokus : elektromagnet lensa kaca Resolusi tinggi

Transmission Electron Microscope (TEM)


Elektron melalui spesimen
200 nm pseudopod segment, transmission electron micrograph electron source electron beam

Fokus dengan lensa magnetik


Gambar dibentuk pada layar fluorensen
layar TV Difoto

electromagnetic condenser lens

specimen electromagnetic objective lens

electromagnetic projector lens observation screen or photographic plate

Pembesaran maksimal 1.000.000 X Tebal spesimen 0.00002 mm, 100.000X lebih baik daripada mata manusia

Transmission electron microscopy

Scanning Electron Microscope (SEM)


Spesimen dilapisi tipis dengan metal
Pancaran elektron memindai sepanjang permukaan spesimen
Metal memancarkan elektron sekunder

Pancaran elektron difokuskan oleh lesa magnetik


Gambar dibentuk pada layar berfluoresens
Seperti layar TV
Gambar lalu difoto

Scanning electron microscopy

Red blood cells

Tracheal cilia

Mikroskop dan Amoeba proteus


Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

85 m
amoeba, light micrograph

200 nm pseudopod segment, transmission electron micrograph electron source electron beam amoeba, scanning electron micrograph

500 m

eye ocular lens light rays

electron gun electron beam

electromagnetic condenser lens

electromagnetic condenserl enses

specimen electromagnetic objective lens

objective lens specimen condenser lens

scanning coil

electromagnetic projector lens

light source
a. Compound light microscope

observation screen or photographic plate


b. T ransmission electron microscope

final Condenser lens secondary electrons specimen

electron detector TV Viewing screen

c. Scanning electron microscope

17

a: Robert Brons/Biological Photo Service; b: M. Schliwa/Visuals Unlimited; c: Kessel/Shih/Peter Arnold, Inc.

Pewarnaan histologi untuk spesimen tebal


1. 2. 3. 4. 5. Fiksasi Embedding (paraffin block) Potongan tipis (mikrotom) Pewarnaan Pemeriksaan mikroskop cahaya

Sel Hidup
Sel hidup dapat dilihat dengan teknik yang menghasilkan kontras Kebanyakan sel dan jaringan transparan dan tidak bewarna (kontras rendah) Komponen seluler berbeda satu sama lain dalam indeks refraksi Teknik optik seperti fase kontras dan differential interference contrast dapat digunakan untuk melihat sel hidup yang tidak berwarna

Phase contrast

DIC

Antibodi
Antibodi terdiri dari 2 rantai berat, 2 rantai ringan Berikatan dengan afinitas sangat tinggi dengan antigen target Dapat diproduksi pada tikus, kelinci, kambing, domba, dan ayam

Penggunaan antibodi untuk imunohistokimia

Pewarnaan imunofluoresens Golgi (biru), aktin (hijau) histon (merah)

Mikroskop Cahaya Imunofluoresens


Antibodi terhadap protein spesifik
Molekul berlapis pewarna fluoresens berikatan pada molekul antibodi Spesimen terpapar pada antibodi berfluoresens

Sinar ultra-violet melalui spesimen


Pewarnaan fluoresens bersinar dimana antigen berada Cahaya yang terpancar difokuskan oleh lensa kaca ke retina manusia

Dapat memetakan distribusi protein spesifik pada sel

22

Contoh preparat multi-color fluorescence

Sel endotelial hidup : RE (hijau) dan mitokondria (merah)

Sel epitelial : aktin (ungu), DN A(biru), dan Golgi (hijau)

Mikroskop Konfokal
Pancaran laser tipis memindai sepanjang spesimen yang transparan Pancaran difokuskan pada piringan yang rata Dapat membuat potongan pada spesimen
Potongan dibuat pada tingkat yang berbeda

Dapat membuat gambar 3 D pada layar komputer yang dapat diputar

Mikroskop Konfokal

Green fluorescent protein (GFP)


Protein fluorofor alami Terdapat pada ubur ubur Menyerap cahaya biru dan memancarkan cahaya hijau Sikuens DNA dapat difusikan (gabungkan) pada gen lain dan dimasukkan dalam sel

Bagaimana Mempelajari Sel ?


Problem: Ukuran : mikroskopik!

Solusi: 1. Teknik Biofisika Mikroskopi 2. Teknik Biokimia Cara Analitik 3. Teknik Biakan sel jij

Teknik Biokimia
Tujuan : mempelajari sel pada tingkat molekul untuk memahami fungsi dan peran molekul tsb dalam mengkonstruksi sel atau komponen sel Prinsip : mengisolasi atau memisahkan molekul dari sel, dan mengujinya berdasarkan sifat-sifat fisik, biologi dan kimianya

Teknik Biokimia Metode dasar (Prinsip kerja)


Memecah/menghancurkan sel/jaringan menjadi bagian-bagian kecil atau fragmen sel. Purifikasi/pemisahan komponen sel Menganalisis struktur dan fungsi fragmenfragmen tersebut pada tingkat molekul

Memecah / Fragmentasi
Larutan hipotonus Eritrosit (0,075 M KCl)

Memecah / Fragmentasi
Sonifikasi kejutan getaran (Hertz = Hz)

Memecah / Fragmentasi
Enzim lisozim

Memecah / Fragmentasi
Deterjen
Non ionik : membran sel hancur Kationik : membran sel larut An ionik : organel rusak (ekstraksi DNA) SDS

Memecah / Fragmentasi
Homogenizer jaringan yang kuat (elektrik)

Purifikasi
Sentrifugasi
Sentrifugasi diferensial Sentrifugasi densitas bertingkat

Kromatografi
Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis Kromatografi kolom

Elektroforesis

Sentrifugasi
Pemisahan komponen sel berdasarkan perbedaan kecepatan sedimentasi Tersedimentasi karena daya sentrifugal yang dihasilkan oleh perputaran rotor Satuan universal yg dipakai untuk menyatakan daya sentrifugal yg dihasilkan rotor adalah g Macamnya : Sentrifugasi deferensial Sentrifugasi densitas bertingkat

Sentrifugasi Diferensial
Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

Hancurkan sel

Sentrifuse sel pada kecepatan yang berbeda

600 g 10 menit

15.000 g 5 menit

100.000 g 60 menit

Bagian sitoplasma

Nukleus pada sedimen

Mitokondria dan lisoson pada sedimen

Ribosom dan retikulum endoplasma pada sedimen

37

Sentrifugasi Diferensial
Separasi bagian sel

Separasi berdasarkan ukuran dan densitas Seperti mesin cuci


Putaran mesin , bagian sel terpisah

38

Sentrifugasi Densitas Bertingkat


Sukrose gradient Sukrose dengan konsentrasi bertingkat (pekat di dasar, encer di atas) Perbedaan frictional force pada medium dengan densitas berbeda BM besar di atas, BM kecil di bawah Protein dan organel sel

Sukrose Gradient

Sentrifugasi Densitas Bertingkat


CsCL gradient Garam CsCL densitas tinggi dan viskositas rendah Struktur sama, BM berbeda DNA / RNA

Kromatografi
2 fase yang tidak dapat bercampur :
fase stasioner / diam (stationary phase) fase mobil (mobile phase)

Pemisahan : beda afinitas terhadap fase Macam kromatografi : Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis Kromatografi kolom

Kromatografi Kertas
Pisahkan molekul-molekul kecil : nukleotida, peptida & as. amino Media penunjang - kertas selulose Fase stasioner air yg membasahi kertas Fase mobil pelarut nonpolar, bergerak lebih cepat pada kertas selulose, mis.: n-butanol Suspensi yg akan dipisahkan diteteskan pada salah satu ujung kertas (dlm ml) & dikeringkan ujung kertas dg noda sampel dicelupkan ke dlm bejana berisi air & butanol terjadi partisi

Kromatografi Lapis Tipis


Media penunjang lempeng kaca Fase stasioner selulose / silica gel dilapiskan pada permukaan kaca, berfungsi sbg adsorption material Fase mobil campuran nonpolar CHCl2 & CH3OH. Sampel diteteskan pada sumur di ujung plate plate dicelupkan ke fase mobil molekul yg sukar teradsorpsi akan bergerak lebih cepat terbawa oleh pelarut nonpolar

Kromatografi Kolom
FILTRASI GEL (BM) Media penunjang : partikel gel bahan selulose (sephadex) ukuran pori pori tertentu, larutan buffer Fase stasioner buffer dalam partikel gel Fase mobil buffer di luar partikel gel Hasil : Partikel besar di luar gel, semua keluar Partikel sedang sebagian masuk, sebagian di luar, Partikel kecil semua masuk pori pori, keluar paling akhir

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY


Perbedaan muatan listrik (ion) molekul Media penunjang : selulose + ion exchanger Fase stasioner partikel bermuatan pada ion exchanger Fase mobil buffer dengan pH / konsentrasi garam bertingkat

Elektroforesis
Memisahkan komponen sel / molekul yang bermuatan (protein/nukleotida) Prinsip : molekul bermuatan di dalam medan listrik akan bermigrasi ke elektroda yang berlawanan Media penunjang gel agarose / poliakrilamid (konsentrasi tertentu pori pori) Bejana berisi bufer elektrolit & dihubungkan ke power supply terjadi partisi karena migrasi molekul bermuatan ke elektroda yang berlawanan Kecepatan migrasi menentukan partisi, tergantung pada:
besar muatan ukuran molekul bentuk molekul

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis

Analisis Fraksi Sel : SPEKTROSKOPI


Prinsip : Molekul / ikatan kimia cenderung mengabsorpsi energi Sinar : gel elektomagnetik energi E = h.c energi yg dihasilkan sinar berbanding terbalik dengan panj gel Ground state, Excited state diukur

SPEKTROFOTOMETER

Analisis Fraksi Sel : SPEKTROSKOPI


Kegunaan : Identifikasi molekul yang belum diketahui Asam nukleat Protein Mengukur kuantitas/konsentrasi molekul dlm larutan

Analisis Fraksi Sel : LABEL ISOTOP


Isotop : atom dengan jumlah elektron sama tetapi mempunyai jumlah neutron berbeda mempunyai sifat kimia sama, tetapi sifat fisika berbeda Manfaat : Analisis eksistensi molekul yang mengandung isotop dalam sistem biologis Isotop tidak stabil Isotop stabil + E materi sensitif sinar lokasi molekul yang mengandung isotop

Analisis Fraksi Sel : LABEL ISOTOP

Bagaimana Mempelajari Sel ?


Problem: Ukuran : mikroskopik!

Solusi: 1. Teknik Biofisika Mikroskopi 2. Teknik Biokimia kok 3. Teknik Biakan sel Teknik Biologi

Kultur sel hewan : sistem eksperimental yang mudah diikuti


Fisiologi, biokimia, morfologi, genetika In vitro Kultur primer : sel diambil langsung dari organisme dan ditumbuhkan. Kultur ini hanya membelah beberapa kali, kemudian berhenti Cell lines: berasal dari sel embrionik undifferentiated atau sel tumor. Kultur ini immortal Sel kultur tumbuh dalam medium

Pro dan kontra sel kultur sebagai model


Keuntungan :
1.
2.

Kebanyak jaringan terdiri dari berbagai tipe sel dan sel dengan tipe spesifik dalam ditumbuhkan dalam kultur Kondisi eksperimental lebih mudah dimanipulasi dan diamati dengan kultur sel daripada dengan organisme
Sel yang dikultur pada cawan kultur tidak berada dalam lingkungan normal dan tingkah lakunya tidak diatur oleh sel dan jaringan lain seperti dalam organisme

Kerugian :
1.

PERTANYAAN ????