Anda di halaman 1dari 17

33

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang di gunakan pada penelitian ini adalah penelitian kuasi eksperimental dengan rancangan acak terkontrol (RAT). Penelitian ini menggunakan 5(lima) kelompok perlakuan terhadap hewan percobaan mencit putih jantan (Mus musculus L) dewasa. Mencit di pilih sebagai objek penelitian karena memiliki homogenitas metabolik yang mirip manusia. Mencit memiliki organ dan fisiologi sistemik yang sama, serta memiliki gen yang mirip manusia. Mencit juga memiliki kemiripan yang baik bagi pathogenitas suatu penyakit. Kemiripan inilah yang menjadi satu alasan mengapa mencit di gunakan dalam meneliti pathogenesis penyakit maupun proses penuaan pada manusia.

B. Waktu dan Lokasi Penelitian

34

Penelitian akan di laksanakan diBalai Penyidikan dan Pengujian Vtriner Bandar lampung (BPPV) pada bulan Desembar 2012 sampai bulan Janari 2012 . Pembedahan organ hepar (Mus musculus L) dan pembuatan preparat histology di lakukan di laboratorium patologi BPPV (balai penyelidikan dan pengujian vtriner) Bandar lampung. Sedangkan untuk pembuatan ekstrak daun sirsak di lakukan di laboratorium FMIPA universitas lampung.

C. Subjek penelitian 1. Populasi Populasi dari penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus L) dewasa, umur 3 bulan dengan berat 25-35 gram dan sehat yang di tandai dengan gerakan aktif, populasi yang terdapat dalam penelitian ini di peroleh dari balai penyidikan dan pengujian vtriner Bandar lampung. 2. Sample Pengambilan sampel dilakukan dari populasi mencit secara acak sederhana, dimana semua objek atau elemen populasi memiliki kesempatan yang sama untuk dipilih sebagai sampel. Sampling acak sederhana dapat dilakukan setelah kerangka sampling dibuat dengan benar berdasarkan : a. Kriteria inklusi : 1) Sehat 2) Memiliki berat badan antara 25-35 gram

35

3) Jenis kelamin jantan 4) Usia sekitar 3 bulan b. Kriteria ekslusi : 1) Sakit (penampakan bulu kusam ,rontok atau botak dan aktivitas berkurang atau tidak aktif) 2) Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah 1 minggu massa adaptasi di laboratorium. b. Cara pengambilan sample Besar sample di tentukan berdasarkan buku panduan penelitian WHO yaitu minimal 5 ekor mencit tiap kelompok. Sedangkan bnyaknya pengulangan di tentukan berdasarkan rumus federrer :
(t-1)(n-1)15

(5-1) (n-1) 15 4(n-1) 15 4n-4 15 4n 19 n 4,83 n 5

36

t : jumlah kelompok perlakuan n : jumlah pengulangan atau sampe tiap kelompok

3.

Bahan dan alat penelitian Daun sirsak yang di gunakan dalam penelitian ini dari kelurahan kampong baru kec.kedaton Bandar lampung , bahan penelitian tersebut di buat dalam sediaan ekstrak daun sirsak dengan dosis 2,3 gr/kgBb, 4,6 gr/kgBb dan 9,2 gr/kgBb a. Bahan penelitian 1) Bahan biologis : mencit jantan (Mus musculus L) dewasa, umur kurang lebih 3 bulan dengan berat 25-35 gram dan sehat. 2) Bahan kimia yang di gunakan untuk penelitian ini, berupa bahan kimia yang di gunakan untuk pembuataan sedian histologi hepar mencit. Bahan kimia tersebut adalah: kloroform, formalin 10 %, aquades, alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol 96%, alkohol absolute, xilol, paraffin dan preparat hemotoksilin eosin. b. Alat penelitian Alat penelitian yang di gunakan dalam penelitian ini adalah : 1) Neraca analitik metler toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 gr untuk menimbang berat mencit, 2) Spuit disposable

37

3) Sonde 4) Minorset 5) Papan strofoan 6) Kandang mencit 7) Kapas dan alkohol c. Alat pembuatan preparat histologi meliputi : 1) Microtom 2) Objek glass 3) Pemanas (hotplate) 4) Gelas penutup (cowper glass) 5) Pipet tetes 6) Embedding cassette 7) Water bath

D. Prosedur penelitian 1. Pemberian dosis etanol Pada penelitian ini digunakan Etanol 50% selama 10 hari dengan dosis 10 ml/kg/bb pada tikus ( marantika, 2011). Faktor konversi tikus putih

dengan berat badan 200 gr k mencit dengan berat badan 20gr adalah 0,14 (Ngatidjan,2006).

Dosis untuk mencit = 2ml x 0,14/20gr mencit = 0,28ml/20gr mencit

38

Jadi pada penelitian ini di gunakan dosis etanol (50%) sebanyak 0,28ml/20gr/bb pada mencit. 2. Prosedur pemberian dosis ekstrak daun sirsak Untuk mencapai tujuan dan mendapatkan hasil yang lebih akurat dan bermanfaat bagi masyarakat, maka dosis yang di gunakan dalam penelitian ini di sesuaikan dengan dosis yang lazim di gunakan di masyarakat, kemudian di konversikan ke berat badan (BB) mencit. Dosis lazim ekstrak daun sirsak manusia dengan berat badan 70 kg adalah 35,637 gr, faktor konversi dosis manusia 70 kg k mencit 20 gr = 0,0026. Maka dosis pertengahan untuk mencit 20 gr = 0,0026 x 35,637 gr = 0,0927 gr/20 gr atau 0,0927 x 1000/20 = 4,6 gr/kgbb sebagai kelompok III. a. Dosis pada kelompok perlauan coba 1 merupakan 1,5 kali dosis kelmpok III sebesar 2,32 gr/kgbb b. Dosis pada kelompok perlakuan coba II (kelompok III) merupakan dosis pertengahan sebesar 4,6 gr/kgbb. c. Dosis pada kelompok perlakuan coba III (kelmpok IV) merupakan 2x dosis pertengahan sebesar 9,2 gr/kgbb.

3. Prosedur pembuatan ekstrak daun sirsak

39

Daun sirsak yang di gunakan dalam penelitian ini adalah daun yang segar yang di pilih daun yang tidak terlalu tua tidak terlalu muda, cirinya berwarna hijau segar. Langkah langkahnya adalah : a. Ambil daun sirsak dan bersihkan dengan air bersih b. Kemudian daun sirsak di potong-potong lalu di rendam dengan larutan alkohol 70 % selama 5-6 jam . c. Saring air rendaman menggunakan kain kassa. d. Kemudian di panaskan dengan suhu 40-50C sampai terjadi penguapan . e. Alkohol yang menguap di simpan dalam tabung kondensasi. f. Air rendaman yang mengandung senyawa berkhasiat asal daun sirsak kemudian diuapkan lagi dengan suhu 40-50C hingga kadar airnya tinggal 5-10% dan menjadi bubuk. 4. Prosedur penelitian a. Mencit sebanyak 25 ekor, di kelompokakan dalam 5 kelompok yaitu : 1) Kelompok pertama (1) sebagai kontrol normal dimana hanya di berikan aquades 1 ml dan tidak di berikan ekstrak daun sirsak. 2) kelompok kedua (II) adalah kelompok perlakuan coba dengan pemberian etanol 50% dengan dosis 0,28 ml/20grbb dan tidak di berikan ekstrak daun sirsak.

40

3) Kelompok tiga (III) dengan dosis etanol 0,28ml/20grbb + dengan dosis daun sirsak 2,3 gr/kgbb 4) Kelompok ke empat (IV) dengan dosis etanol 0,28 ml/20grbb + dosis daun sirsak 4,6 gr/kgbb. 5) Kelompok ke lima (V) dengan dosis etanol 0,28ml/grbb + dosis daun sirsak 9,2 gr/kgbb Masing-masing di berikan peroral selama 10 hari. Selama 1 minggu tiap-tiap kelompok mencit di adaptasikan sebelum di beri perlakuan. b. Mengukur berat badan c. Menginduksi mencit dengan etanol 50% selama 10 hari dengan ekstrak daun sirsak. Mencit di beri makan d. Selama 10 hari perlakuan di hentikan e. 5 mencit jantan dari tiap kelompok di bius dengan kloroform. f. Di lakukan laparotomi, di ambil dari organ hepar untuk di buat sediaaan mikroskopis. Pembuatan sediaan mikroskopis dengan metode paraffin dan perwarnaan hematoksilin eosin. Hemaktosilin mempunyai sifat pewarna basa, yaitu memulas unsur jaringan basofilik, eosin memulas unsur jaringan yang bersifat asidofilik. Kombinasi ini paling banyak di gunakan.(Junqueirae et al, 2007)

41

g. Sample organ hepar ini di fiksasi dengan formalin 10%. Selanjutnya sample ini di kirim ke laboratorium BPPV Bandar lampung, untuk pembuatan miskroskopik jaringan hepar. h. Metode tekhnik histologi menurut instalansi Laboratorium Patologi Anatomi (2008), yaitu : 1) Fiksasi a) Fiksasi spesimen berupa potongan organ hati yang telah di pilih segera dengan larutan formalin 10% b) Mencuci dengan air mengalir 2) Treming atau sampling a) Membuat irisan organ hati dengan ketebalan 3mm dan di potong melintang. b) Memasukkan potongan organ hati tersebut ke dalam k embedding casette cass. c) Mencuci dengan air mengalir sampai tidak ada bercak formalin. 3) Dehidrasi Pada tahap ini di lakukan perendaman potongan jaringan dalam alkohol bertingkat selama : c) 80% selama 2 jam d) 95% selama 2 jam

42

e) 95% selama 1 jam f) Absolute 1 selama 1 jam g) Absolute 2 selama 1 jam 4) Clearing Untuk membersihkan sisa alkohol, di lakukan clearing dengan xilol I, II ,III, masing-masing selama 1 jam. 5) Impregnasi Dengan mengunnakan paraffin I, II, III, masing-masing selama 2 jam. 6) Embedding a) Membersihkan sisa paraffin yang ada pada pan dengan beberapa saat di atas api dan usap dengan kapas. b) Menyiapkan paraffin cair dengan memasukkan dengan paraffin dalam cangkir logam dan memasukkan dalam oven dengan suhu di atas 58C. c) Menuangkan paraffin cair ke dalam kaset d) Memindahkan satu persatu dari embedding cassette ke lemari pendingin 4-6C beberapa saat.

43

e) Memotong paraffin sesuai dengan jaringan yang ada dengan menggunakan scaltol atau pisau hangat f) Meletakkan pada blok kayu, ratakan pinggirinya dan buat ujungnya sedikit runcing. g) Memblok paraffin yang siap di potong dengan mikroskop. 7) Cutting a) Melakukan pemotongan pada ruang dingin b) Melakukan pemotongan cassette di lanjutkan dengan pemotongan halus dengan ketebalan 4-5 mikron. c) Lebaran pemotongan yang paling baik,

mengapungkan pada air dan menghilangkan kerutannya dengan cara menekan salah satu sisi lebaran jaringan tersebut dengan ujung jarum dan sisi yang lain di tarik menggunakan kuas penguji d) Memindahkan lebaran jaringan ke dalam water bath selama beberapa detik sampai mengembang sempurna.

44

e) Dengan gerakan menyendok mengambil jaringan tersebut dengan slide bersih dan menempatkan di tengah atau sepertiga atas atau bawah, mencegah jangan sampai ada gelembungan udara di bawah jaringan. f) Menepatkan slide yang berisi jaringan pada inkubator (suhu 37C) selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna. 8) Staining (pewarnaan) dengan harris hematoksilin eosin Setelah jaringan melekat sempurna pada slide memilih slide yang terbaik selanjutnya secara berurutan memasukkan ke dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut : a) Untuk pewarnaan ini zat pertama yang di gunakan adalah xilol I, II, III, masing-masing selama 5 menit. b) Kedua, zat kimia yang di gunakan alkohol absolute I, II, III, masing-masing selama 5 menit. c) Zat kimia yang ketiga aquades selama 1 menit. d) Keempat, potongan organ di masukkan dalam zat farma harris hemoksilin selama 20 menit.

45

e) Kemudian memasukan potongan organ hepar dalam aquades selama 1 menit dengan sedikit mengoyanggoyangkan organ. f) Keenam, mencelupkan organ dalam asam alkohol 2-3 celupan. g) Ketujuh, di bersihkan dalam aquades, bertingkat masing-masing 1 menit. h) kedelapan, memasukkan potongan organ ke dalam eosin selama 2 menit. i) Kesembilan, secara berurutan di masukkan potongan organ dalam alkohol 96% selama 2 menit, alkohol 96%, alkohol absolute III dan IV masing-masing selama 3 menit. j) Terakhir, memasukkan dalam xilol IV dan V masingmasing 5 menit. 9) Mounting Setelah pewarnaan selesai menempatkan slide di atas tisu pada tempat datar, menetesi dengan bahan mouting yaitu ganada balsam dan tutup dengan cowper glass cegah jangan sampai terbentuk gelembung udara. 10) Membaca slide dengan mikroskop

46

Slide di periksa di bawah mikroskop sinar dengan pembesaran 100x, 200x, 400x .

E. Variable penelitian 1. Variable independent adalah dosis pemberian etanol 50% dan dosis pemberian ekstrak daun sirsak 2. Variable dependent adalah gambaran histopatologi sel hepar mencit 3. Variable terkendali adalah : umur, berat badan (BB) mencit, jenis kelamin.

F. Definisi operasional Untuk memudahkan penelitian agar tidak menjadi terlalu luas makan di buat definisi operasional sebagai berikut : Table 1. Definisi operasional Variable Dosis Etanol 50% Definisi Adalah dosis yang di berikan peroral dengan dosis etanol 50% pada mencit adalah 0,28 ml /20gr bb pada mencit. Kerusakan organ hati Terdapat kerusakan sel hepar mencit yang menunjukkan perubahan patologi yaitu adanya sel radang, nekrosis Dosis ekatrak daun sirsak Dosis lazim ekstrak daun sirsak manusia dengan

47

berat badan 70 kg adalah 35,637 gr factor konversi dosis manusia 70 kg k mencit 20 gr = 0,0026. Maka dosis pertengahan untuk mencit 20 gr = 0,0026 x 35,637 gr = 0,0927 gr/20 gr atau 0,0927 x 1000/20 = 4,6 gr/kgbb sebagai kelompok III. 1. Dosis pada kelompok perlakuan coba 1 merupakan kali dosis kelmpok III sebesar 2,32 gr/kgbb 2. Dosis pada kelompok perlakuan coba II (kelompok III) merupakan dosis pertengahan sebesar 4,6 gr/kgbb. 3. Dosis pada kelompok perlakuan coba III (kelmpok IV) merupakan 2x dosis pertengahan sebesar 9,2 gr/kgbb.

G. Pengolahan data Data yang di kumpulkan adalah data primer yaitu : gambaran kerusakan sel pada hepar mencit dari kelompok-kelompok kontrol dan kelompok perlakuan

48

H. Analisis data Data yang di peroleh dari hasil pengamatan histopatologi di bawah mikroskop di uji analisis statisti menggunaakn program SPSS versi 20.0 dengan metode uji statistic one way anopa kemudian di lakukan analisis post hoc lsd. Untuk mengetahui hubungan peningkatan dosis pemberian ekstrak daun sirsak tingkatan kerusakan gambaran histopatologi sel hepar mencit di lakukan analisis korelasi hipotesis dengan metode pearson

49

Persiapan penelitian Bahan percobaan Hewan percobaan Bahan kimia Alat yang diperlukan

kontrol negatif

kontrol positif

Perlakuan 1

Perlakuan 2

Perlakuan 3

Mencit diadatasi selama 1 minggu

di berikan aquades 1 ml

etanol 50% dengan dosis 0,28 ml/20grbb

etanol 0,28ml/20grbb + dengan dosis daun sirsak 2,3 gr/kgbb

dosis

etanol

0,28ml/grbb + dosis sirsak gr/kgbb daun 9,2

0,28 ml/20grbb + dosis daun sirsak gr/kgbb. 4,6

Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher

Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher Mencit diterminasi dengan cara dislokasi leher