CENTRO ESCOLAR BENEMRITO DE LAS AMRICAS Con estudios incorporados a la S.E.P. Clave: EMS-3/368 Acuerdo No.

980008del 19 de agosto de 1998

GUA DE ESTUDIO PARA PRESENTAR EL EXAMEN EXTRAORDINARIO DE LA MATERIA

APLICAR TCNICAS DE IDENTIFICACIN PARA HONGOS Y LEVADURAS

(SEXTO SEMESTRE)

VIGENCIA JUNIO 2013

JUSTIFICACIN DEL MDULO.

En todo laboratorio de anlisis industrial es importante contar con el apoyo de un auxiliar que analice cualitativa y cuantitativamente los componentes de una muestra, y en los que se requiera de anlisis Microbiolgicos, que identifique microorganismos mediante tcnicas especficas, aplicando los estndares y herramientas estadsticas con un alto sentido de honestidad, responsabilidad, seguridad, orden y limpieza. Dada la importancia de estas actividades en el mercado laboral, este segundo mdulo, permite el desarrollo de competencias a travs de tres submdulos; en el primero el alumno adquiere la habilidad de identificar microorganismos a travs del anlisis microbiolgico, en el segundo submdulo desarrolla las competencias necesarias para analizar cualitativa y cuantitativamente los componentes de una muestra y finalmente en el tercer submdulo el alumno desarrolla la habilidad y destreza para aplicar los estndares y herramientas estadsticas en los anlisis qumicos y microbiolgicos, todo ello bajo los criterios y normas de seguridad e higiene, contribuyendo al cuidado del medio ambiente.

ESQUEMA DE LA MATERIA
APLICAR TCNICAS DE IDENTIFICACIN PARA HONGOS Y LEVADURAS. ANALIZAR CUALITATIVAMENTE LOS COMPONENTES DE UNA MUESTRA A TRAVS DE LA APLICACIN DE MTODOS ANALTICOS.

1. Aplicar tcnicas de identificacin

para hongos y levaduras utilizando mtodos de reproduccin, crecimiento, tincin y pruebas bioqumicas.

Aplicar los principios bsicos del anlisis qumico para la separacin e identificacin de los componentes de una muestra.
2.

1. Aplicar tcnicas de identificacin para hongos y levaduras utilizando mtodos de reproduccin, crecimiento, tincin y pruebas bioqumicas. 1.1 Aplicar mtodos para la reproduccin y crecimiento de hongos y levaduras. 1.2 Aplicar tcnicas de tincin para morfologa y estructura anatmica de hongos y levaduras. 1.3 Operar tcnicas de identificacin de hongos y levaduras de acuerdo a su metabolismo.

2. Aplicar los principios bsicos del anlisis qumico para la separacin e identificacin de los componentes de una muestra. 2.1 Aplicar los principios generales sobre los fundamentos de los anlisis

RESULTADO DE APRENDIZAJE DEL MDULO. Realizar anlisis qumicos y microbiolgicos generales bajo los criterios y normas de seguridad e higiene, contribuyendo al cuidado del medio ambiente con un alto sentido de honestidad, responsabilidad, seguridad, orden y limpieza.

1. Aplicar tcnicas de identificacin para hongos y levaduras utilizando mtodos de reproduccin, crecimiento, tincin y pruebas bioqumicas.
TEMAS.
1. Aplicar tcnicas de identificacin para hongos y levaduras utilizando mtodos de reproduccin, crecimiento, tincin y pruebas bioqumicas. 1.1 Aplicar mtodos para la reproduccin y crecimiento de hongos y levaduras. 1.2 Aplicar tcnicas de tincin para morfologa y estructura anatmica de hongos y levaduras. 1.3 Operar tcnicas de identificacin de hongos y levaduras de acuerdo a su metabolismo.

2. Aplicar los principios bsicos del anlisis qumico para la separacin e identificacin de los componentes de una muestra. TEMAS
2. Aplicar los principios bsicos del anlisis qumico para la separacin e identificacin de los componentes de una muestra. 2.1 Aplicar los principios generales sobre los fundamentos de los anlisis

ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE 1. Aplicar tcnicas de identificacin para hongos y levaduras utilizando mtodos de reproduccin, crecimiento, tincin y pruebas bioqumicas.
1. Elabora un mapa conceptual que clasifique a los microorganismos con sus principales caractersticas, resaltando la presencia de los hongos y su divisin en mohos y levaduras.

2. Representa a travs de esquemas las principales estructuras que conforman a un hongo y

describe brevemente la funcin que tienen en este microorganismo: micelio, hifa, septo, espora, esporangio, conidio, etc.

3. Esquematiza y explica el proceso de reproduccin de un moho.

4. Esquematiza y explica el proceso de reproduccin de una levadura.

5. En el siguiente cuadro escribe las principales caractersticas de los mohos presentes en los
alimentos: Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium.

GNERO

CARACTERSTICAS PRINCIPALES

Mucor

Rhizopus

Aspergillus

Penicillium

6. En el siguiente cuadro escribe las principales caractersticas de las levaduras presentes en los
alimentos: Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Trichosporon.

GNERO
Schizosaccharomyces,

CARACTERSTICAS PRINCIPALES

Saccharomyces

Zygosaccharomyces

Candida

Trichosporon

7. Escribe la composicin de los medios de cultivo: a) Agar papa dextrosa, b) Agar dextrosa Saboraud y c) Agar Micosel, sealando en cada uno de ellos cul es el componente responsable de la inhibicin del crecimiento de bacterias en estos medios. AGAR PAPA DEXTROSA AGAR DEXTROSA SABORAUD AGAR MICOSEL

8. Elabora un diagrama de flujo que muestre la tcnica utilizada en laboratorio para aislar hongos del aire (vase manual de prcticas).

9. Elabora un diagrama de flujo que muestre la tcnica utilizada para aislar hongos del suelo (vase manual de prcticas).

10. Elabora un diagrama de flujo explicando la tcnica adecuada para teir a los hongos aislados del aire o del suelo (vase manual de prcticas).

11. Describe la prueba bioqumica de la catalasa usada en levaduras (vase manual de prcticas).

12. Elabora un diagrama de flujo del procedimiento experimental sealado en la norma oficial NOM111-SSA1-1994 para la determinacin de hongos y levaduras en alimentos.

13. Escribe y explica los mtodos analticos comunes utilizados en los anlisis cualitativos.

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14. Explica el concepto de equilibrio qumico a travs de su ecuacin general.

15. Explica qu es una marcha analtica.

16. Elabora un diagrama de flujo detallado de la marcha analtica del grupo I, sealando cmo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

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17. Elabora un diagrama de flujo de la marcha analtica del grupo II sealando cmo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

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18. Elabora un diagrama de flujo de la marcha analtica del grupo III sealando cmo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

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AUTOEVALUACIN

1. Los hongos son microorganismos ___________________ debido a que presentan ncleo verdadero. A) procariotes B) eucariotes C) protozooarios D) viroides BLOQUE 2. El microorganismo mostrado a continuacin pertenece al de: A) bacterias B) levaduras C) priones D) mohos 3. La estructura sealada en el esquema corresponde a: A) esporangio B) conidio C) micelio D) hifa

grupo

4. Qu funcin tiene la estructura sealada? A) Perpetuar la especie. B) Contener a las esporas. C) Absorber los nutrientes. D) Fijar los filamentos. FIN DE BLOQUE 5. De las siguientes caractersticas, selecciona las que correspondan a un moho: I. Producen coloniales filamentosas multicelulares. II. Se reproducen por gemacin. III. Producen colonias blandas, opacas y de color cremoso. IV. Producen esporas para incrementar su supervivencia. V. Se pueden reproducir sexualmente. A) I, IV, V B) II, III C) I, II, V D) III, IV

6. Las levaduras son hongos _______________ y su principal forma de reproduccin es ___________________. A) macroscpicos/ esporulacin B) unicelulares/ gemacin C) multicelulares/ sexual D) microscpicos/ sexual 7. Selecciona el gnero que corresponda a una levadura: A) Mucor B) Penicillium C) Aspergillus

D) Saccharomyces

8. El siguiente gnero de hongo contiene a una especie causante de infecciones vaginales: A) Candida B) Saccharomyces C) Trichosporon D) Schizosaccharomyces 14

9. El medio de cultivo utilizado en el laboratorio para promover el crecimiento de hongos fue: A) Sabouraud dextrosa B) Agar nutritivo C) Sal y manitol D) Micosel 10. Qu caracterstica presentan los medios de cultivo destinados para el crecimiento de hongos, que hacen posible la inhibicin del crecimiento de bacterias? A) Alta concentracin de sales B) Bajo pH C) Alto pH D) Baja concentracin de nutrientes BLOQUE 11. En la tcnica para aislar hongos del aire utilizada en el laboratorio, cunto tiempo debe mantenerse destapada la caja de Petri para captar a estos microorganismos? A) 10 min B) 15 min C) 20 min D) 30 min 12. Cul fue la temperatura a la que se incub la caja de Petri despus de su tiempo de exposicin al aire? A) Temperatura ambiente B) 25 C C) 37 C D) 40 C 13. Cunto tiempo debe incubar la caja de petri para observar crecimiento? A) 24 horas B) 48-72 horas C) 1 semana D) 3 semanas 14. En la observacin de las estructuras de los mohos que crecieron en el medio de cultivo se utiliz el/los objetivo(s): A) 10X y 40X B) 10X, 40X, inmersin C) Solo 40X D) Solo inmersin 15. Para qu sirve un microcultivo? A) Distinguir las esporas B) Identificar la especie del moho C) Observar la estructura completa del moho D) Aislar metabolitos del moho 16. En el aislamiento de hongos del suelo, cul fue el objetivo de hacer las dilusiones? A) Obtener solo levaduras del suelo B) Obtener colonias aisladas C) Purificar la muestra del suelo D) Aislar a las bacterias presentes en el suelo FIN DE BLOQUE 17. Cul fue el colorante utilizado en la tincin de hongos? A) Azul de metileno B) Cristal violeta C) Safranina D) Azul de algodn lactofenol

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18. Ordena los pasos que se siguieron para la tincin de hongos en el laboratorio: I. Dilacerar el fragmento de la colonia con la misma asa II. Con el asa tomar un pequeo fragmento de colonia y depositarlo en el portaobjetos III. Colocar sobre la preparacin un cubreobjetos evitando formar burbujas IV. Observar al microscopio V. Sobre el portaobjetos depositar una gota de colorante A) V, II, I, III, IV B) I, II, V, III, IV C) II, I, V, III, IV D) I, II, III, V, IV 19. Se concluye que una prueba bioqumica de la catalasa es positiva en levaduras cuando: A) Se tie de morado al trmino de la aplicacin de todos los reactivos B) Se tie de azul al trmino de la aplicacin de los reactivos C) Aparece un precipitado negro D) Aparecen burbujas despus de agregar el reactivo 20. El reactivo utilizado en la prueba de la catalasa fue: A) Agua oxigenada B) Azul de metileno C) Cristal violeta

D) Lugol

BLOQUE 21. La NOM-111SSA1-1994 cuyo objetivo es el conteo de hongos en alimentos, seala que el medio de cultivo a utilizar es: A) Agar Sabouraud dextrosa B) Agar Micosel C) Agar papa dextrosa D) Agar sal manitol 22. Cul es el valor del pH que adquiere el medio de cultivo despus de la preparacin con los reactivos correspondientes? A) 1 B) 3.5 C) 5.6 D) 7.2 FIN DE BLOQUE 23. Qu diferencia un anlisis cualitativo de uno cuantitativo? A) El anlisis cualitativo muestra solo cules son los componentes de la muestra B) El anlisis cualitativo utiliza mtodos volumtricos y gravimtricos C) El anlisis cualitativo permite conocer la concentracin de las sustancias que conforman la muestra D) El anlisis cuantitativo utiliza exclusivamente el mtodo de precipitacin 24. El equilibrio qumico se alcanza cuando: A) Las velocidades de reaccin inversa y directa se igualan B) Las concentraciones de reactivos y productos se igualan C) Se forman algunas molculas de producto D) Desaparece el precipitado de los productos

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25. Si una reaccin qumica se representa por la siguiente ecuacin aA + bB cC + dD cul sera la expresin de su constante de equilibrio? A) B) C)

26. Si en un experimento se lleva a cabo una reaccin qumica y sta alcanza el equilibrio, qu ocurrir si se le adiciona una mayor cantidad de reactivo? A) No hay afectacin en el equilibrio B) El equilibrio se desplaza hacia la derecha C) El equilibrio se desplaza hacia la izquierda D) Se igualan las concentraciones de reactivos y productos BLOQUE 27. Los siguientes son cationes que conforman al primer grupo analtico, Excepto: A) plomo B) fierro C) mercurio D) plata 28. El reactivo que hace posible la precipitacin de todos los cationes en el primer grupo analtico es: A) HCl B)HNO3 C) H2SO4 D) H2S 29. Al adicionar agua hirviendo a los precipitados retenidos por el papel filtro, esta agua disolver nicamente al precipitado de: A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata 30. Al adicionar el reactivo hidrxido de amonio, ste disolver solamente al precipitado de: A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata 31. Al agregar a un filtrado unas gotas de KI, el color amarillo que se presenta indica la presencia de: A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata 32. Al agregar a un filtrado unas gotas de cido ntrico concentrado, la presencia de un precipitado blanco nos indicar la existencia del catin: A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata 33. Si al final del experimento aparece un residuo negro en el papel filtro, esto es prueba suficiente de la presencia de: A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata FIN DEL BLOQUE 34. Los siguientes son cationes del grupo analtico II, excepto: A) aluminio B) cromo C) sodio 17

D) hierro

35. El reactivo que precipita a los cationes en el grupo III es: A) sulfuro de amonio B) hidrxido de amonio C) cido sulfhdrico D) cido clorhdrico

RESPUESTAS A LA AUTOEVALUACIN 1B 11 D 21 C 31 A 2D 12 A 22 B 32 D 3B 13 B 23 A 33 B 4B 14 A 24 A 34 C 5A 15 C 25 C 35 A 6B 16 B 26 B 7D 17 D 27 B 8A 18 A 28 A 9A 19 D 29 A 10 B 20 A 30 D

BIBLIOGRAFA
Atlas, R. M., Microbiologa, Fundamentos y Aplicaciones, 4. edicin, Editorial CECSA, Mxico, 1990. Batel, Janet S., Microbiologa Mdica, Edt. El manual moderno, Mxico, 2002. Brumblya, Ray U., Anlisis cualitativo, 17. edicin, CECSA, Mxico, 1979. Charlot, G., Anlisis Cualitativo rpido de cationes y aniones, 2. edicin, Alhambra, Mxico, 1998. Collins, C. H., Lyne, Patricia M., Mtodos microbiolgicos, 3. Edicin, Editorial Acribia, Espaa, 1992. Freeman, Bob A., Microbiologa de Burrows, 22. edicin, Editorial Interamericana, Mxico, 1989. Holkova Ludmila., Qumica analtica cualitativa, Teora y prctica, 2. edicin, Trillas, Mxico, 1993. Konerman, Elmer W., Diagnstico Microbiolgico, 17 edicin, Editorial Panamericana, Argentina, 1999. Pelczar, Reid, Chan., Microbiologa, 4 edicin, Mc Graw Hill, Mxico, 1993. Stanier, Roger Y., Microbiologa, 4 edicin, Repla, Mxico, 1986. Urmeneta Begoa, Alonso., Microbiologa, Editorial Masson, Espaa, 1999

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ANEXO 1 MANUAL DE LABORATORIO PRCTICA 1. AISLAMIENTO DE HONGOS Y LEVADURAS DEL AIRE Y SUELO
OBJETIVO: Aplica las tcnicas para aislar hongos y levaduras del aire y del suelo para conocer sus caractersticas morfolgicas y estructurales. INTRODUCCIN La mayora de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energa por respiracin o fermentacin de materiales orgnicos solubles presentes en estos ambientes. El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el portador de aerosoles biolgicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar cargados de los diversos grupos de microorganismos. De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del suelo, de la vegetacin y del mar. Algunos de los gneros ms comnmente aislados del aire son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium, entre otros. Todos los hongos se reproducen por esporulacin. Cuando la espora se encuentra en un medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o ms tubos germinativos que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan HIFAS, las cuales pueden ramificarse despus. En algunas especies se forman septas a lo largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeos compartimentos como una caa de bamb llamndose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septacin y el protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describindose entonces como HIFA NO SEPTADA CENOCITICA. En la mayora de los hongos las hifas son septadas. A medida que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructferos grandes y de estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misin es la de dispersar el hongo a nuevos hbitats. Algunos hongos tambin producen esporas sexuales formadas como resultado de la reproduccin sexual. Las que estn encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de una hifa o basidio se denominan BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la clasificacin e identificacin de los hongos. Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prcticamente hay tres grupos importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso o frutas. Presentan una gran variedad de formas y tamaos. Cada filamento crece fundamentalmente en el pice, por extensin de la clula terminal. Las levaduras son hongos unicelulares y la mayora son Ascomicetos. Normalmente tienen forma oval o cilndrica y su principal forma de reproduccin es la gemacin, se desarrollan bien en hbitats con abundante azcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los rboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnolgica en la industria cervecera y de la panificacin y en la produccin de protena de origen unicelular (Biomasa). El principal agente de la fermentacin alcohlica es Sacharomyces cerevisiae. Las setas son hongos filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que forman cuerpos fructferos denominados setas y que producen basidiosporas como esporas sexuales. Una actividad ecolgica muy importante de los Basidiomycetes, es la descomposicin de la madera, papel, ropa y otros derivados de productos naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son capaces de producir Celulasas con actividades degradantes de lignina que utilizarn como fuente de carbono y energa. MATERIALES Y EQUIPO Caja Petri conteniendo medio de Saboureaud dextrosa agar (SDA). Asa bacteriolgica. 2 Cajas Petri, conteniendo cada una un portaobjetos, un cubreobjetos y un trozo de papel filtro, estriles. Caja Petri conteniendo medio de SDA en capa muy delgada. Cajas de Petri vacas y estriles. Pinzas de diseccin. Agua destilada estril. Cinta para enmascarar.

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Mechero Bunsen. Encendedor. Microscopio. 1 gramo de tierra. Medio Sabouraud dextrosa o Papa dextrosa. Tubos con solucin salina isotnica, o bien, agua estril. Pipetas de 1 mL estriles.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES A. Aislamiento de hongos del aire. 1. Tomar una placa de medio de SDA. 2. Abrir la placa y exponerla al aire en cualquier sitio por espacio de media hora y colocar de nuevo la tapa en su sitio. 3. Incubar por 48-72 horas o ms a temperatura ambiente. Nota: Los pasos anteriores del desarrollo experimental se realizan previa a la prctica de laboratorio para contar ya con el crecimiento de hongos. 4. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores. 5. Describir las observaciones hechas. 6. Anotar las caractersticas de las colonias seleccionadas para hacer los microcultivos, ya que esta informacin es un criterio importante para la identificacin del moho. B. Observacin de las estructuras de los hongos. Observacin directa 1. De las colonias de hongos aislados, tomar nota de sus caractersticas: Forma, aspecto del micelio (algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentacin, elevacin, consistencia, etc. (Hacer la descripcin y esquema de tres colonias de hongos aisladas)

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

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2. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriolgica con un pequeo ganchito en la punta, desprender una pequea porcin. 3. Extender el material obtenido en una gota de agua puesta sobre un portaobjetos y colocar con cuidado un cubreobjetos sobre ste. 4. Examinar al microscopio con objetivo seco dbil buscando estructuras representativas. 5. Dibujar las observaciones hechas.

6. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar mejor las estructuras seleccionadas, procurando que stas presenten la arquitectura completa del hongo para facilitar su identificacin. 7. Dibujar las observaciones hechas: Seco dbil. Seco fuerte.

Microcultivo 1. Tomar una caja Petri que contenga dentro un crculo de papel filtro del dimetro de la caja, un portaobjetos y un cubreobjetos estriles. 2. Con el asa estril y en ngulo recto, cortar en cuadritos de aproximadamente 3 a 5 mm por lado el medio de SDA en capa delgada contenido en una caja Petri, tomar un cuadrito y colocarlo en condiciones aspticas en el centro del portaobjetos, levantando la tapa de la caja slo lo suficiente. 3. En condiciones aspticas, tomar una pequea porcin del cultivo por estudiar con el asa bacteriolgica en ngulo recto y depositarla cuidadosamente sobre el cuadrito de agar en el portaobjetos dentro de la caja Petri. 4. Levantando con la mano izquierda la tapa de la caja Petri y con unas pinzas ligeramente flameadas en la mano derecha, tomar el cubreobjetos y colocarlo sobre el cuadrito de agar inoculado, procurando que quede bien centrado y aprisionndolo ligeramente para que se adhiera. 5. Con un gotero que contenga agua estril depositar las gotas necesarias sobre el papel filtro hasta lograr que ste se humedezca completamente. 6. Cerrar la caja y sellarla con un poco de cinta para enmascarar. 7. Incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Nota: El registro y observacin del crecimiento del hongo se har en la prctica 2.

B. Aislamiento de hongos del suelo. 1. Preparar de 5 tubos con 9 ml de agua destilada, o bien, solucin salina isotnica, esterilizar y numerar del 1 al 5. 2. Se suspende en el tubo 1, un gramo de muestra a analizar (tierra).

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3. Homogenizar perfectamente la prueba. 4. Con ayuda de una pipeta estril, tomar 1 ml del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2 y mezclar; con otra pipeta estril, se toma una alcuota de 1 ml y se lleva al tubo 3; as sucesivamente hasta llegar al tubo 5. 5. De la ltima caja, tomar 1 ml y depositarla en la placa de Petri estril y vaca. 6. Adicionar aproximadamente 20 ml del medio Papa dextrosa o Sabouraud Dextrosa estril, fundido y enfriado a 45C. 7. Homogenizar por rotacin de las placas sobre la mesa. 8. Dejar solidificar e incubar a 28C por 4 a 5 das. 9. Hacer observaciones cada 48 hrs. hasta la aparicin de colonias caractersticas de hongos. Esquema de trabajo: 1 g de tierra 9 ml de agua estril

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CUESTIONARIO 1. Dibuja las estructuras de 3 hongos de diferente gnero (especificando el gnero al que pertenecen).

Gnero: _________________________

Gnero: __________________________

Gnero: _______________________

2. Describir otra tcnica de aislamiento de hongos. _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

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_____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________

3. Consultar en qu consiste el medio de Micosel y cul es su utilidad. _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ 4. Mencionar la importancia de los hongos en Microbiologa Ambiental. _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluacin de la prctica 1. Calificacin del examen previo. 2. Desinfect correctamente el rea de trabajo. 3. Trae su material completo (guantes, cubrebocas, muestras, etc.) 4. Registro de resultados completos. 5. Cuestionario completo y correcto. 6. Conclusiones concretas 7. Entrega el material limpio. Calificacin final.

Valor 3 1 1 5 6 3 1 20

Puntos

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PRCTICA 2. TINCIN DE HONGOS Y LEVADURAS

OBJETIVO: Aplica las tcnicas para teir hongos y levaduras con la finalidad de hacer una descripcin morfolgica microscpica de los mismos. INTRODUCCIN En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin, estructura, tamao, composicin entre otros aspectos; cuando se compara a los hongos con las bacterias, en general stos tienen requerimientos nutricionales muy simples pero su desarrollo es ms lento, por lo que requieren mayor tiempo de incubacin para su cultivo. La diversidad ms notable la presentan en sus propiedades morfolgicas y en sus ciclos sexuales siendo estas caractersticas los criterios que se emplean en la identificacin y clasificacin de este grupo. Las caractersticas estructurales incluyen: tipo de talo, morfologa microscpica del micelio tanto areo como profundo, tipo de hifas, diferenciacin y disposicin o agrupacin de las mismas, tipo de hifas reproductivas asexuales, estructura y modo de formacin del cuerpo fructfero sexual, tipo de espora (forma, tamao, aspecto externo, agrupacin, tabicacin, color, movilidad, tipo y nmero de flagelos). Por lo regular, los hongos se examinan en preparaciones hmedas, para tomar una muestra del micelio a partir de un cultivo puro o de un tejido enfermo, se utilizan asas rgidas y ligeramente planas, se pueden emplear un trozo de cinta adhesiva transparente ligeramente adherida al asa o un buen par de pinzas, esta preparacin debe hacerse con mucho cuidado para evitar que las esporas y otras estructuras se destruyan, lo que se evita tomando un trozo de agar con el desarrollo del hongo, la muestra se coloca en un portaobjetos, se calienta ligeramente para difundir el agar, se coloca una gota de azul de lactofenol y se tapa con un cubreobjetos, examinndose con los objetivos de 10x y 40x, la observacin de hongos tambin se facilita agregando solucin de hidrxido de potasio del 10 al 20 %, sta tiene la propiedad de aclararlos hacindose ms transparentes, quizs las preparaciones ms adecuadas resultan cuando a la potasa o a una solucin salina se le agrega una pequea cantidad de eosina diluida, el examen microscpico de las levaduras se facilita agregando yodo a la preparacin hmeda, con lo que los grnulos de almidn se tien de azul.

En el aislamiento y cultivo de la mayora de los hongos (patgenos o saprfitos) se aprovechan ciertas caractersticas especiales de los hongos, tales como, su tolerancia al pH cido, su preferencia por medios de cultivo con gran cantidad de azcar fermentable, su resistencia a la penicilina y estreptomicina permite usar estos antibiticos, los que al ser agregados a los medios de cultivo, reducen el nmero de bacterias contaminantes. En la preparacin de medios de cultivos, los miclogos, utilizan mezclas de vegetales (agar-papa, agar-harina de maz, etc.) y otras substancias naturales. Para estudiar a los hongos se dispone de dos tipos especiales de cultivos, el cultivo de portaobjetos o microcultivo y el cultivo en cajas de Petri. Los microcultivos se pueden observar directamente da a da, lo que permite hacer el seguimiento del desarrollo del hongo en estudio.

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Los cultivos en placa se obtienen sembrando por picadura, el centro de las cajas que contienen diferentes medios, a simple vista .el aspecto de las colonias es a veces tan caracterstico, que permite identificar enseguida el tipo de hongo.

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MATERIAL Colonias de hongos aisladas en la prctica anterior. Tubos con medio PDA o SDA. Colorante azul de algodn. Porta y cubre objetos. Mechero de Bunsen. Microscopio. Asa micolgica.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES A) Microcultivo. 1. De la prctica anterior, observa el crecimiento en el cuadrito de agar a simple vista (debe haber desarrollo visible fuera del cuadrito del agar). Tener mucho cuidado, para evitar destruir la estructura del hongo. 2. Abrir la caja, sacar la preparacin, secarla con gasa por debajo del portaobjetos si est hmedo, y observarlo al microscopio con objetivo seco dbil y el condensador muy bajo para reducir la cantidad de luz. 3. Cambiar al objetivo seco fuerte para distinguir mejor la estructura del hongo. 4. Dibujar lo observado: Seco dbil, Seco fuerte.

Seco dbil

Seco fuerte

5. Comparar la estructura observada con las mostradas en dibujos y lminas para aproximarse a la identificacin del microorganismo: ____________________________________________________________________________________________________________ B) Tcnica de observacin microscpica en fresco. 1. Observar el crecimiento de hongos desarrollado a partir de la muestra de suelo. 2. Seleccionar 3 diferentes hongos y describir su morfologa.

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Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

3. Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodn lactofenol. 4. Con el asa micolgica tomar un pequeo fragmento de la colonia y colocarlo sobre el porta objetos. 5. Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de hongos con esporulacin abundante). 6. Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de diseccin o bien con la misma asa micolgica. 7. Colocar sobre la preparacin un cubre objeto evitando formar burbujas de aire. 8. Observar al microscopio a seco dbil y seco fuerte, nunca usar aceite de inmersin. Nota: La tincin es para cada uno de los hongos observados. 9. Dibujar las estructuras observadas al microscopio para cada preparacin: Preparacin 1 Preparacin 2 Preparacin 3

Seco dbil (10x)

Seco fuerte (40x)

10. Seala sobre el esquema las estructuras observadas con su respectivo nombre. CUESTIONARIO 1. Defina el trmino hifa y micelio: _________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________

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2. Mencione la clasificacin del micelio segn: a. Funcin: ___________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ b. Dimetro: __________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ c. Continuidad: ________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ d. Coloracin: _________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ 3. Por la morfologa macroscpica y microscpica, puede identificarse el tipo de hongo? por qu? _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ 4. Mencione los parmetros utilizados en la lectura de morfologa colonial de hongos: ________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluacin de la prctica 1. Calificacin del examen previo. 2. Desinfect correctamente el rea de trabajo. 3. Trae su material completo (guantes, cubrebocas, muestras, etc.) 4. Registro de resultados completos. 5. Cuestionario completo y correcto. 6. Conclusiones concretas 7. Entrega el material limpio. Calificacin final.

Valor 3 1 1 5 6 3 1 20

Puntos

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PRCTICA 3. METABOLISMO DE LEVADURAS: PRUEBAS BIOQUMICAS

OBJETIVO: Utilizar las pruebas bioqumicas en la identificacin de procesos metablicos de levaduras.

INTRODUCCIN El estudio de los microorganismos con base a la descripcin de la morfologa colonial y microscpica no es suficiente para hacer una identificacin satisfactoria, es por ello que se tiene que recurrir al estudio de su comportamiento fisiolgico, es decir, cmo utilizan los nutrimentos y qu sustancias producen. Para lograr esto existen un gran nmero de pruebas metablicas que nos permiten llegar a la caracterizacin de un microorganismo dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos qumicos que ocurren dentro de un microorganismo y se dividen en: anabolismo y catabolismo. El primero se refiere a las reacciones bioqumicas que suceden en la clula para formar macromolculas, y el segundo representa las reacciones que estn involucradas en el rompimiento de los sustratos con el propsito de suplir la energa utilizada en el anabolismo. Las tres principales vas metablicas que conducen a la formacin de energa (ATP) son: a) Fermentacin b) Respiracin c) Fotosntesis La fermentacin es un proceso anaerbico en el cual tanto los donadores como los aceptores de electrones son compuestos orgnicos. Estos compuestos incluyen carbohidratos, cidos orgnicos, cidos grasos y aminocidos entre otros. La mayora de los microorganismos prefieren a los carbohidratos y especialmente a la glucosa. En general, los productos de la fermentacin de los carbohidratos son cidos, alcoholes, cetonas y gas. Se requiere una combinacin de pruebas bioqumicas y morfolgicas para identificar las levaduras. En las caractersticas morfolgicas debe incluirse el color de las colonias, la medida y la forma de las clulas, la presencia de cpsula, la produccin de hifas o pseudohifas, y la produccin de clamidiosporas. Las pruebas bioqumicas incluyen la asimilacin y fermentacin de azcares y la asimilacin de nitrato.

MATERIAL Cajas de petri con gelosa almidn Tubos de ensaye de 13 x 100 mm Asa micolgica Hisopo de algodn Portaobjetos Estufa H2O2 al 30 % Solucin de lugol Solucin de rojo de metilo Caldo rojo de metilo Caldo Voges Proskauer Solucin de alfa naftol Solucin de KOH creatina Gelosa almidn Medio Kliegler Urea deshidratado Cloruro de benzalconio al 1 %

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DESARROLLO DE ACTIVIDADES De los cultivos previamente preparados, seleccionar una cepa de levadura y describir sus caractersticas macroscpicas y microscpicas (para esta ltima hacer la tincin). Esquema de la colonia de levaduras y descripcin:

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentacin: ______________________ Elevacin: _________________________ Consistencia: ______________________

Esquema de la observacin microscpica y descripcin.

______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________

Con la cepa seleccionada, hacer cada una de las pruebas bioqumicas indicadas a continuacin: A. Digestin de polisacridos (almidn). 1. 2. 3. 4. En una placa con gelosa almidn, sembrar por estra abierta la cepa seleccionada. Incubar a 37 C durante 24 horas. Aadir unas gotas de solucin de lugol alrededor del crecimiento y en una zona en donde no haya inoculado al microorganismo. El almidn intacto toma una coloracin azul violcea con el lugol.

Digestin de almidn positiva: aparicin de un halo claro alrededor de la estra. Digestin de almidn negativa: no se observa halo alrededor de la estra. Resultado: _________________________________________________________________________________________________ B. Fermentacin de azcares en medio de Kligler. 1. 2. 3. Inocular por picadura y en la superficie del tubo que contienen medio de Kliegler, la cepa seleccionada. Incubar a 37 C durante 24 horas. Observar el resultado e interpretarlo como sigue: Fermentacin de glucosa = vire del rojo de fenol (indicador de pH) de rojo a amarillo en el fondo del tubo. Fermentacin de lactosa = vire del indicador de rojo a amarillo en la superficie del medio de cultivo. Produccin de H2S = presencia de un precipitado negro en el medio de cultivo.

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Resultados: ___________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ C. Fermentacin de azcares. Prueba del rojo de metilo. 1. 2. 3. 4. Inocular la cepa seleccionada en el tubo con caldo rojo de metilo (RM). Incubar a 37 C durante 24 horas. Aadir al tubo 5 gotas de solucin de rojo de metilo (indicador de pH). Observar el resultado e interpretarlo como sigue: Prueba de rojo de metilo positiva = presencia de color rojo en todo el cultivo o cuando el reactivo permanece de ese color en la superficie del medio.

Resultado: ___________________________________________________________________________________________________ D. Fermentacin de azcares. Prueba de Voges Proskauer. 1. 2. 3. 4. 5. Inocular la cepa seleccionada en el tubo que contienen caldo VP. Incubar a 37 C durante 24 horas. Agregar los siguientes reactivos en el orden que se indica: 6 gotas de una solucin de alfa naftol. 2 gotas de una solucin de KOH creatina. Agitar el tubo suavemente y dejarlo en reposo a 37 C durante un tiempo de 20 a 30 minutos. Observar el resultado e interpretarlo como sigue: Prueba de VP positiva (produccin de acetil metilcarbinol) = presencia de color rojo en la superficie del medio de cultivo.

Resultado: ___________________________________________________________________________________________________ E. Prueba de la catalasa. Mtodo del portaobjetos. 1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio. 2. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. 3. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). 4. Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Resultado: ____________________________________________________________________________________________________

F. Prueba selectiva rpida para ureasa. Se realiza segn el siguiente procedimiento: Pasar un hisopo de algodn impregnado de substrato con urea deshidratado sobre la superficie de dos o tres colonias, de modo que la punta se cubra con el microorganismo. Colocar el hisopo con la levadura dentro de un tubo que contenga 3 gotas de cloruro de benzalconio al 1% (pH 4,86 0,01) y rotar con firmeza contra el fondo para poner en contacto los microorganismos con las fibras de algodn. Tapar el tubo e incubar a 45 C durante 30 minutos. Examinar a los 10, 15, 20 y 30 minutos para detectar un cambio de color de amarillo a prpura. Un color rojo a prpura indica produccin de ureasa.

1. 2. 3. 4.

Resultados: ___________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

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CUESTIONARIO 1. Cules son los valores de pH a los que viran los siguientes indicadores? Rojo de fenol: ________________________________________ Rojo de metilo: _______________________________________ 2. Indica de qu compuesto proviene el acetil metil carbinol, as como la reaccin que se lleva a cabo entre el mismo, el alfa naftol y el reactivo de KOH creatina. ________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ 3. Describe la levadura estudiada de acuerdo a sus caractersticas metablicas. _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluacin de la prctica 1. Calificacin del examen previo. 2. Desinfect correctamente el rea de trabajo. 3. Trae su material completo (guantes, cubrebocas, muestras, etc.) 4. Registro de resultados completos. 5. Cuestionario completo y correcto. 6. Conclusiones concretas 7. Entrega el material limpio. Calificacin final.

Valor 3 1 1 5 6 3 1 20

Puntos

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PRCTICA 4. MTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

OBJETIVO: Realizar adecuadamente el conteo de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano, mediante el mtodo de cuenta en placa, de acuerdo a los lineamientos de la NOM-111-SSA1-1994. INTRODUCCIN Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos. Mohos El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificacin y clasificacin de los mohos se basa en observaciones macroscpicas y microscpicas. En comparacin con la mayora de las levaduras y de las bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podran considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor de los 25 a 30C, aunque algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que algunos se utilicen para la produccin industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas. Algunos gneros de mohos importantes en alimentos. Mucor. Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de quesos y para la fabricacin de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial de cido ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin de ciertos alimentos orientales y en la obtencin de enzimas. Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos txicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor; el cido ciclopiaznico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y cido peniclico tambin son producidas por especies de Aspergillus, las txinas tremorgnicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Penicillium. Es otro gnero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas ctricas. Las especies P. camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduracin de quesos. Se han reportado ms de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la funcin heptica o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, cido ciclopiaznico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el cido secalnico. De stas la ocratoxina A es sin duda la ms importante, es un carcingeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a travs de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos. Levaduras

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El trmino levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemacin o por fisin. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, tambin se utilizan en la obtencin de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos. Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin microscpica. Su forma puede ser desde esfrica a ovoide, alimonada, piriforme, cilndrica, triangular e incluso alargada. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin multicelular o por gemacin polar. Unas pocas especies se reproducen por fisin. En los cultivos en placas de agar es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observacin microscpica de los microorganismos es la nica forma segura de diferenciarlas. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son hmedas y algo mucosas; la mayora de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metablica es a la vez de ambos tipos. La mayora de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayora de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura ptima en torno a los 25 a 30C y una temperatura mxima en torno a los 35 a 47C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azcares son la fuente energtica ms apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los cidos orgnicos y el alcohol. Algunos gneros de importancia en alimentos son: Schizosaccharomyces. Levaduras de este gnero se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentacin del pan, fermentacin de la cerveza, fermentacin de los vinos, en la produccin de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtencin de productos lcteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este gnero son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azcar (osmfilas), intervienen en la alteracin de la miel, jarabes y melazas, y tambin en la fermentacin de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los lquidos formando una pelcula. P. membranafaciens produce una pelcula en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman pelcula en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limn y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fbricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lcteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos cidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtencin de protena unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lcteos. C. lipolytica produce alteracin de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de cido e intervienen en la fermentacin de la cerveza belga de tipo lambic, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrndose en las fbricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut. FUNDAMENTO El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para este tipo de microorganismos. NOTA La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya que es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano.

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MATERIAL 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril. 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn. 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa. 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta. Vaso de licuadora estril. Motor para licuadora. Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn. Pipetas Pasteur estriles. Propipeta. Cajas de Petri estriles. Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc. Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251C. Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 451C. Portaobjetos, cubreobjetos, diurex. Microscopio ptico. Asa bacteriolgica y asa micolgica. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador. Solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2. Agua peptonada al 0.1 %. Agar papa dextrosa. Agar extracto de malta. Solucin colorante de lactofenol azul de algodn. Colorantes para tincin de Gram. Solucin estril de cido tartrico al 10.0 %.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril y homogeneizar durante 10.0 seg a velocidad mnima. Esta es la dilucin primaria. 3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin.
NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de la muestra (a mayor tiempo de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneizacin citados en esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano.

4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro.

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8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra. 10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C. 12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. 13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan desarrollado. 14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.

DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solucin diluyente

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia

Homogenizar con 90 ml de solucin

10-1

10-2

10-3

10-4

Adicionar de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa y/o agar extracto de malta acidificados con 0.3 ml de cido tartrico al 10 % enfriado a 45 C en cada placa.

Depositar por duplicado 1 ml de cada dilucin en cajas de Petri

Homogeneizar la muestra con el agar mediante movimientos rotatorios.

Incubar las cajas en posicin invertida 3, 4 o 5 das.

Contar aquellas placas que tengan entre 10 y 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar por separado como UFC/g o ml de muestra, indicando tiempo de incubacin.

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RESULTADOS Seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilucin correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la dilucin correspondiente. En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL. Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de incubacin en el que se realiz la cuantificacin. Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el resultado de la cuantificacin de hongos y de levaduras. Clculos

UFC/ml de hongos= ___________________ Tiempo de incubacin:_____________________

UFC/ml de levaduras = ________________________ Tiempo de incubacin = _______________________

Observaciones macroscpicas de los diferentes tipos de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis:

I.

II.

III.

IV.

V.

VI.

Observacin microscpica de los diferentes tipos de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis (previa tincin):

37

I.

II.

III.

IV.

V.

VI.

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluacin de la prctica 1. Calificacin del examen previo. 2. Desinfect correctamente el rea de trabajo. 3. Trae su material completo (guantes, cubrebocas, muestras, etc.) 4. Registro de resultados completos. 5. Conclusiones concretas 6. Entrega el material limpio. Calificacin final.

Valor 3 1 1 5 9 1 20

Puntos

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PRCTICA 5. EQUILIBRIO QUMICO

OBJETIVO: Predecir en qu sentido avanzar una reaccin cuando se altera la situacin de equilibrio debido a un cambio en la concentracin de alguna de las especies reactivas. INTRODUCCIN La mayora de las reacciones qumicas son reversibles, al menos en cierto grado. Al inicio de un proceso reversible, la reaccin procede hacia la formacin de productos. Tan pronto como se forman algunas molculas de producto, comienza el proceso inverso: estas molculas reaccionan y forman molculas de reactivo. El equilibrio qumico se alcanza cuando las velocidades de las reacciones directa e inversa se igualan y las concentraciones netas de reactivos y productos permanecen constantes. El equilibrio qumico es, por tanto, un proceso dinmico. Los equilibrios qumicos son importantes para explicar un gran nmero de fenmenos naturales, y desempean papeles importantes en muchos procesos industriales. Para una reaccin reversible de la forma: aA + bB cC + dD

a, b, c y d son los coeficientes estequiomtricos de las especies reactivas A, B, C y D y la constante de equilibrio viene dada por la expresin:

Esta expresin se deduce de la ley de accin de masas que establece que para una reaccin reversible en equilibrio, y a una temperatura constante, una relacin determinada de concentraciones de reactivos y productos tiene un valor constante K llamado constante de equilibrio. Decimos que esta relacin es la expresin de la constante de equilibrio. Los corchetes de la ecuacin significan concentraciones molares. Es importante resaltar que aunque las concentraciones pueden variar, el valor de K para una reaccin dada permanece constante, siempre y cuando la reaccin est en equilibrio y la temperatura no cambie. El equilibrio qumico representa un balance entre las reacciones directa e inversa. Hay diversos factores experimentales que pueden alterar este balance y desplazar la posicin del equilibrio para que se forme mayor o menor cantidad de un determinado producto. Las variables que se pueden controlar en forma experimental son: concentracin de reactivos o productos, presin, volumen y temperatura. El principio de Le Chtelier establece que si un sistema en equilibrio se perturba por un cambio de temperatura, presin o concentracin de uno de los componentes, el sistema desplaza su posicin de equilibrio de modo que se contrarreste el efecto de la perturbacin, hasta alcanzar un nuevo estado de equilibrio. En esta prctica vamos a aplicar el principio de Le Chatelier observando cmo afectan los cambios de concentracin a la posicin del equilibrio de una reaccin qumica. MATERIAL 1 vaso de precipitados de 250 mL. 1 gradilla. 5 tubos de ensayo. 1 pipeta. 1 varilla de vidrio. Solucin de NaOH 2 M. Solucin de HCl 0.1 M. Solucin de KSCN 0.1 M. Solucin de FeCl3 0.1 M.

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DESARROLLO DE ACTIVIDADES 1. En un vaso de precipitados de 250 mL adicionar 1 mL de una disolucin de FeCl3 0.1 M, 1 mL de KSCN 0.1 M y 50 mL de agua. El in SCN- y el in Fe+3 reaccionan inmediatamente dando lugar al in tiocianato de fierro (III), de color rojo, establecindose el siguiente equilibrio:

La intensidad del color rojo nos indicar, de manera cualitativa, la cantidad de dicho in en la mezcla en equilibrio. 2. La disolucin preparada se dividir en cuatro partes iguales, aproximadamente, que se colocarn en cuatro tubos de ensayo: - El primero de estos tubos de ensayo se deja como muestra de referencia. - Al segundo tubo se le aadir, gota a gota, una disolucin de cloruro de hierro (III). - Al tercero se le aade, tambin gota a gota, una disolucin de KSCN. - Al cuarto se le aade, gota a gota, una disolucin de NaOH 2 M. Realice un esquema de lo ocurrido en cada tubo de ensaye:

Referencia

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

CUESTIONARIO 1. Escribe la expresin de la constante de equilibrio correspondiente a la formacin del [Fe(SCN) 6]-3.

2. Explicar, segn el principio de Le Chatelier y en funcin del cociente de reaccin, los cambios cualitativos que se producen en la composicin de la mezcla en equilibrio al aadir los diferentes reactivos. Adicin de FeCl3(ac): ___________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________

Adicin de KSCN(ac): ___________________________________________________________________________________

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_____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________

Adicin de NaOH(ac): ___________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________

3. Explicar y escribir qu reaccin tiene lugar al aadir la disolucin de NaOH(ac) 2 M: ________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluacin de la prctica 1. Calificacin del examen previo. 2. Preparacin adecuada de reactivos. 3. Utiliza correctamente el material de laboratorio. 4. Registro de resultados y cuestionario completos. 5. Conclusiones concretas 6. Entrega el material limpio. Calificacin final.

Valor 3 3 3 5 5 1 20

Puntos

41