MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DE MICROBIOLOGA

Fecha entra vigencia AO 2000 Fecha actualizacin Noviembre 2011 ltima N de actualizaciones 3 Fecha Prxima revisin Noviembre 2016

En este manual se describen los procedimientos tcnicos de exmenes microbiolgicos y de bioqumica de deposiciones

ACTUALIZADO POR: Tecnlogos Mdicos de Seccin Microbiologa Unidad de Laboratorio Clnico Mdico Microbilogo

REVISADO POR: Mdico Microbilogo Gerencia de Calidad

APROBADO POR

_______________________ TM Patricio Gaviln Jefe Unidad Laboratorio Clnico y Banco de Sangre Hospital Padre Hurtado

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INDICE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE MICROBIOLOGA

N 1 2 Nombre procedimiento Siembra de muestras para cultivos aerbicos Tinciones 1. Tincin de Gram 2. Tincin de Kinyou 3. Tinta china 4. Tincin violeta-bicarbonato 5. Leucocitos fecales 6. Tincin de azul de toluidina para Pneumocystis jiroveci Mtodos convencionales y rpidos de identificacin de bacterias aerobias Procedimiento de urocultivo Coprocultivo Hemocultivo Cultivo punta de catter Cultivos de lquidos estriles 1. LCR 2. L. peritoneodilisis 3. Otros l. estriles (articular, pericrdico, asctico, pleural, amnitico) Cultivos de secreciones del aparato respiratorio superior 1. Ocular, conjuntival 2. Otica 3. Farngea 4. De senos paranasales Cultivos de secreciones del aparato respiratorio inferior 1. Expectoracin 2. Aspirado endotraqueal 3. Lavado broncoalveolar Cultivos de secreciones de piel y tejidos blandos 1. Secrecin de herida, absceso, lcera 2. Tejido (biopsia) Cultivos de tejido seo Cultivos de secreciones intraabdominales Cultivos de secreciones del aparato genital 1. Uretral 2. Endocervical 3. Secrecin o flujo vaginal Cultivos microbiolgicos de insumos clnicos: 1. Hemoderivados 2. Nutricin parenteral Procedimiento de estudio de susceptibilidad a antibiticos 1. Antibiograma por difusin 2. Antibiograma por E-test (difusin-dilucin en agar) 3. Deteccin de betalactamasa 4. Estudio de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) Cultivos de bacterias anaerobias Procedimientos tcnicos de diagnstico de parasitologa clnica Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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1. 2. 3. 4. 5. 18 19

Parasitolgico seriado de deposiciones Test de Graham Gota gruesa Acarotest Tincin para Cryptosporidium (Ziehl Neelsen modificado)

Procedimientos tcnicos de diagnstico de micologa clnica Procedimiento tcnico para el diagnstico por inmunofluorescencia 1. Inmunofluorescencia para virus respiratorios 2. Inmunofluorescencia directa para Bordetella pertussis Mtodos de deteccin de antgenos y anticuerpos en microbiologa 1. Rotavirus 2. Deteccin de toxina de Clostridium difficile 3. Serologa para Mycoplasma pneumoniae 4. Reaccin de Widal Procedimientos tcnicos de exmenes bioqumicos en deposiciones 1. Test de Benedict 2. Test de Sudan 3. Test de guayaco o deteccin de hemorragias ocultas 4. Esteatocrito cido

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N 1. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA DE MUESTRAS PARA CULTIVOS AERBICOS

OBJETIVO Realizar el procedimiento de siembra de las muestras microbiolgicas que se reciben en laboratorio para cultivos aerbicos en forma correcta para obtener resultados confiables. Esto permite obtener colonias aisladas de microorganismos para proceder a su estudio (identificacin y susceptibilidad si corresponde). ALCANCE Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo y supervisin del procedimiento de siembra. Tcnico Paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos DEFINICIONES Siembra: tcnica de inoculacin de las muestras clnicas en los correspondientes medios de cultivo para ser sometidos a incubacin en las condiciones establecidas para cada tipo de muestra. Medio de cultivo: constitudo por sustancia nutritivas que permiten el desarrollo de diferentes microorganismos de acuerdo a sus requerimientos. Pueden tener suplementos nutritivos e inhibidores. Se clasifican segn estado fsico (slidos, lquidos y semislidos), presentacin (en placas o tubos) y contenido de nutrientes. Medios bsicos: son la base para la preparacin de otros medios, contienen los nutrientes esenciales, se desarrollan bacterias poco exigentes. Medios mejorados o enriquecidos: son los medios bsicos a los que se les ha agregado sustancias de alto valor nutritivo (por ejemplo sangre, vitamina) favoreciendo el desarrollo de bacterias ms exigentes. Medios selectivos: Medio al cual se le agrega un inhibidor que permite el desarrollo de solo ciertas bacterias, inhibiendo a otras ej. Agar MacConkey. Medios diferenciales: medios de cultivo que permiten diferenciar microorganismos porque ponen en evidencia caractersticas metablicas. Ej: agar citrato, agar Mac Conkey

DESARROLLO DEL PROCESO Insumos: Medios de cultivos slidos y/o lquidos de acuerdo a proceso a realizar, pipetas pasteur, asa de micrn, gradilla de tubos, portaobjetos, guantes, mascarillas Equipos: estufa de incubacin de atmsfera normal y de CO2, mechero, gabinete bioseguridad, vrtex, centfuga Software: Omega

Consideraciones generales: Mantener durante todo el proceso las precauciones estndares Utilizar tcnica asptica Durante el proceso mantener ventanas cerradas Realizar con mechero encendido, 5 centmetros proporciona un rea no contaminada Reunir todos los materiales necesarios para la siembra (placas, portaobjetos etc.) Mantener rea de trabajo despejada y cmoda para realizar procesos (slo con material necesario) Esterilizar las asas antes de usarlas y enfriarlas antes de tomar muestra. Entre cada placa siempre esterilizar el asa Marcar placas y porta objetos con el N de peticin de la muestra antes de la siembra Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 4 de 105

Procedimiento: 1. Tcnico paramdico de la seccin de microbiologa o urgencia (segn el horario) es responsable de la recepcin de la muestra, verificar el nombre en el frasco o trula con la orden de examen, ingreso al sistema informtico, e impresin de las etiquetas con cdigos de barra correspondientes para cada muestra (segn procedimiento de recepcin y almacenamiento de muestras biolgicas en el laboratorio Clnico, Manual de Toma de Muestras) 2. Prende el mechero, se coloca guantes de procedimiento y mascarilla. 3. Verifica nuevamente el nombre del paciente con la orden de trabajo. Revisa las placas y los tubos de medios de cultivo que corresponde utilizar segn el tipo de muestra, (revisar Tabla: Medios de cultivo para la siembra de muestras de microbiologa (anexo 1) que se encuentra en rea de siembra, frente a mechero.) 4. Etiqueta con los cdigos de barra las placas, tubo con caldo y portaobjeto (en caso necesario). 5. El procesamiento de la muestra para su siembra depender del tipo de muestra y de cmo haya sido tomada, a saber, en trula, lquidos y secreciones en recipientes estriles y trozos de tejido El principio general es siempre sembrar primero el (los) medio(s) de cultivo slido, luego el medio de cultivo lquido y por ltimo realizar frotis para tincin. Para determinar la secuencia en que deben ser sembrados los medios de cultivo, siempre de debe empezar por el medio menos selectivo, para seguir con el medianamente selectivo y al final el ms selectivo. (ver secuencia en anexo 1, orden de izquierda a derecha). A continuacin se describe la tcnica de siembra segn el tipo de medio de cultivo y de muestra.

6.

Siembra en placa Se obtiene colonia aisladas por medio del arrastre y separacin. Con el asa ya esterilizada, se toma una gota de lquido o de una emulsin del producto patolgico y se deposita en un costado del agar de una placa Petri, se estra a partir de ese. En caso de muestras que se reciben en trulas, se realiza con sta la primera de las estras procediendo despus a diseminar con el asa o pipeta. a. Esterilizacin simple: Utilizada principalmente para la mayora de las muestras. Se inocula en el primer cuadrante. Se esteriliza el asa slo una vez y luego se disemina el 2 y 3er cuadrante. Si tiene varias placas, inocule primero en el primer cuadrante todas las placas y luego disemine. b. Esterilizacin doble: Utilizada principalmente para muestras con mucho inculo bacteriano, como deposicin. La diferencia radica en agregar una segunda esterilizacin del asa entre el 2 y 3 cuadrante. Si tiene varias placas que sembrar, inocule primero en el primer cuadrante de cada una de las placas y luego disemine con asa.

Siembra en tubos de agar tendido El borde del tubo debe ser flameado antes y despus de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequea cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estra suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo, debe dejarse suelto el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn. Ejemplo Agar Sabouraud, Agar Citrato

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Siembra en superficie y picadura El inculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse el borde del tubo antes y despus de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn. Ejemplo Agar TSI, Agar LIA

Siembra en profundidad El inoculo se introduce como una picadura en el medio de cultivo cuidando que sea de manera recta y central hasta el fondo del tubo. Se debe hacer el mismo trayecto de entrada y salida. Ejemplo agar MIO

Siembra de inculo longitudinalmente y diseminacin con estra nica Recuento de colonias por siembra de un inculo conocido a lo largo de la placa y diseminado posteriormente. Usado principalmente para orina y otras muestras respiratorias como Lavado broncooalveolar (LBA). Un inculo determinado se siembra con una lnea que atraviesa longitudinalmente la placa (en el caso de orina o 1/6 de la placa) y luego se disemina el inculo primario con una estra nica.

Siembra en medio liquido Al inocular un medio lquido, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando ste se endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el medio lquido con trula o con inculo lquido se deposita este en el fondo del tubo. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de efectuada la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn. Ejemplos: thioglicolato, caldo soya 7. El procedimiento especfico de siembra para otras muestras se describe en los procedimientos Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 6 de 105

correspondientes (ej tejidos en Cultivos de secreciones de piel y tejidos blandos)

REFERENCIAS 1. 2. 3. Instituto de salud Pblica de Chile. Procedimientos tcnicos de Laboratorio Clnico, Vol I: Bacteriologa General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serologa de la Sfilis. Santiago: 1994 Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerbicos segn la muestra. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 53-85 Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM Press, 1998; 37-126

ANEXOS Anexo n 1: Tabla de Medios de cultivo para siembra de muestras de microbiologa.

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ANEXO N 1: MEDIOS DE CULTIVO PARA SIEMBRAS DE MICROBIOLOGA A. sangre Cromo atm normal agar ORINAS COPROCULTIVO ASPIRADO ENDOTRAQUEAL (solo UPC) EXPECTORACION LAVADO BRONCOALVEOLAR INTRAABDOMINAL (COLECC INTRAABD., LIQ.PERITONEAL, BILIS) LIQ. ASCITICO O PERITONEAL (NO TOMADOS EN PABELLON) LIQ. ARTICULAR, SINOVIAL, BURSAL LCR LIQ. PERITONEO-DIALISIS LIQ. PLEURAL, LIQ. PERICRDICO PIEL PRTESIS (ARTICULAR, VALVULAR, ETC) PUNTA DE CATTER SEC. FARINGEA SEC. NASAL SEC. SENOS PARANASALES SEC. OCULAR, CONJUNTIVAL SEC. OTICA SEC. CERVICAL, ENDOCERVICAL SEC. VAGINAL SEC. URETRAL TEJIDO SEO y BLANDOS (Horario Hbil) TEJIDO SEO y BLANDOS (Horario Inhbil) TRASPASO HEMOCULTIVOS Y LIQUIDOS. EN VIAL

A. sangre A chocolate en CO2 en CO2

Th. Martin en CO2

Agar Mac Caldo Conkey thioglicolato

Laboratorio Microbiologa H. Padre Hurtado Agar Agar Agar Gram Ex. al Sabouraud SS TCBS fresco *

SEMBRAR EN SABOURAUD SI SE SOLICITA CULTIVO HONGOS ADEMAS DE LAS INDICADAS EN TABLA

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N 2. PROCEDIMIENTO TCNICO DE TINCIONES DE MICROBIOLOGA

OBJETIVO Realizar tcnicas que requieren tinciones simples y diferenciales para el estudio microscpico de las muestras clnicas y aislamientos microbiolgicos de acuerdo a mtodos estandarizados para un adecuado diagnstico microbiolgico. En este Procedimiento se incluyen las Tcnicas de ejecucin de los siguientes exmenes: Tincin de Gram Tincin de Kinyou Tinta china Tincin violeta-bicarbonato Leucocitos fecales Tincin de azul de toluidina para Pneumocystis jiroveci La tincin de Ziehl Neelsen modificado para Cryptosporidium y Examen de gota gruesa estn includos en procedimiento n 17: P. Tcnicos de diagnstico de parasitologa clnica de este manual. La tincin con KOH para hongos est includa en procedimiento n 18: P. Tcnico de diagnstico de micologa clnica. ALCANCE Tecnlogos Mdicos, Tcnicos Paramdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa y Seccin Urgencia (Tincin de Gram), Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la lectura, interpretacin y de la validacin del informe. Auxiliar paramdico: Responsable de la realizacin de extendido, fijacin y tinciones (excepto tinta china, Azul de toluidina para P. jiroveci y examen de gota gruesa que son realizados por TM) DESARROLLO DEL PROCESO El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 9 de 105

bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

1 TINCION DE GRAM Hacer extendido, fijar a temperatura ambiente o calor suave Colorear con cristal violeta al 1% o violeta genciana durante 60 segundos, cuidando que el colorante cubra toda la preparacin. Eliminar el exceso de colorante y lavar rpidamente con un chorro suave de agua, manteniendo la lmina en posicin inclinada. Cubrir la preparacin con la solucin de lugol (mordiente), dejndola actuar durante 60 segundos. Lavar nuevamente con agua. Decolorar con alcohol - acetona (mezcla 1: 1) durante 10 segundos. Lavar con agua Colorear con el colorante de contraste que es la safranina durante 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar al microscopio utilizando el objetivo de inmersin. Las bacterias que retienen el colorante se denominan GRAM POSITIVAS y se observan de color AZUL Las bacterias que se decoloran con el alcohol acetona y se tien con la safranina se denominan GRAM NEGATIVAS y se observan de color ROSADO. La fase de decoloracin con alcohol- acetona constituye la etapa ms importante de la tincin de Gram y en ella reside su carcter diferencial.

Gram Positivo

Gram Negativo

2 TINCION DE KINYOU Se utiliza para diferenciar entre Actinomyces y Nocardia Tcnica: Hacer frotis, dejar secar a temperatura ambiente. Cubrir la lamina con carbol-fucsina durante 3 minutos (no calentar) Lavar y decolorar con agente decolorante durante 5 - 10 segundos. Colocar azul de metileno como contraste por 30 segundos Lavar con agua Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 10 de 105

Secar Interpretacin: Es positivo cuando se tie rosa fuerte (Nocardia) Es negativo cuando se tie azul (Actinomyces)

3 TINCION DE TINTA CHINA PARA Cryptococcus neoformans Tincin negativa o tincin de tinta china, que tie toda la preparacin excepto la cpsula y permite hacer un diagnstico presuntivo de criptococosis. La ejecucin de este examen es responsabilidad del Tecnlogo Mdico Se realiza a partir del sedimento del LCR, tras centrifugacin, colocando en un portaobjetos una gota de sedimento y otra de tinta china comercial Mezclar y poner un cubreobjetos Observar al microscopio optico con objetivo 40x. Hay que examinar el porta completo. La sensibilidad de la tincin oscila entre el 25-50% en los casos de meningitis, aunque en los pacientes con sida puede ser mayor. Pueden producirse falsos resultados positivos en presencia de levaduras de los gneros Rhodotorula y Candida, de otras especies de criptococos, Klebsiella pneumoniae, as como por artefactos. Es importante diferenciar bien la clula con doble pared refringente, con su cpsula, y hay que buscar clulas en fase de gemacin. La tcnica requiere personal entrenado y siempre hay que confirmar este diagnstico inicial con el cultivo.

4 TINCION VIOLETA BICARBONATO Tincin utilizada para detectar la presencia de Campylobacter sp. Se realiza un extendido de la muestra de deposicin (idealmente muestra fresca). Luego es teido con partes iguales de Cristal Violeta y Bicarbonato de Sodio al 1%, durante uno a dos minutos. Luego las lminas se leen con aumento de 100x y se considera positiva la presencia Bacilos Gram Negativos de formas espirilares o semejantes a gaviotas. Se informa como Se observa morfologa sugerente de Campylobacter. Si despus de revisar 50 campos no se observan estas formas espirilares, se considera negativa.

5 LEUCOCITOS FECALES 5.1 OBJETIVOS: Diferenciar una diarrea infecciosa de tipo no inflamatorio (enterotoxina) de una diarrea de tipo inflamatoria (citotoxina). 5.2 FUNDAMENTO: La Tincin con Azul de Metileno, se usa en la bsqueda de leucocitos fecales, la cual permite una buena tincin de los ncleos de estas clulas (polimorfonucleares), y de esta manera se pueden visualizar al microscopio. 5.3 MATERIALES E INSUMOS Frasco plstico de tapa rosca, debe estar limpio no necesariamente estril Laminas portaobjetos desengrasados Tincin de azul de metileno Cubreobjetos. 5.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: Microscopio binocular con lentes objetivos 40x, 50x y 100x. 5.5 DESARROLLO DEL PROCESO Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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En la recepcin de la muestra se debe revisar que venga identificada con nombre y dos apellidos del paciente, los cuales deben coincidir con la orden, adems la muestra debe corresponder con el tipo de examen solicitado. Una vez que el paramdico chequea la muestra debe procesarla, teniendo en cuenta medidas de bioseguridad: uso de guantes. La muestra se extiende en una lmina portaobjeto en forma circular en el centro de sta. Debe secarse a temperatura ambiente antes de ser teida. Luego, se tie con Azul de Metileno por tres minutos. Para eliminar el exceso de colorante se lava con agua. Dejar secar a temperatura ambiente por tres minutos. La lmina con la preparacin se lee al microscopio ptico con lentes de inmersin 50x o 100x.

Preparacin al fresco: Se efecta cuando la deposicin es demasiado acuosa. Se prepara entre lmina y laminilla, colocando 2 a 3 gotas de la deposicin en un portaobjeto. Agregar una gota de Azul de Metileno. Colocar el cubreobjeto y mantener en una cmara hmeda (placa de petri) Leer en microscopio ptico con objetivo 40x Informar si hay presencia de leucocitos a tambin de glbulos rojos, estimando la cantidad. 5.6 INFORME Si el resultado es negativo debe informarse: leucocitos fecales negativo Si el resultado es positivo debe informarse: Ms de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales abundantes Menos de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales regular cantidad. Si hay uno que otro por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales escasos En el caso que se observe con lente de inmersin 50x, el informe es similar. Para registro interno del laboratorio se cuantifica en cruces, es decir, +, ++ y +++ para escaso, regular cantidad y abundantes respectivamente. 5.7 REGISTROS: Se ingresa el resultado al sistema informtico.

6 TINCIN DE AZUL DE TOLUIDINA PARA PNEUMOCYSTIS JIROVECI 6.1 OBJETIVO: Identificar quistes o trofozotos de Pneumocystis jiroveci (ex Pneumocystis carinii) en muestras de lavado broncoalveolar (y otras) con el objetivo de ayudar en el diagnstico diferencial de neumopatas en pacientes inmunodeprimidos. 6.2 FUNDAMENTO: El diagnstico se basa en la demostracin de la presencia del microorganismo en muestras de origen pulmonar o tejido pulmonar, principalmente se usa el lavado bronqueoalveolar, tambin pueden ser expectoraciones, muestras de cepillado transtraqueal y cepillado bronquial. Se utilizan diferentes tcnicas tintoriales, tales como: Azul de Toluidina O, Naranja de Acridina, Metenamina Argntica de Gomori. En este laboratorio de parasitologa se utiliza la tincin de Azul de Toluidina; es la tincin con colorante cannico ms utilizada, sus efectos metacromticos son fcilmente obtenidos y es una tcnica muy sensible. 6.3 MATERIALES E INSUMOS Reactivos - Reactivo de Sulfatacin:

Acido Actico Glacial Acido sulfrico concentrado - Solucin de Tincin de Azul de Toluidina O: Azul de Toluidina O Acido Clorhdrico concentrado Alcohol Etlico al 100% Tincin preparada segn instructivo de tinciones Materiales: Coplin, portaobjetos, pipetas graduadas, pipetas Pasteur, mascarilla, guantes, aceite de inmersin

6.4 INSTRUMENTOS O EQUIPOS Y ACCESORIO Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 12 de 105

Microscopio de luz con aumento objetivo 40x y 100x Centrifuga

6.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE Lavado broncoalveolar: Es la muestra ideal. Se debe tomar en un tubo cnico de tapa rosca, el cual debe ser estril. Cantidad mnima requerida 2 ml. 6.6 DESARROLLO DEL PROCESO 6.6.1 Procesamiento de la muestra: Tipo de muestra: Lavado Broncoalveolar. Primero se debe verificar que los datos del paciente en la muestra coincidan con los de la orden. centrifugar la muestra a 2000 r.p.m por 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. Luego realizar 4 frotis del sedimento, extendiendo la muestra en forma circular en el extremo de un portaobjeto previamente identificado. Dejar secar a temperatura ambiente (no secar en estufa). De los cuatro frotis realizados, dos se tien y los otros dos se guardan como respaldo. Una vez secado teir. Tipo de muestra: Expectoracin. La expectoracin primero debe ser fluidificada Reactivos para fluidificar: Ditiotreitol 1 gr/ lt, se debe mantener refrigerado a 4 C Buffer fosfato pH 7,2 Tcnica de fluidificacin: La muestra de expectoracin debe tomarse en recipiente estril Colocar 2 a 3 ml de expectoracin en un tubo estril. Agregar igual cantidad de Ditiotreitol 1 gr/lt. Agitar vigorosamente en un vortex, hasta disolver la expectoracin. Incubar por 5 a 10 minutos a 37C o 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue Buffer Fosfato pH 7.2 al tubo. Centrifugar a 4000 r.p.m por 5 minutos. Extraer el sobrenadante y dejar un pellet de 0.5 ml. Tomar una gota del sedimento y extender en forma circular en portaobjeto. Se deben realizar 4 frotis, de los cuales dos se tien y los otros se guardan. Dejar secar a temperatura ambiente. Teir segn tcnica. 6.6.2 Procedimiento de tincin: Colocar la(s) lamina(s) a teir en el coplin que contiene el reactivo de sulfatacin por 10 minutos. Lavar bien con agua corriente, suavemente. Dejar escurrir Colocar la(s) lmina(s) con solucin de Azul de Toluidina por 10 minutos. Lavar bien con agua corriente, suavemente Colocar en alcohol isoproplico por 1 segundo y dejar secar. - Montar Leer las preparaciones con objetivo de 100x en forma ordenada y sistemtica (Ver anexo 5) 6.7 INFORME Si el resultado es negativo, se informa: No se observan Quistes de Pneumocystis jiroveci Tincin: Azul de Toluidina O Si el Resultado es positivo, se informa: Se observan quistes de Pneumocystis jiroveci Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Tincin: Azul de Toluidina O 6.8 RESPONSABILIDAD El procesamiento de muestras, lectura, interpretacin e informe es responsabilidad del TM REFERENCIAS Witebsky F. et all. Modified toluidine blue O stain for Pneumocystis carinii: further evaluation of some technical factor. J. Clin microbiol 26:774-775. 1988 Gosey L. et all. Advantages of modified toluidine blue O stain and bronchoalveolar lavage for the diagnosis pneumocystis carinni pneumonia. J Clin Microbiol. 22: 803-807.1985.

ANEXOS

Anexo : Quistes de Pneumocystis jiroveci

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N 3. PROCEDIMIENTO TCNICO DE MTODOS CONVENCIONALES Y RPIDOS DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS AEROBIAS

OBJETIVO Realizar los procedimientos de identificacin de bacterias de acuerdo a mtodos estandarizados para obtener resultados confiables y reproducibles, que permitan identificar los agentes bacterianos obtenidos a partir de cultivos de muestras clnicas.

QUIENES DEBEN APLICARLA Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa. RESPONSABILIDADES Tecnlogo Mdico: Responsable de la ejecucin, lectura e interpretacin de las tcnicas para identificacin de microorganismos obtenidos de las muestras clnicas, y de la validacin del informe. Recepcin, control de calidad de los medios de cultivos empleados en identificacin. Tcnico paramdico: Responsable de almacenamiento de los medios.

MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE 1. Materiales: medios de cultivo diferenciales ( agar citrato, agar LIA, agar TSI, agar urea, agar MIO, agar cromgeno para orina, agar DNAsa, agar telurito, agar NaCl 6,5%, agar bilis esculina, etc) reactivos (reactivo de Kovacs, reactivo para Voges-Proskauer, reactivo para rojo metilo, tabletas diagnsticas con azcares u otros sustratos, perxido de hidrgeno, plasma para coagulasa, oxidasa, etc) tcnicas de aglutinacin por ltex y serologas para identificacin (kit serologa para Streptococcus, ltex para Staphylococcus aureus, etc) kit de identificacin para bacilos gram negativos, Neisserias spp y bacilos gram negativos fastidiosos, cocos gram positivos. 2. Equipos: estufa de incubacin, refrigerador, vrtex, mechero. 3. Software: Omega

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DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO Se entiende por identificacin bacteriana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo. Mtodos utilizados para la identificacin microbiana: 1. Mtodos basados en criterios morfolgicos (estructurales) 2. Mtodos basados en tincin diferencial 3. Mtodos basados en pruebas bioqumicas 4. Mtodos basados en pruebas serolgicas En la mayora de los casos la identificacin se realiza con la combinacin de ms de un mtodo. Mtodos basados en criterios morfolgicos: Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos aos a clasificar organismos, pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el microcoscopio tan similares que se dificulta su clasificacin. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfologa celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados. Mtodos basados en tincin diferencial: Es posible sacar conclusiones en relacin con la morfologa de una bacteria, examinando una lmina que fue sometida a un proceso de tincin diferencial. Estos criterios morfolgicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificacin bacteriana. La mayora de las bacterias, teidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas. Otras tinciones diferenciales, como la cido resistente, se aplican a algunos tipos de bacterias, como por ejemplo micobacterias. Los procedimientos de tincin que nos permiten aplicar los mtodos 1 y 2, estn descritos en Procedimiento n 2: PT de tinciones de microbiologa de este manual. Mtodos basados en pruebas bioqumicas: Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias estrechamente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes en base a pruebas bioqumicas. Por ejemplo: las bacterias de familia Enterobacteriaceae. 4. Mtodos basados en pruebas serolgicas: Son los mtodos que utilizan anticuerpos especficos dirigidos contra antgenos de los microorganismos a identificar. Los ms utilizados son aquellos en los anticuerpos estn fijados a partculas de ltex (test de aglutinacin por ltex) En nuestro laboratorio se emplean: Kit de aglutinacin por ltex para Streptococcus Kit de aglutinacin por ltex para Staphylococcus aureus Antisueros para Salmonella Antisueros para Shigella Antisueros para Yersinia enterocoltica Antisueros para E coli O26, O111, O157 Tcnicas a realizar segn indicaciones del fabricante A continuacin se detallan una serie de pruebas bioqumicas que se realizan en el laboratorio para la identificacin bacteriana: Catalasa: Esta prueba se emplea para diferenciar el gnero Staphylococcus (catalasa positiva) del gnero Streptococcus (catalasa negativa) y tambin en otros tipos bacterianos puede ser de utilidad (ej bacilos Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 16 de 105 3. 2. 1.

gram positivos) Prueba en portaobjeto: Transferir clulas bacterianas desde el centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto de vidrio con una pipeta Pasteur. Agregar una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 30 %. La rpida aparicin y sostenida produccin de burbujas de gas o efervescencia constituyen un resultado positivo. Precauciones: Si la colonia a estudiar esta sembrada en un medio con sangre debe tenerse la precaucin de no arrastrar medio, pues los glbulos rojos all contenidos daran una reaccin positiva falsa. Los cultivos para esta prueba deben ser de 18 a 24 horas, ya que colonias ms viejas pueden perder su actividad, dando una reaccin negativa falsa.

Coagulasa: Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) del resto de especies de Staphylococcus que son coagulasa negativas. Se puede realizar de dos maneras: tcnica en portaobjeto (coagulasa ligada) y la tcnica en tubo (coagulasa libre) Prueba en tubo: En un tubo de Khan agregar 0.5 ml de una mezcla de plasma citratado ms caldo soya tripticasa en proporcin 1:1, resuspender una colonia aislada hasta una turbidez visible, incubar a 37C durante 3 horas. Una prueba positiva est dada por la formacin de un cogulo que no puede ser resuspendido por agitacin. En caso de ser negativo (el medio contina lquido) incubar hasta las 24 horas, ya que algunas cepas requieren tiempo prolongado de incubacin. Prueba en portaobjetos: Preparar una suspensin densa de una colonia aislada en una gota de agua destilada o solucin salina estril situada en un portaobjeto, aadir una gota de plasma citratado, mezclar suavemente con un asa y observar si aparecen grumos (prueba positiva). DNAsa: Esta prueba permite identificar algunas bacterias (gram positivas o gram negativas), que poseen esta enzima extracelular, como es el caso de Staphylococcus aureus el cual es Dnasa positiva. Se realiza en una placa de medio slido en la cual se ha incorporado el DNA, con un indicador (azul de toluidina o verde de metilo) Para realizar esta prueba se debe inocular una colonia sospechosa en una estra de aproximadamente 2 centmetros en la placa de agar DNAsa (Esto permite probar en la placa varios cultivos), incubar a 37 C por 24 horas (depende del tipo bacteriano a estudiar). Una prueba positiva est dada por la aparicin de un halo transparente alrededor de la zona inoculada. Sensibilidad a Bacitracina Esta prueba permite identificar presuntivamente a Streptococcus Beta hemoltico Grupo A (Streptococcus pyogenes). Para esta prueba se utiliza un sensidisco de Bacitracina de 0.04 unidades. Se recomienda usar un inculo puro abundante de la colonia sospechosa (beta hemoltica), a partir de un caldo soya tripticasa con unas 6 horas de incubacin. Sembrar en csped sobre una placa de agar sangre de cordero y depositar el sensidisco. Incubar la placa a 37C en una atmsfera de CO2 durante toda la noche. Cualquier tamao de halo de inhibicin indica prueba positiva, es decir, corresponde presuntivamente a Streptococcus pyogenes, ya que son sensibles a la Bacitracina. Test de Camp Este Test permite identificar a Streptococcus beta hemoltico del grupo B (Streptococcus agalactiae), tambin a Listeria monocytogenes y algunas especies de Corynebacterium. Para realizar este test se debe disponer de una cepa de Staphylococcus aureus productor de una betalisina Se debe trazar una franja del Streptococcus en estudio en forma perpendicular a una franja del Staphylococcus aureus productor de betalisina, sin tocarla, es decir, se debe tener 1 cm de distancia entre ambas trazas. Todo esto sobre una placa de agar sangre de cordero. Incubar 18-24 horas a 37 C en atmsfera de 5-10% CO2. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 17 de 105

Los estreptococos del grupo B y otras bacterias que dan este test positivo producen una sustancia (Factor de CAMP) que agranda la zona de hemlisis producida por el estafilococo, para formar una tpica cabeza o punta de flecha en la unin de ambos microorganismos (Test de CAMP positivo).

Sensibilidad a Optoquina Esta prueba permite identificar a Streptococcus pneumoniae (diagnstico presuntivo) Seleccionar 4 - 6 colonias sospechosas y sembrar en csped directamente en un sector de una placa de agar sangre o agar sangre Mueller Hinton. Colocar el disco de Optoquina (etilhidrocupreina 7mm), luego incubar en una atmsfera de CO2 por 24 horas para estimular el desarrollo bacteriano. Leer el halo de inhibicin, si este mide 14 o ms milmetros corresponde a Streptococcus pneumoniae (diagnstico presuntivo) Sensibilidad a Novobiocina Esta prueba permite diferenciar a Staphylococcus saprophyticus de los dems Staphylococcus coagulasa negativos. La tcnica consiste en hacer un inculo de la colonia sospechosa a una turbidez de 0.5 Mac Farland, despus se debe sembrar a modo csped en una placa de agar Mueller Hinton, posteriormente colocar el sensidisco de Novobiocina (5 ug) e incubar por 18 horas a 37 C. Si el halo del sensidisco es menor de 5mm la bacteria es resistente. Si el halo del sensidisco es mayor de 6mm la bacteria es sensible. - Staphylococcus saprophyticus es resistente a la Novobiocina. Test de bilis Esculina Este test diferencia entre estreptococos grupo D y no grupo D. Tambin tiene otras aplicaciones. Se debe disponer del medio bilis esculina tendido en tubos, el cual es de un color amarillento claro El medio debe ser inoculado en forma de estras o picadura con una o tres colonias sospechosas. Incubar a 37 C por 24 a 48 horas a atmsfera normal. Reaccin positiva: el medio se pone color negro (estreptococos grupo D) Reaccin negativa: no hay aparicin de coloracin negra. Prueba de tolerancia a la sal Permite evaluar la tolerancia a la sal de los Streptococcus bilis esculina positivo y otros Gram positivos (Aerococcus, Pediococcus y Staphylococcus. Dentro de los estreptococos grupo D, diferencia Enterococcus spp de verdadero Streptococcus grupo D. Se requiere de un medio de cultivo hipertnico que contiene 6.5% de cloruro de sodio, glucosa y prpura de bromocresol como indicador. Se debe inocular dos o tres colonias de estreptococos en un tubo del medio de cultivo Incubar el tubo de 24 - 48 horas a 37 C en atmsfera aerbica. Los estreptococcos grupo D enterococo producen un viraje del indicador del prpura al amarillo, por lo tanto, son tolerantes a la sal. Prueba de Voges-Proskauer El Test Voges-Proskauer se usa en la diferenciacin de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y tambin para diferenciar bacterias del grupo Streptococcus. Preparar una suspensin bacteriana en 0.25ml de cloruro de sodio (0.9%) en un tubo de Khan Agregar una tableta diagnstica para VP y tapar el tubo con tapn de goma o algodn. Incubar a 35-37C por 4 horas Leer la reaccin agregando 2 gotas de solucin de alpha-naphthol (5% en etanol) y despus agregar una gota de Hidrxido de potasio (KOH) al 40% y mezclar. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Reaccin positiva: color rojo o rosado Reaccin negativa: no hay cambio de color Oxidasa: Esta prueba se utiliza para la identificacin de la enzima citocromoxidasa presente en algunas bacterias Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 18 de 105

La prueba se lleva a cabo por medio de dos mtodos; uno de ellos es con un trozo de papel filtro o toalla de papel la cual se impregna con gotas del reactivo tetrametil-p-fenilendiamina, previamente preparado con agua destilada, una vez impregnado se debe inocular una colonia de la cepa en estudio en el papel. Otro mtodo que se utiliza es con tiras reactivas comerciales en las cuales va impregnado el reactivo, las cuales deben ser inoculadas con la colonia a estudiar. Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromoxidasa (oxidasa positiva) desarollan un color azul oscuro en el sitio de la inoculacin en 10 segundos. Las colonias oxidasa negativa no producen color.

Factores de crecimiento X y V La determinacin de los requerimientos de los factores de crecimiento V (NAD) y X (hemina) permite diferenciar distintas especies de Haemophilus, principalmente H. influenzae y H. parainfluenzae. Preparar una suspensin de la cepa en estudio en caldo Mueller Hinton o caldo infusin cerebro corazn con una turbidez 0.5 Mac Farland. Sembrar con trula a modo de csped sobre una placa da agar Mueller Hinton y colocar los discos que estn impregnados con los factores correspondientes (X, V, X+ V), la distancia entre los factores X y V en la placa debe ser de 2 cm; el factor X+V debe estar ms separado de los anteriores. Incubar a 37C, 18-24 horas, en 5-10% de CO2. Observar el halo de crecimiento alrededor de los discos. Si se observa solamente crecimiento alrededor del disco X+V corresponde a Haemophilus influenzae. Si se observa crecimiento alrededor de los discos V y X+V corresponde a Haemophilus parainfluenzae. Test de fermentacin de azcares El test de fermentacin de azcares se realiza mediante tabletas diagnsticas que contienen el azcar especifico (glucosa, sacarosa, maltosa, arabinosa, fructosa etc.), el cual es ocupado por algunas bacterias como por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae. La tcnica consiste: preparar una densa suspensin bacteriana en 0.25 ml de suero fisiolgico en un tubo de khan. Agregar al tubo la tableta diagnostica del azcar que se quiere probar. Incubar a 37C por 4 horas o durante toda la noche (ver instrucciones del fabricante). La reaccin positiva se caracteriza por el viraje del color rojo (indicador rojo fenol) a amarillo. En la reaccin negativa no hay cambio de color. Prueba de O/F (oxidacin y fermentacin): Se usa el medio bsico de Hugh y Leifson con un pH de 7,1. Es un medio semislido de color verde que se inocula por picadura. Contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de Bromotimol. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura. Uno de los tubos queda sin aceite y otro con aceite o vaselina sellndolo. Se incuban a 37C por 24 horas. Se lee la reaccin segn siguiente tabla:

Tipo de Metabolismo Oxidador fermentador Oxidativo ( BGN NF ) Inactivo

Tubo abierto ( sin vaselina ) Amarillo Amarillo en superficie Verde ( sin viraje )

Tubo cerrado ( con vaselina ) Amarillo Verde ( sin viraje ) Verde ( sin viraje )

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Medio M.I.O. ( Motilidad Indol Ornitina) El medio de Motilidad Indol Ornitina (M.I.O.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciacin de bacilos Gram negativos entricos, sobre la base de la produccin de Indol, la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y la capacidad de motilidad. Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminocidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energa. El agar acta como agente gelificante. Los cambios en el pH se verifican gracias al indicador prpura de bromocresol. La actividad de la ornitina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color prpura, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia color amarillo. La motilidad se observa como un desplazamiento del desarrollo microbiano desde el inculo. Se deben observar estas caractersticas antes de efectuar la evaluacin del indol. La produccin de indol se verifica mediante la adicin de algunas gotas de reactivo de Kovacs en la superficie del medio de cultivo. La produccin de un compuesto color rojo fucsia es considerado como Indol positivo. Inoculacin: sembrar las muestras mediante una picadura vertical y profunda en centro del tubo. Incubar por 24 horas a 37C. Lectura e interpretacin de Resultados: una vez completado el periodo de incubacin, observar motilidad y actividad de ornitina decarboxilasa, y luego realizar la prueba del Indol. a. Motilidad: Resultado positivo: presencia de desarrollo microbiano que se observa como enturbiamiento del medio de cultivo en todo el tubo, o desplazado fuera de la picadura de inoculacin. Resultado negativo: el desarrollo microbiano esta restringido solo en el trayecto de la picadura de inoculacin. b. Ornitina descarboxilasa: Resultado positivo: se verifica como alcalinizacin del medio de cultivo con un viraje hacia el prpura. Resultado negativo: se observa acidificacin con viraje hacia amarillo o no se observan cambios significativos en el pH. c. Produccin de indol: Agregar 3 a 4 gotas de Reactivo de Kovacs sobre la superficie del medio de cultivo y agite cuidadosamente. Resultado positivo: produccin de un anillo de color rojo fucsia. Cualquier indicio de color es considerado positivo. Resultado negativo: produccin de un anillo de color amarillo. Citrato El agar citrato de Simmons es un medio diferencial utilizado para el estudio de bacilos Gram negativos entricos, sobre la base de la utilizacin del citrato como una fuente de carbono, y la utilizacin de sales de amonio inorgnico como nica fuente de nitrgeno. Estas reacciones metablicas son dependientes del aporte de oxgeno. El sulfato de magnesio aporta cofactor magnesio para diversas reacciones enzimticas, en tanto que el fosfato de potasico acta como agente tamponante. Los cambios en pH se verifican gracias al indicador azul de bromotimol. Inoculacin: sembrar las muestras mediante estra en superficie. El aporte de oxigeno es fundamental para observar una buena reaccin positiva, para mejorar los resultados se puede cambiar el tapn de goma por algodn card. Incubar por 24 horas a 37 C. Lectura e interpretacin de Resultados: Una vez completado el perodo de incubacin, observar el desarrollo de colonias en la superficie del agar y el viraje de pH por alcalinizacin, de verde a azul. - Resultado positivo: solamente los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de carbono presentarn desarrollo. El medio cambiar de verde a azul. - Resultado negativo: no se observar desarrollo ni cambios en el color Ureasa El agar urea de Christensen es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la identificacin de bacilos Gram negativos entricos sobre la base de la degradacin de urea en amonio. Esta cualidad es propia de bacterias del gnero Proteus, Morganella, Providencia y tambin puede verificarse en otras como Klebsiella spp. Bordetella spp. y Brucella spp. Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo de fenol: la produccin de cido se ve como Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 20 de 105

cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinizacin se observa como viraje hacia el rojo fucsia. El valor del pH se eleva cuando existe degradacin de la urea y produccin de amonio. Inoculacin: sembrar abundantemente las cepas mediante estra en la superficie tendida. Incubar por 24 horas a 37 C. Lectura e interpretacin de Resultados: Una vez completado el perodo de incubacin, se debe observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y el viraje de pH por alcalinizacin a rojo fucsia. -Resultado positivo: Degradacin de la urea, desarrollo y viraje del indicador de pH a color rojo fucsia. -Resultado negativo: medio de cultivo sin cambios, no hay viraje del indicador de pH. Medio L.I.A. El medio de agar Lisina y hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciacin de bacilos Gram negativos entricos, especialmente miembros del gnero Salmonella con capacidad de fermentacin de lactosa, sobre la base de la produccin de H2S y la actividad de la enzima lisina descarboxilasa. Tambin es posible observar cambios debidos a la actividad de la enzima lisina deaminasa, caractersticas del genero Proteus y Providencia. Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminocidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energa. El citrato de amonio frrico y el tiosulfato de sodio actan como marcadores de la produccin de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El agar acta como agente gelificante. Los cambios de pH se verifican gracias al contenido de prpura de bromocresol: la produccin de acido se ve como cambio del color a amarillo con valores de pH inferiores a 5.2, en tanto que la alcalinizacin como cambio del indicador hacia el prpura con valores de pH sobre 6.8. La actividad de la lisina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color prpura en todo el medio de cultivo, o bien como medio de cultivo sin cambio (neutro) en la columna de agar, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo en la columna y neutro en la zona inclinada. La actividad de la lisina deaminasa, se observa como color rojizo en la zona inclinada, con fondo amarillo en el tubo. Tambin puede observarse produccin de gas por efecto de fermentacin de la glucosa. Inoculacin: sembrar las muestras mediante estra en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo. Lectura e interpretacin de Resultados: Una vez completado el perodo de incubacin, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinizacin (prpura) o acidificacin (amarillo). Adems se debe observar la produccin de H2S como color negro en el tubo y la generacin de gas. a. Produccin de H2S: Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloracin negra en el medio de cultivo en todo el tubo. Resultado negativo: ausencia de coloracin negra. b. Lisina descarboxilasa: Resultado positivo: se verifica como alcalinizacin (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el prpura en todo el tubo, o como medio de cultivo neutro Resultado negativo: se observa acidificacin (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo y alcalinizacin (color prpura) en la zona inclinada. c. Lisina deaminasa: Resultado positivo: produccin de color rojo granate (R) en la superficie inclinada. Resultado negativo: ausencia de color rojo granate. Medio T.S.I. El agar T.S.I. es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciacin de bacilos Gram negativos entricos en base a la fermentacin de carbohidratos y la produccin de H2S. Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminocidos y nutrientes esenciales, la dextrosa, lactosa y sacarosa constituyen fuentes de energa y sustratos para la diferenciacin basada en la actividad fermentativa sobre los azcares. El sulfato ferroso y el tiosulfato de sodio actan como marcadores de la produccin de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El cloruro de sodio contribuye al equilibrio osmtico. El agar acta como agente gelificante. Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo fenol: la produccin de cido se ve como Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 21 de 105

cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinizacin se observa como viraje hacia el rojo. Tambin puede observarse produccin de gas por efecto de fermentacin de la glucosa. Inoculacin: sembrar las muestras mediante estra en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo. Lectura e interpretacin de Resultados: Una vez completado el perodo de incubacin, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinizacin hacia el rojo (K) o acidificacin (A) hacia el amarillo. Adems se debe observar la produccin de H2S como color negro en el tubo y la generacin de gas por efecto de la fermentacin. a. Produccin de H2S: Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloracin negra en el medio de cultivo en todo el tubo. Resultado negativo: ausencia de coloracin negra. b. Fermentacin de carbohidratos: Resultado positivo: se observa acidificacin (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo, incluyendo o no la superficie inclinada. Resultado negativo: se verifica como alcalinizacin (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el rojo en todo el tubo o como medio de cultivo neutro. c. Produccin de gas: Resultado positivo: burbujas de gas o rotura de la columna de agar en el tubo por presin de gas acumulada en los tubos cerrados. Resultado negativo: no se observa gas.

Prueba del Telurito de potasio Esta prueba permite diferenciar entre especies del gnero Enterococcus, ya que es positiva para Enterococcus faecalis y negativa para Enterococcus faecium. La bacteria E. faecalis tiene la propiedad de reducir el telurito de potasio a telurio, dando colonias negras en el agar Telurito de Potasio, en cambio, E. faecium crece en el agar pero da colonias de color gris. Esta prueba tambin es positiva para bacterias del gnero Corynebacterium spp. por lo tanto, permite diferenciar entre bacilos gram positivos. Se requiere para esta prueba de una placa de agar Telurito de Potasio. Sembrar una pequea estra de la colonia sospechosa, en una regin de la placa de agar. Incubar a 37 C en atmsfera normal de 18 24 horas. Si el crecimiento son colonias negras, la prueba es positiva. Si crecen colonias grises, la prueba es negativa. Prueba Arginina dihidrolasa (ADH) Esta prueba permite diferenciar a Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis (prueba positiva) de otros Enterococcus, tambin es positiva para algunos bacilos gram negativos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, entre otros. Se basa en la actividad arginina dihidrolasa de la bacteria, donde el sustrato es la arginina y los productos de la ornitina, CO2 y amonio, produciendo una alcalinizacin del medio lo que provoca un cambio de color del indicador de amarillo a rojo. Se debe preparar una suspensin de la bacteria en estudio con suero fisiolgico (0.25 ml) en tubo de khan. Agregar una tableta diagnstica de ADH y 3 gotas de aceite de parafina estril. Cerrar el tubo. Incubar a 37C por 4horas, puede ser 24 horas. Reaccin positiva: rojo. Reaccin negativa: amarillo a blanco.

Prueba de la PYRROLIDONYL AMINOPEPTIDASA (PYR) PYR es una prueba colorimtrica rpida para la determinacin de actividad PYRrolidonasa en estreptococos y Citrobacter spp. entre otros La prueba utiliza tarjetas impregnadas con cido L-piroglutmico 7 amoni 4 metil cumarica (7AMC) y Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 22 de 105

dimetilaminocinamaldehdo para la deteccin de la actividad de PYRrolidonasa. La hidrlisis enzimtica del sustrato por los enterococos, estreptococos grupo A y Citrobacter spp. Provoca la aparicin de un color morado tras la adicin de una solucin de revelado. Procedimiento: 1. aplicar una colonia (0.5 mm o mayor) sobre el rea de reaccin con un asa de plstico o vidrio. 2. humedecer el rea de reaccin con 1 gota de Tampn (viene en kit). 3. incubar la tarjeta inoculada a temperatura ambiente (15-30 C) durante 5 minutos. 4. aadir 1 gota de Solucin de Revelado al rea de reaccin. La aparicin de un vvido de color morado en y alrededor de las colonias en 20 segundos, es confirmatoria de actividad PYRrolidonasa.

Prueba de aislamiento con ter Esta prueba permite aislar cocceas gram positivas (Staphylococcus y Enterococcus) de Proteus invasores. Realizar una emulsin de la colonia a aislar en 1 ml de suero fisiolgico, evitando la formacin de grumos. A la emulsin anterior agregar 1 ml de Eter Proanalisis (evitar contacto con mechero por peligro de inflamacin). Vorterear por 1 minuto. Sembrar con asa o pipeta Pasteur en agar sangre de cordero, aislando colonias. Incubar 18 24 horas en estufa normal a 37C. Prueba de solubilidad en bilis Se utiliza esta prueba para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae, soluble en bilis y otras especies de estreptococos alfa hemolticos, insolubles en bilis. Esta prueba controla la capacidad de las clulas bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y a una temperatura especfica. Las sales biliares utilizadas son el desoxicolato de sodio o el taurocolato de sodio. Las sales biliares hacen descender la tensin superficial en la interfase medio-membrana, provocan una descomposicin de la membrana celular y aceleran el proceso autoltico natural del neumococo activando las enzimas por combinacin de las sales biliares con el neumococo. A partir de cultivo puro, preparar una suspensin en suero fisiolgico, con una turbidez 1 de Mac Farland. Tomar dos tubos: uno para la prueba y otro como control. Colocar 0.5 ml de la suspensin en cada tubo. Colocar 0.5 ml de desoxicolato de sodio al 2% al tubo de la prueba y 0.5 ml de suero fisiolgico al tubo control. Incubar a 35C por dos horas. Resultados positivos: lisis del cultivo, por aclaracin del mismo, despus de la incubacin. Examinar el tubo control (microorganismo ms solucin salina) el cual debe estar turbio. Un resultado de solubilidad parcial es interpretado como positivo.

REFERENCIAS 1. Instituto de Salud Pblica de Chile. Procedimientos tcnicos de Laboratorio Clnico, Vol I: Bacteriologa General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serologa de la Sfilis. Santiago: 1994 2. Montiel F., Lam M. Mtodos microbiolgicos convencionales y rpidos usados en la identificacin de bacterias aerbicas. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 87-137

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N 4. PROCEDIMIENTO DE UROCULTIVO
OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de orina para urocultivo de acuerdo a mtodos estandarizados para recuperar agentes patgenos en el diagnstico microbiolgico de infeccin del tracto urinario (ITU). QUIENES DEBEN APLICARLA Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa. RESPONSABILIDADES Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tincin de Gram de screening MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: placas de agar cromgeno para orina, placa de agar Mac Conkey, placa de agar sangre, asa calibrada de 1 L y de 10 L, lminas portaobjetos, cubreobjetos, kit de tincin de gram. Pruebas de identificacin microbiana (bateras bioqumicas, DNAsa, ltex para Streptococcus, etc), Ver segn Procedimiento de mtodos convencionales y rpidos de identificacin de bacterias aerobias. Equipos: estufa de incubacin, mechero Software: Omega

DEFINICIONES Urocultivo: es el cultivo de muestra de orina obtenida en forma asptica, permite la recuperacin de bacterias no fastidiosas y hongos (levaduras). Tambin se puede realizar cultivo anaerobio de orina, para lo que se deben seguir las condiciones de toma de muestra y procesamiento especficas. (Ver Manual toma de muestras, Procedimiento de cultivo bacterias anaerobias). El urocultivo incluye un recuento de colonias, y debe ser correlacionado con la observacin microscpica del sedimento urinario o tincin de gram directa de la muestra para su interpretacin e informe final. Ms del 95% de las infecciones urinarias son monobacterianas y el microorganismo ms frecuente es Escherichia coli, principalmente en pacientes ambulatorios. En pacientes con infecciones recurrentes y de origen intrahospitalario, aumenta la frecuencia de otros microorganismos tales como Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Enterococcus y Staphylococcus. Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar cromgeno para orina: es un medio de cultivo que permite el desarrollo de bacterias gram positivas y negativas, adems de levaduras, y diferencia por aspecto y color los distintos gneros o grupos bacterianos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayora de las bacterias habituales y levaduras. Asas calibradas: asas estriles usadas para la siembra de un inculo conocido y estandarizado de la muestra de orina.

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DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO 1. 2. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico. La muestra debe ser sembrada dentro de 2 hrs de haber sido tomada, si se mantiene a t ambiente; si la muestra se ha mantenido refrigerada puede ser sembrada hasta dentro de 4 hrs. Orinas de 2a miccin y por catter permanente: primero se debe agitar bien la muestra con movimientos suaves para homogeneizarla, se introduce asa inmediatamente por debajo de la superficie lquida y se toma una gota con asa de 1 L, llevarla en forma vertical y sembrar en placa de agar cromgeno para orina, haciendo una lnea central y luego pasando en forma horizontal el asa desde el inicio de la lnea hasta el final de ella, sin cortar los trazos (como zigzag). Se siembran de 4 a 6 muestras por placa. En forma paralela a la siembra de la muestra de orina se realiza frotis para tincin de gram, se puede fijar hasta 10 orinas en una lmina y se usa para ello el asa calibrada de 1 L. Estas se tien y pueden ser observadas cuando exista discordancia entre el cultivo y el sedimento y cuando no exista sedimento. Orina por sondeo: proceder de la misma manera que orina de 2 chorro, y agregar adems siembra con asa de 10 L, en placas de agar sangre y agar Mac Conkey, de la misma forma explicada anteriormente. Orina por puncin vesical: Siembre con asa de 10 L, en placa de agar cromgeno para orina de la misma forma explicada anteriormente. Adems sembrar con pipeta de vidrio aprox. 0,1 ml diseminando con bagueta de vidrio en rastrillo por toda la superficie de una placa de agar sangre y agar Mac Conkey Orina tomada directamente de urter o rin (de pabelln)): se siembra con pipeta en agar sangre y agar Mac Conkey (como una secrecin), se disemina con bagueta de vidrio estril en rastrillo, no se evala recuento. 3. 4. Incubacin en estufa de cultivo a 35 a 37C a atmsfera normal por 18 a 24 hrs. Las muestras de orina deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo. En caso de resultados discordantes se recurrir a la muestra almacenada para repetir los anlisis. Las placas de urocultivos incubadas overnight son examinadas por Tecnlogo Mdico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio. En los cultivos positivos se determina recuento de colonias, identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad segn criterios de interpretacin mencionados a continuacin y en Anexo 1: Interpretacin e informe de resultados de urocultivo. Las placas que tienen escaso desarrollo o que son de muestras obtenidas por mtodos invasivos se reincuban. Recuento de colonias: n colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 L) n colonias x 100 (siembra con asa de 10 L)

5.

6.

7.

Interpretacin del cultivo: el responsable es el Tecnlogo mdico Para la interpretacin del resultado, se debe relacionar el recuento de colonias con la clnica del paciente, con el sedimento urinario o tincin de Gram, con el mtodo de recoleccin de la muestra y con antecedentes clnicos del paciente. Respecto a la tincin de gram directa, la presencia de una bacteria por campo de inmersin tiene buena correlacin con un recuento > 100.000 ufc/ml en el 85% de los casos Para interpretar e informar un urocultivo se compara con el sedimento, de manera que no haya discordancia en ambos resultados (sedimento sugerente de ITU: leucocitos o piocitos > 5 - 6 por campo de 40x y bacterias regular o abundante cantidad. La presencia de clulas descamativas y/o mucus, sugiere contaminacin vaginal).

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8.

Conductas a seguir en discordancias entre cultivo y sedimento Antes de informar el resultado, comparar con el sedimento, para evaluar si existe discordancia en ambos resultados Urocultivo positivo con sedimento normal: informar recuento y agente identificado para que el mdico tome decisin basndose en cuadro clnico. Urocultivo negativo sedimento alterado: se debe observar gram de muestra directa en busca de bacterias y clulas inflamatorias (leucocitos, piocitos); si Gram es sugerente de proceso infeccioso incubar por 48 horas para dar por negativo el urocultivo. Se debe agregar comentario en informe: discordancia entre sedimento y urocultivo, evaluar segn clnica

9.

Tiempo de respuesta: a. Cultivo negativo a las 48 horas b. Cultivo positivo: 48 a 72 hrs. hbiles

10. Informe: a. Cultivo negativo a las 48 horas b. Cultivo polimicrobiano: si existe desarrollo de 3 o ms bacterias se informa Resultado polimicrobiano c. Cultivo positivo: se informa recuento de colonias aproximado hasta 100.000 unidades formadoras de colonia por mL (UFC/mL). Recuentos mayores de 100.000 se informan >100.000 UFC/mL hubo desarrollo de. antibiograma 11. Registros: El resultado quedar registrado en sistema informtico Omega y en reverso de orden de examen.

METODOS DE SUPERVISION Y RESPONSABLES: Calidad de toma muestra: se evala indicador muestras urocultivo polimicrobianas / total urocultivos por servicio de procedencia. Ver Procedimiento de Control de Calidad de Microbiologa. Responsable: Tecnlogo Mdico seccin Microbiologa designado segn rotacin

REFERENCIAS 1. Comit de Microbiologa Clnica. Diagnstico microbiolgico de la infeccin urinaria. Rev Chil Infectologa 2001; 18(1) 34-38 2. 3. 4. Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerbicos segn la muestra. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 53-85 Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM Press, 1998; 37-126 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto urinario, 2010 Procedimientos de Microbiologa. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica.

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ANEXOS

TABLA 1: INTERPRETACION E INFORME DE RESULTADOS DE UROCULTIVO RECUENTO DE MTODO DE TOMA COLONIAS DE MUESTRA (UFC/ML) 0 (<100 o 1.000 segn tipo) Cualquier recuento Puncin suprapbica y obtenida de rin Cualquier recuento Cualquier mtodo y condicin 1.000 Cateterizacin transitoria 1.000 Cualquier mtodo en paciente varn 10.000 Segunda miccin en paciente especial * 10.000 orina por catter permanente 10.000 Segunda miccin 100.000 Segunda miccin SEDIMENTO URINARIO independiente resultado independiente resultado independiente resultado independiente resultado independiente resultado independiente resultado patolgico patolgico patolgico del del cualquier microorganismo del Cultivo puro de levadura del 2 especies uropatgenas del 2 especies uropatgenas del 2 especies uropatgenas 2 especies uropatgenas 2 especies uropatgenas 2 uropatgenos y otra bacteria con rcto 10 veces menos de 2 especies uropatgenas 3 microorg, sin predominio de alguno MICROORGA NISMO(s) AISLADO(s) INTERPRETACIN/ CONDUCTA RECOMENDABLE Urocultivo negativo identificacin y antibiograma Identificacin idem idem idem idem idem identificacin y antibiograma slo de uropatgenos identificacin y antibiograma Cultivo polimicrobiano. Solicite nueva muestra

100.000

Segunda miccin

sin antecedente sedimento -

100.000

*: PACIENTE ESPECIAL: embarazada, diabtico, urolgico (CRS Urologa), UCI-UTI, paciente peditrico y de Neonatologa.

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N 5. PROCEDIMIENTO DE COPROCULTIVO
OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de deposiciones para coprocultivo de acuerdo a mtodos estandarizados para recuperar agentes bacterianos enteropatgenos en el diagnstico microbiolgico de diarreas, intoxicacin alimentaria e investigacin de portadores asintomticos (como en el caso de manipuladores de alimento o en personas inmunosuprimidas). ALCANCE Seccin de microbiologia, servicio laboratorio clnico Tcnicos paramdicos, tecnlogos mdicos y mdico microbilogo de seccin microbiologia. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tincin de Campylobacter cuando se solicita. DEFINICIONES Coprocultivo: es el cultivo de deposiciones en medios diferenciales y selectivos para la recuperacin de bacterias enteropatgenas. Los agentes buscados rutinariamente en coprocultivo realizado por nuestro laboratorio incluyen: Salmonella spp, Shigella spp, y Yersinia enterocoltica. En caso de solicitud especfica o segn criterios mencionados en este protocolo se busca presencia de Escherichia coli 0157 / 0111/ 055/ 026 y Vibrio spp Placa SS: medio de cultivo slido medianamente selectivo usado para el aislamiento de bacterias de los gneros Salmonella y Shigella, inhibiendo en parte bacterias gram negativas coliformes y entricas no patgenas. Placa TCBS: agar selectivo para recuperar cepas de Vibrio spp a partir de muestras clnicas. Placa Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos.

MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Equipos: Equipo de lectura de aglutinacin Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Trula con medio de transporte Cary Blair Asa de siembra Placa agar Mac Conkey Placa agar SS Placa agar TCBS (en caso de vigilancia o bsqueda de Vibrio spp). Medios de cultivo para pruebas bioqumicas (bateras) Sueros para aglutinacin

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 Software: OMEGA

Estufa de incubacin.

DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO Se estudiarn los siguientes enteropatgenos: A. En adultos: De rutina: Salmonella spp. Shigella spp. Si se solicita: Yersinia spp. EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (inmunodeprimidos) B. En nios: De rutina

Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia spp. EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (en caso de disentera, especialmente en menores de 5 aos) Tincin de Campylobacter (en nios menores de 5 aos)

C. Estudio de Vibrio spp Si la muestra tiene indicada bsqueda de Vibrio o tiene antecedente de sospecha de intoxicacin alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS. Para efectos de vigilancia epidemiolgica activa se estudiar en horario hbil, segn protocolo del Minsal (se siembra en placa de agar TCBS cada 10 coprocultivos de pacientes menores de 18 aos y cada 5 de pacientes mayores de 18 aos); cada muestra de coprocultivo debe marcarse en el registro Vigilancia Activa de Vibrio, para determinar las muestras que deben sembrarse en TCBS. Procedimiento: 1. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico. Se siembra en placa de agar Mac Conkey y una de agar SS (en ese orden), las cuales se identifican con sus respectivos cdigos de barra. Se debe tener especial cuidado de realizar aislamiento en tres cuadrantes, esterilizando el asa entre cada uno. (Ver Procedimiento n 1: Siembra de muestras para cultivos aerbicos, de este manual) Si la muestra tiene indicada bsqueda de Vibrio o tiene antecedente de sospecha intoxicacin alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS; lo mismo si corresponde segn vigilancia activa de Vibrio. 3. Las placas sembradas se introducen en la estufa de incubacin, incubndose a atmsfera normal entre 35 y 37 C. 4. Despus de 18 a 24 horas de incubacin, el TM procede a verificar crecimiento de cepas, realizar pruebas de identificacin y antibiograma segn corresponda. Se incuba la placa de agar Mac Conkey por otras 24 horas a temperatura ambiente (aprox. 22 C) para la recuperacin de Yersinia enterocoltica. Cuando se completan las pruebas para la identificacin y antibiograma, el tecnlogo mdico registra los resultados en hoja de trabajo y valida informe final en sistema informtico. OBSERVACIONES: En el caso de aislar alguna de los siguientes agentes: Salmonella spp, Shigella spp, E coli presuntivamente enterohemorrgico, Yersinia enterocoltica, y Vibrio spp, se debe guardar cepa para ser enviada posteriormente a ISP (segn normativa ministerial de Vigilancia de Laboratorio)

INFORME: Hubo desarrollo de flora habitual, escasa, regular o abundante cantidad Negativo para... (Cada microorganismo investigado) Si se asla patgeno, nombre de la bacteria (especie y serotipo si corresponde). Si hay desarrollo de Vibrio cholerae o Vibrio parahaemolyticus, se informa nombre y antibiograma de microorganismo, y se agrega comentario identificacin presuntiva Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 29 de 105

Si se observa alguna alteracin de la microbiota intestinal, por ejemplo cultivo muy puro de Pseudomonas aeruginosa, levaduras o ausencia de flora, puede informarse como observaciones. Informar antibiograma en: Salmonella, Shigella y Yersinia.

TIEMPO DE RESPUESTA: Cultivo negativo: 48 a 72 horas hbiles Cultivo positivo: 3 a 4 das hbiles. REGISTROS: Sistema informtico del laboratorio, en reverso de orden de examen. Se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y stos en caja indicando el mes y ao, en archivos.

REFERENCIAS 1. 2. 3. Instituto de salud Pblica de Chile. Procedimientos tcnicos de Laboratorio Clnico, Vol I: Bacteriologa General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serologa de la Sfilis. Santiago: 1994 Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerbicos segn la muestra. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 53-85 Alvarez M., Buesa J., Castillo J., Vila J. Diagnstico microbiolgico de las infecciones gastrointestinales 2008. Procedimientos de Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica. En: www. seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap30.asp.

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N 6. PROCEDIMIENTO TCNICO DE HEMOCULTIVOS

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de sangre para hemocultivos de acuerdo a mtodos estandarizados para el diagnstico de bacteriemias y fungemias. En este procedimiento se incluyen el proceso e interpretacin para el diagnstico de infecciones asociadas a catter vascular: Tiempo diferencial de positividad de hemocultivos pareados Cultivo de punta de cteter vascular ALCANCE Tecnlogos Mdicos y Tcnicos Paramdicos de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la lectura e interpretacin de gram, evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico Paramdico: Responsable del ingreso de viales al equipo de hemocultivos automatizado, de la siembra de las muestras positivas en los medios establecidos y de realizar frotis MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Viales de hemocultivo Bactec aerobio adulto, aerobio peditrico, anaerobio Medios de cultivo: agar sangre, agar chocolate suplementado, agar Mueller Hinton y Mueller Hinton sangre, medios de cultivo diferenciales para identificacin. Jeringas asa estril Kit para tincin de Gram Equipos: Equipo de hemocultivos automatizado Bactec 9240, Becton Dickinson Estufa de incubacin de CO2 5% microscopio Software: Omega y Epicenter DEFINICIONES Hemocultivo: cultivo de muestra de sangre para el diagnstico de bacteriemias o fungemias, en medios de cultivo lquidos enriquecidos para la obtencin de microorganismos habituales y fastidiosos (la mayora) Bacteriemia: paso a la va sangunea de bacterias desde un foco infeccioso. Las bacteriemias pueden ser transitoria (paso desde un sitio colonizado que es manipulado o en etapa inicial de algunas infecciones sistmicas), intermitentes (paso a la sangre desde un foco infeccioso), y continuas (diseminacin sangunea producida por infeccin que se localiza en torrente circulatorio como por ej endocarditis bacteriana) Fungemia: la misma definicin previa aplicada a hongos. Infeccin del torrente sanguneo asociada a catter vascular central (ITS asoc CVC): Bacteriemia o fungemia en un paciente con un dispositivo vascular generalmente con uno o ms hemocultivos perifricos positivos, con manifestaciones clnicas de infeccin (fiebre, calofros y/o hipotensin) y sin otra fuente aparente de infeccin del torrente sanguneo.

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DESARROLLO DEL PROCESO FUNDAMENTO El cultivo de sangre se realiza en medio con caldo enriquecido en vial aerbico, que permite el desarrollo de la mayora de los agentes microbianos causantes de septicemia o bacteremia (bacterias u hongos) o en vial anaerobio cuando se sospecha de una bacteremia cuyo foco primario indica presencia de anaerobios (absceso, peritonitis, etc.) El estudio se realiza en equipo automatizado que corresponde a un instrumento Bactec (Becton Dickinson) de la serie fluorimtrica. Cada vial contiene un sensor qumico que detecta los cambios de CO2 ocurridos en el vial, producindose un aumento en la fluorescencia del sensor. El equipo hace una lectura continua cada 10 minutos de cada vial generando una curva con los datos obtenidos, mediante algoritmos predefinidos y segn el tipo de vial y protocolo de incubacin es capaz de detectar las muestras que estaran positivas, lo que es indicado a travs de un sistema de alarma al mismo tiempo que transmite los datos a un computador que contiene los datos del paciente (digitados previamente). 1. PROCEDIMIENTO HEMOCULTIVOS SISTEMA AUTOMATIZADO 1.1 Verificar que los datos de la solicitud de exmen se correspondan con los del vial, dar el nmero que corresponda al exmen y revisar lo que el mdico solicita en la orden, para definir protocolo de estudio (ver anexo 1). Colocar etiqueta de cdigo de barra de Omega en vial y en solicitud de examen. 1. 2 Ingreso al equipo automatizado: Abrir puertas de equipo Bactec Escanear cdigo de barra del vial, y luego escanear cdigo de barra de Omega Se encender una luz de color mitad verde y mitad roja continua sealando la posicin en que se debe colocar el vial. Introducir vial en la posicin sealada. Si hay ms de un vial, escanear uno a uno e ir introduciendo el vial en posicin que va indicando la luz. Al terminar cerrar puertas de equipo. El equipo est programado para asumir automticamente un protocolo de 5 das, por lo que se debe cambiar en caso de necesitar otro protocolo. (esto lo debe hacer TM) 1.3 Extraccin de viales sospechosos de positivos El equipo avisa con alarma sonora y luminosa que hay vial positivo. Abrir puerta de equipo Bactec Escanear cdigo de barra (que est en parte interna de puerta del equipo) que dice extraccin de viales positivos Se encender una luz mitad verde y mitad roja parpadeante en el lugar que se ubica vial positivo. Retirar vial positivo Escanear cdigo de barra del vial, la correcta lectura la comprobar al escuchar sonido de 3 tiempos. Cerrar puertas de equipo 1.4 Procesamiento de frasco positivo 1.4.1 Viales positivos corrientes (adultos y peditricos) Los viales detectados como positivos por el equipo deben subcultivarse en agar sangre y agar chocolate junto con realizar tincin de Gram. Colocar vial(es) en orden numrico, rotular las placas y portaobjetos a utilizar previamente y colocar en orden junto a vial correspondiente. Poner vial en posicin vertical y desinfectar tapn de goma con una trula de algodn estril con alcohol 70. Tras invertir los frascos con una suave agitacin, se extraen con jeringa aproximadamente 2 ml de sangre. Se inoculan unas 3 a 5 gotas en cada placa de agar sangre y agar chocolate, y por ltimo se pone una gota en zona central de un portaobjeto. Extender la gota suavemente con pipeta o asa estril, y dejar secar el frotis a temperatura ambiente (preparar 2 frotis por muestra) Diseminar las gotas inoculadas en las placas con asa estril. Incubar las placas en estufa de CO2 5% a 35 C. Dejar los frascos en interior de estufa atmsfera normal Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 32 de 105

Lo antes posible se debe proceder a realizar tincin de Gram y hacer su lectura e informe (existen plazos de tiempos de respuesta para preinforme de gram de hemocultivos positivos, (ver Manual de Control de Calidad de Microbiologa) Enviar un informe preliminar del hemocultivo positivo indicando tincin de gram. A la vez que se debe comunicar telefnicamente al mdico o enfermera a cargo del paciente para informar el resultado del gram. (ver procedimiento en Norma de tiempo de respuesta de exmenes crticos) Responsable es el Tecnlogo Mdico. Si en la tincin de Gram se observan simultneamente microorganismos gram positivos y gram negativos se debe agregar subcultivo en agar Mac Conkey. Si en la tincin de gram se observan levaduras subcultivar en agar sabouraud. En caso de no observar microorganismos en la tincin de gram, se debe considerar como presuntivamente positivo. En este caso se debe reingresar el vial al instrumento. Las placas de subcultivo se deben incubar por 3 das antes de darlas por negativas para crecimiento. Las placas de cultivo de los viales positivos se incubarn en estufa de CO2 a 35 C por 18 a 24 horas. 1.4.2 Viales positivos anaerobios Reunir material necesario: placa de agar sangre anaerobio agar sangre anaerobio con inhibidores caldo thioglicolato para anaerobios regenerado tambin agregar una placa de agar sangre corriente jarra de anaerobiosis sobre generador de anaerobiosis tira indicador de anaerobiosis Rotular las placas y tubos con nmero correspondientes Desinfectar tapn de goma con alcohol 70. Con jeringa extraer aprox 2 a 3 ml de muestra. Inocular 2 a 3 gotas en cada placa de medio de cultivo y en tubo de caldo thiglicolato Diseminar con asa estril en las placas, esterilizando entre primer y segundo cuadrante, sin esterilizar entrte 2 y tercer cuadrante. Colocar las placas para cultivo de anaerobio y tubo en la jarra. Introducir el sobre y la tira indicadora en la jarra y cerrar rpidamente. Marcar n de muestra y fecha de incubacin en exterior de jarra La placa de agar sangre corriente se debe incubar en estufa de CO2 a 35-37 C 1.5 Identificacin y antibiograma preliminares: En el caso de que en un corto perodo se hayan detectado 2 o ms muestras positivas de un mismo paciente, se proceder a realizar algunas pruebas de identificacin y antibiograma preliminares utilizando como inculo algunas gotas extradas de uno de los viales positivos, que se inoculan en un tubo de caldo de cultivo (thioglicolato, Mueller Hinton, Brain Heart o suero fisiolgico) Dependiendo del resultado de la tincin de Gram, se seguir el siguiente esquema: Cocos gram positivos en racimo: antibiograma en agar Mueller Hinton para Staphylococcus secreciones Cocos gram positivos en cadenas o diplococos: se espera desarrollo de subcultivo Diplococos gram negativos: se espera desarrollo de subcultivo Bacilos gram negativos: pruebas bioqumicas de identificacin (TSI, LIA, Citrato, MIO, urea) y antibiograma en agar Mueller Hinton para bacilos gram negativos secreciones Bacilos gram positivos: se espera desarrollo de subcultivo Cocobacilos gram negativos pequeos: se espera desarrollo de subcultivo Bacterias gram negativas y gram positivas en misma muestra: se espera desarrollo de subcultivo Levaduras: se espera desarrollo de subcultivo Los medios de cultivo y antibiogramas preliminares se incubarn segn las condiciones establecidas en los procedimientos correspondientes. Al da siguiente se procede a su lectura e interpretacin. Cualquier resultado dudoso o de valor lmite no ser informado hasta tener resultado de pruebas de estudio definitivas.

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1.6. Procesamiento de los subcultivos Despus de incubadas las placas de subcultivo, se revisa si hay desarrollo. Se debe confirmar si es necesario con gram de las colonias si es concordante con lo observado con la tincin de gram directa del vial efectuada anteriormente. Proseguir el estudio segn corresponda de acuerdo a la morfologa y afinidad tintorial del microorganismo desarrollado, para su identificacin y correspondiente estudio de susceptibilidad. Los microorganismos aislados que se consideren significativos se identificarn en forma definitiva y se les realizar en caso necesario el antibiograma correspondiente. Los microorganismos considerados contaminantes se identificarn slo a nivel de gnero. En general se considerarn contaminantes los siguientes microorganismos aislados en solo una muestra del set del paciente: Bacillus spp Corynebacterium spp Otros bacilos gram positivos Streptococcus grupo viridans Staphylococcus coagulasa negativa Tambin se considerar contaminacin cuando hay desarrollo de distintos tipos bacterianos en una misma muestra y slo en una muestra del set 1.7 Procesamiento de los viales negativos: Una vez cumplido el protocolo de incubacin, se extraern los viales negativos y despus de revisar con rdenes de exmenes, se eliminan siguiendo protocolo de eliminacin de desechos biolgicos. Si al final del perodo de anlisis un vial negativo parece positivo a simple vista, debe subcultivarse, realizar tincin de gram segn lo sealado anteriormente. 1.8 Informe: 1. Informe preliminar: tincin de Gram de muestras positivas, segn protocolo mencionado previamente. Si alguna de las muestras ha sido tomada por catter vascular central (CVC) se informa tiempo de positividad. 2. 2 informe preliminar: Cuando ya hay desarrollo bacteriano y se pueden realizar algunas pruebas rpidas de identificacin, se informa en sistema informtico de laboratorio (SIL), an cuando cepa contine en estudio para antibiograma u otro. Esto aplica especialmente a algunos Streptococcus beta hemolticos y Staphylococcus aureus. 3. Informe definitivo de resultados positivos: se informa identificacin de microorganismo y antibiograma si corresponde. Tiempo de positividad si corresponde. El tiempo de respuesta del informe final en general ser de 48 a 72 hrs despus de hacerse positivo. Informe de resultados negativos: los hemocultivos negativos completarn su perodo de incubacin de 5 a 21 das segn sea el caso (ver anexo 1) y transcurrido ese tiempo, se informarn como negativos ( a los 5 das, a los 10 das, etc) 1.9 Registros: En SIL (Omega y Epicenter), en orden de examen. Los preinformes de hemocultivos positivos adems de quedar registrados en SIL, si es horario inhbil se imprime el informe y se deja en seccin de microbiologa

2. DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE ITS ASOCIADA A CVC El objetivo es identificar la presencia de microorganismos causantes de bacteriemia asociada a CVC. Cuando se sospecha el diagnstico de ITS asoc CVC, se puede tomar la conducta de retirar o mantener el catter, segn esto el estudio microbiolgico a seguir ser segn los siguientes esquemas: 2.1 Cuando hay sospecha de infeccin y se retira catter Cultivo semicuantitativo con tcnica de Maki. (punta de catter) Y tomar hemocultivos perifricos (2 muestras) (10 ml cada muestra en pacientes adultos) Si hay secrecin purulenta en sitio de insercin tomar muestra con trula estril para cultivo corriente. (indicar tipo de muestra sitio insercin CVC) Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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2.1.1 Cultivo semicuantitativo de punta de catter (Tcnica de Maki) Muestra: segmento de catter (5 cm del extremo distal) en frasco estril Procedimiento de siembra: Se hace rodar el segmento del catter ayudndose con una pinza o trula estril, sobre la superficie de una placa de agar sangre 4 veces hacia adelante y atrs. Se retira el segmento y se deja en recipiente en que vena. La placa se incuba durante 24 horas a 35-37 C atmsfera normal. Al da siguiente se observa si hay desarrollo, si no es as se mantiene en incubacin hasta por 48 hrs. Si hay evidencias de crecimiento se cuentan las colonias (UFC) considerando como significativo la presencia de 15 o ms ufc por placa. Se inician los estudios de identificacin y antibiograma segn corresponda Si el recuento es menor de 15 UFC, y especialmente son distintos tipos bacterianos no se realizar estudio. 2.2 Cuando hay sospecha y no se retira catter: Tcnica de tiempo diferencial Hemocultivos pareados de muestras por puncin perifrica y por CVC. Se compara el tiempo diferencial de positividad (si se ha aislado el mismo microorganismo en ambas muestras) Primero se toma muestra perifrica y luego por CVC (para saber cunto volumen se debe extraer) Debe ser mismo volumen y simultneos (no ms de 10 minutos de diferencia). Si no tienen el mismo volumen no se puede aplicar criterio de tiempo diferencial. Rotular frasco por va perifrica y por CVC (o central) En CVC de ms de un lumen se debe obtener de puerta ms distal o el ms usado, o por el que est pasando nutricin parenteral, o de todos los lmenes (rotular muestra adecuadamente) Si hay secrecin purulenta en sitio de insercin tomar muestra con trula estril para cultivo corriente. (indicar tipo de muestra sitio insercin CVC) 2.2.1 Muestra: Llegarn 2 muestras en viales de hemocultivos rotuladas, una como hemocultivo perifrico y otra obtenida a travs de CVC (esta ltima la denominaremos muestra central). 2.2.2 Procedimiento: Verificar rotulacin Introducir a equipo Bactec 9240 los dos viales de hemocultivos al mismo tiempo. El protocolo de incubacin ser 5 das o en el caso de solicitud de hongos 10 das Escribir en orden de examen al lado de cada etiqueta del cdigo de barra si se trata de muestra perifrica o por CVC En caso de positividad trabajar como cualquier hemocultivo, con informe preliminar de tincin de Gram identificacin y estudio de suscceptibilidad segn corresponda. 2.2.3 Interpretacin: Si ambos hemocultivos resultan positivos y el hemocultivo central se hace positivo por lo menos 2 horas antes que el perifrico, se interpreta como diagnstico de infeccin asociada al catter vascular (criterio microbiolgico, siempre se debe correlacionar con clnica) 2.2.4 Informe: Se sigue las mismas indicaciones sealadas anteriormente. Si no hay crecimiento en ambos viales: hemocultivo perifrico o central negativo, en sus respectivos informes. Si la (s) muestras son positivas: Siempre escribir en tipo de exmen: hemocultivo central o perifrico, Cultivo corriente o cultivo hongos o ambos. Informar cada hemocultivo con su respectivo aislamiento bacteriano y susceptibilidad. Si la muestra perifrica y central han resultado positivas al mismo microorganismo, informar tiempo de positividad de la siguiente forma: hemocultivo (perifrico o central) positivo a las .. horas 3. Retiro del CVC por trmino de indicacin y sin infeccin local ni sospecha de infeccin sistmica por catter: Retirar catter No realizar cultivo de rutina

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REFERENCIAS 1. Loza E., Planes A., Rodrguez M. Procedimientos en Microbiologa Clnica, Hemocultivos. 1993. Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Madrid. 2. Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerbicos segn la muestra. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 53-85 3. Garca P., Paya E., Olivares R., Cotera A., Rodriguez J., Sanz M. Consenso: Diagnstico de las infecciones asociadas a catteres vasculares centrales. Rev Chil Infect 2003; 20(1): 41-50 ANEXOS Anexo 1. Protocolos de estudio Protocolo Cultivo corriente Cutivo bacterias anaerobias Cultivo de hongos Sospecha de endocarditis bacteriana subaguda Tiempo de incubacin 5 das 5 das 10 das 14 das ( por h.a.c.e.k) Gram y subcultivo a ciega a 7 y 14 das en agar chocolate y agar sangre manteniendo placas, por lo menos 72 horas a 37C en estufa CO2 se incuba por 21 das , gram y subcultivo a ciegas a los 7, 14 y 21 das en agar sangre y agar chocolate.

Brucella

Anexo 2. Diagnstico microbiolgico de ITS asociadas a CVC

Sospecha Infeccin torrente sanguneo asociado a Catter Vascular S se decide retirar catter No se retira catter

Se toman hemocultivos pareados por puncin perifrica y por CVC, para comparar el tiempo diferencial de positividad Se enva punta de CVC (5 cm.) para cultivo Tomar 2 hemocultivos perifricos (10 cc cada uno) Primero tomar hemocultivo perifrico (para determinar el volumen a extraer). Luego se toma por CVC. Ambos deben tener la MISMA cantidad de sangre (8-10 cc) Y deben ser simultneos (no ms de 10 minutos de diferencia entre uno y otra toma) Rotular 1 frasco perifrico y el otro por CVC (o central) Si CVC posee ms de un lumen, tomar del ms usado, o el que est pasando nutricin parenteral

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N 7. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE LQUIDOS DE CAVIDADES ESTRILES

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de lquidos estriles de acuerdo a mtodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de estas localizaciones. Esto incluye lquido cefalorraqudeo (LCR), lquido articular, lquido pleural, lquido asctico o peritoneal (estudio de peritonitis primaria), lquido de peritoneodilisis, lquido pericrdico y amnitico. . INTRODUCCIN El cultivo microbiolgico de lquidos biolgicos, como LCR, lquido pleural, asctico o articular, tiene como objetivo determinar la presencia o ausencia de microorganismos ante la sospecha clnica de un proceso infeccioso a nivel de cavidades, que en un individuo sano son estrictamente estriles. Un diagnstico microbiolgico precoz, es fundamental, ya que los procesos infecciosos en estas localizaciones son generalmente graves y con posibilidades de dejar secuelas en los pacientes afectados. Para el cultivo de estas muestras se utilizan medios de cultivo mejorados y enriquecidos (agar sangre cordero triptosa) y a veces es necesario utilizar medios con factores de crecimiento (agar chocolate suplementado), para la recuperacin de bacterias fastidiosas. ALCANCE Tecnlogos Mdicos, Tcnicos Paramdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la lectura e interpretacin de gram, evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico Paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos, de ingreso de viales al equipo automatizado (cuando corresponde) y de realizar frotis DESARROLLO DEL PROCESO 1. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) El procesamiento de las muestras de LCR siempre debe ser considerado como una urgencia clnica y microbiolgica. Se deben realizar los procedimientos microbiolgicos que proporcionen informacin clnica relevante en el menor tiempo posible. No se recomienda rechazar o no procesar ninguna muestra (por ejemplo, derramamiento durante el transporte) sin consultar previamente con el clnico responsable del paciente. Se procesar, indicando en el informe sobre la posibilidad de contaminacin debida al estado de la muestra a la llegada al laboratorio. 1.1. Materiales, equipos y software Insumos: agar sangre agar chocolate caldo thioglicolato pipeta estril Portaobjetos Kit tincin Gram asa estril medios de cultivos para identificacin bacteriana Equipos: Estufa de incubacin atmsfera de CO2, estufa de incubacin atmsfera normal, mechero. Software: Omega

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1.2 Procedimiento 12. Recepcin, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 13. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico. La muestra llegar en frasco estril. Debe ser sembrada lo antes posible despus de haber sido tomada, mantenida a t ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Centrifugar la muestra en eppendorf estril a 2500 rpm por 5 min. tomar el sedimento de la muestra con pipeta pasteur Colocar 2-3 gotas en un costado de la placa agar sangre y placa agar chocolate Depositar 2-3 gotas en caldo thioglicolato hasta el fondo y luego retirar mezclando el lquido con el medio realizar 2 frotis, extendiendo una gota entre 1-2 cm de dimetro; elegir un frotis para teirlo inmediatamente. diseminar siembra en las placas en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre el 1 - 2 cuadrante, terminar en estra. 14. Incubacin: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 C en estufa CO2, el caldo thioglicolato se incuba en estufa normal. 15. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnlogo Mdico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la deteccin de crecimiento macroscpico (turbidez) 16. Si los cultivos presentan crecimiento: Correlacionar los aislados con los morfotipos observados en la tincin de Gram. Trasladar al facultativo peticionario un informe preliminar con la identificacin presuntiva. Identificar los aislados a nivel de especie y realizar pruebas de sensibilidad a los antibiticos segn las normas estandarizadas vigentes Si el crecimiento se produce slo en los caldos de cultivo y no en las placas, realizar subcultivo del caldo en medios slidos (agar sangre, agar chocolate) y correlacionar el aislado con el morfotipo observado en la tincin de Gram. Cuando en el caldo se observe por tincin de Gram microorganismos que no crecen en el subcultivo, proceder a subcultivar en medios nutricionalmente ms ricos y en diferentes condiciones de incubacin. 17. Tincin de Gram Inmediatamente despus de recepcionar y sembrar muestra se debe teir frotis para tincin de Gram. El T. Mdico realiza su lectura, interpretacin e informe. Los resultados de la observacin de tincin de Gram directa quedarn registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informtico. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informar lo antes posible a clnico responsable de paciente. 1.3 Informe: Gram directo: Informar ausencia o presencia de leucocitos polimorfonucleares y ausencia o presencia de uno o varios morfotipos bacterianos y su cantidad en descripcin cualitativa (escasos, regular, abundante) Cultivo: - negativo 72 horas de incubacin - hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de. - antibiograma cuando corresponde. 1.4 Tiempo de respuesta - negativo, 72 horas de incubacin (informe a las 48 a 72 hrs hbiles - positivo, 24 a 72 horas hbiles 1.5 Registros: Sistema informtico del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ao, en archivos.

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2. LQUIDOS ESTRILES NO LCR (LQUIDO PLEURAL, ASCTICO, ARTICULAR, AMNITICO 2.1 Materiales, equipos y software Insumos: agar sangre agar chocolate caldo thioglicolato Vial de hemocultivo adulto (5 a 10 ml de muestra) o peditrico (menos de 5 ml de muestra) pipeta estril Portaobjetos Kit tincin Gram asa estril medios de cultivos para identificacin bacteriana Equipos: Estufa de incubacin atmsfera de CO2, estufa de incubacin atmsfera normal, mechero. Software: Omega 2.2 Muestra: generalmente llegar en frasco estril o jeringa estril sin medio de transporte. Puede llegar inoculada en un vial de hemocultivo adulto y en tubo estril para realizar gram 2.3 Procedimiento 1. Recepcin, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico. Debe ser sembrada lo antes posible despus de haber sido tomada, mantenida a t ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segn tipo de muestra, segn tcnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerbicos de este manual. centrifugar a 2500 rpm por 5 min. (tubo estril) realizar 2 frotis del sedimento de la muestra en tubo. elegir un frotis para teirlo inmediatamente. colocar vial en el equipo de hemocultivo, sacando la etiqueta del cdigo de barra y pegarla en la orden de examen (segn procedimiento habitual) 3. Incubacin: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 C en estufa CO2, el caldo thioglicolato se incuba en estufa normal. 4. Diagnstico microbiolgico Tincin de Gram: Inmediatamente despus de recepcionar y sembrar muestra se debe teir frotis para tincin de Gram. El Tecnlogo Mdico realiza su lectura, interpretacin e informe. Los resultados de la observacin de tincin de Gram directa) quedarn registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informtico. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informar lo antes posible a clnico responsable de paciente. Cultivo: Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnlogo Mdico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la deteccin de crecimiento macroscpico (turbidez) 2.4 Informe gram directo, informar presencia de leucocitos y cantidad o no se observan leucocitos informar morfologa bacteriana y cantidad cultivo negativo 72 horas de incubacin Si la muestra lleg o se inocul en vial de hemocultivo se completa incubacin de 5 das hubo desarrollo de. antibiograma cuando corresponde. 2.5 Tiempo de respuesta: negativo, 72 horas hbiles, si muestra se inocul en vial de hemocultivo 5 das de incubacin positivo, 48 a 72 horas Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 39 de 105

2.6 Registros: Sistema informtico del laboratorio y en reverso de orden de examen. Esta se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ao, en archivos.

3. LIQUIDO DE PERITONEODILISIS 3.1 Introduccin: La peritonitis, inflamacin de la membrana peritoneal, es la complicacin ms frecuente en pacientes que deben someterse a peritoneo dilisis. El estudio microbiolgico del lquido peritoneal tiene bajo rendimiento El cultivo del lquido abdominal obtenido de la primera bolsa en que se observa lquido turbio tiene mayor probabilidad de cultivo positivo. Los microorganismos ms frecuentes aislados son Staphylococcus coagulasa negativa, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas spp, entre otros. Sin embargo en este tipo de pacientes se pueden presentar infecciones por agentes inusuales, de lento crecimiento y distintos tipos de hongos. 3.2 Insumos: Vial de hemocultivo adulto aerobio Placas de agar sangre, chocolate y tubo agar Sabouraud Jeringa Alcohol 70, trulas de algodn 3.3 Equipos y software: Cmara de flujo laminar, centrifuga, estufa de incubacin, equipo de hemocultivos automatizado. Software: Omega 3.4 Procedimiento: 3.4.1 Tcnico paramdico que recepciona debe: verificar rotulacin de bolsa. verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad lavado de manos clnico retire bolsa externa colocarse guantes 3.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70 utilizando algodn. Las trulas de algodn se pasan slo una vez y se eliminan. Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70 Con jeringa estril puncione bolsa en el lugar desinfectado. Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto. 3.4.3 Vuelva a desinfectar una zona de la bolsa con alcohol 70 con algodn, puncione con jeringa y obtenga unos 5 cc de muestra. Inocule algunas gotas de muestra en una placa de agar sangre, agar chocolate y un tubo de agar sabouraud. Disemine en 3 cuadrantes en caso de las placas y en estra en el caso del tubo. 3.4.4 Incube las placas de agar sangre y chocolate en estufa de CO2 a 5% a 35 C, y el tubo de agar Sabouraud en estufa normal a 35 C. 3.4.5 Ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial. (ver protocolo de ingreso en Procedimiento n 6: Hemocultivos de este manual) 3.5 Diagnstico microbiolgico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincin de gram y siembra en placas de agar sangre y agar chocolate y posteriormente el estudio de identificacin bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos u hongos. 3.6 Informe si no hay crecimiento, se informa como: negativo 5 y 10 das de incubacin. si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado y antibiograma. 3.7 Registros Sistema informtico del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. Instituto de Salud Pblica de Chile. Procedimientos tcnicos de Laboratorio Clnico, Vol I: Bacteriologa General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serologa de la Sfilis. Santiago: 1994 Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerbicos segn la muestra. En: Manual de Microbiologa Clnica. Santiago: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo Ltda., 2001; 53-85 Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM Press, 1998; 37-126 Dilisis peritoneal crnica peditrica en Chile. Estudio multicentrico. Rev. Chil. Pediatr. 73 (2); 116-126, 2002 Dilisis peritoneal: complicaciones ms frecuentes. Revista de Posgrado de la Ctedra de Medicina, 2010; N 16 :199 Complicaciones infecciosas en dilisis peritoneal crnica. Rev. Chil. Pediatr, 2008; vol. 79 n 5 Santiago

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N 8. PROCEDIMIENTO CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO SUPERIOR

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de secreciones del aparato respiratorio superior de acuerdo a mtodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localizacin, como faringoamigdalitis (muestra farngea), sinusitis (senos paranasales), otitis (secrecin tica), conjuntivitis (secrecin ocular). Cabe considerar que la muestra farngea tambin se obtiene para estudio de portacin de S. aureus. Adems tambin recordar que la secrecin nasal solo sirve para estudio de portacin. ALCANCE Seccin de microbiologia, servicio laboratorio clnico Tcnicos paramdicos, tecnlogos mdicos y medico microbilogo de seccin microbiologia. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tincin. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: agar sangre agar chocolate agar Mac Conkey Portaobjetos Kit tincin Gram asa estril medios de cultivos para identificacin bacteriana Equipos: Estufa de incubacin atmsfera de CO2, estufa de incubacin atmsfera normal, gabinete de bioseguridad, mechero elctrico. Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO 1. 2. Recepcin, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico. La muestra generalmente llegar en trula con medio de transporte Stuart o trula estril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible despus de haber sido tomada, mantenida a t ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segn tipo de muestra, segn tcnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerbicos de este manual. Secrecin nasofarngea: Agar sangre. Incubar en estufa normal Secrecin de senos paranasales: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se solicita bsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 das Secrecin conjuntival: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se solicita bsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 das Secrecin tica: Agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey. Incubar en estufa de CO2, Mac Conkey en estufa atmsfera normal. Si se solicita bsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 das Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 42 de 105

3. 4.

Incubacin en estufa de cultivo a 35 a 37C a atmsfera con 5% CO2 por 48 hrs. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnlogo Mdico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Los ms frecuentes son: - Secrecin farngea: Streptococcus pyogenes Streptococcus beta hemoltico grupo C o G. - Secrecin senos paranasales: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Haemophilus sp. Branhamella catharralis Staphylococcus aureus - Secrecin ocular: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Haemophilus spp. Branhamella catharralis Staphylococcus aureus Bacilos Gram negativos - Secrecin tica: Bacilos Gram negativos (Pseudomonas, Proteus, etc.) Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Haemophilus spp. Staphylococcus aureus

5. 6.

Las placas que tienen escaso desarrollo o que permanecen negativas se incuban hasta por 48 hrs., excepto aquellas en que se solicite cultivo de hongos en que se incubar hasta por 5 das. En paralelo a la siembra se realiza frotis en lmina portaobjetos, para tincin de gram, excepto secrecin farngea.

Informe: Gram directo, excepto en secrecin faringea Informar: - presencia de leucocitos y cantidad - o no se observan leucocitos - informar morfologa bacteriana y cantidad Cultivo: - negativo 48 horas de incubacin - desarrollo de flora habitual - hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de. - antibiograma cuando corresponde. Tiempo de respuesta - negativo, 48 horas hbiles - positivo, 72 horas hbiles Registros: Sistema informtico del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ao, en archivos.

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9. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO INFERIOR

OBJETIVO Realizar estudio de secreciones del aparato respiratorio inferior de acuerdo a mtodos estandarizados para identificar microorganismos causantes de infecciones en esta localizacin. Las infecciones del tracto respiratorio inferior comprometen trquea bronquios, bronquiolos, alvolos y parnquima pulmonar. El diagnstico etiolgico presenta dificultades porque depende de la calidad de la muestra, por lo que se debe evitar la posible contaminacin orofarngea. Las muestras para estudio de infecciones del tracto respiratorio bajo son generalmente expectoraciones, aspirados traqueales y lavados broncoalveolares. ALCANCE Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la lectura e interpretacin de tincin de gram directa de muestra, evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES Expectoracin espontnea: Obtencin de esputo por parte del paciente, para diagnstico en cuadros de neumonas adquiridas en la comunidad (NAC) o estudio de TBC. Expectoracin inducida: Obtencin de esputo en paciente que no puedan expectorar por s solos, para diagnstico en cuadros de neumonas adquiridas en la comunidad, intrahospitalarias o control en pacientes con fibrosis qustica. Aspirado traqueal o endotraqueal: Es la muestra obtenida por la aspiracin a travs del tubo endotraqueal, se usa en pacientes intubados y con ventilacin mecnica. Fibrobroncoscopia: procedimiento que tiene por objeto la obtencin de muestras de la va area o al segmento pulmonar. Las muestras ms empleadas son el cepillado bronquial, el lavado broncoalveolar (LBA), pero tambin se emplean el lavado bronquial y la biopsia transbronquial. Lavado Bronquial: Consiste en la instilacin de suero fisiolgico estril en un bronquio, seguida de una aspiracin inmediata para recoger la muestra. La muestra recogida no representa material bronquiolar ni alveolar y es equivalente a un aspirado endotraqueal. Lavado Broncoalveolar: Es una mezcla entre secreciones bronquiales y suero fisiolgico y es obtenido por medio de un fibrobroncoscopio en el segmento del bronquio afectado. Placa agar MacConkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayora de las bacterias habituales y levaduras. Placa de agar Chocolate: medio de cultivo enriquecido y no selectivo, contiene suplemento nutritivo que permite la recuperacin de microorganismos fastidiosos como Haemophilus spp. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Medios de Cultivo: placa Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar chocolate suplementado, Agar Sabouraud y medios para identificacin. Suero fisiolgico estril en tubos de 5 ml y 9,9 mL Portaobjetos, kit para Tincin de Gram Pipetas Pasteur Micropipeta y puntas estriles Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 44 de 105

Perlas de vidrio estriles Asas estriles Equipos: estufa de incubacin, mechero, vrtex Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO 1. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Para el procesamiento primero se realiza tincin de gram y luego la siembra. 2.1 Evaluacin de calidad de la muestra: por medio de la Tincin de Gram, en donde se evala la presencia de clulas epiteliales y de polimorfonucleares, lectura a objetivo 10X por lo menos 10 campos. Clulas epiteliales: se evala si hay presencia de 10 o ms clulas por campo. Polimorfonucleares: se cuantifica ms de 25 pmn por campo, Entre 10 y 25 pmn por campo y Menos de 10 pmn por campo Criterio de rechazo de la muestra: est dado por la presencia de 10 o ms clulas por campo lo que indica contaminacin con flora respiratoria alta, siendo poco representativa del tracto respiratorio inferior. 3. Siembra: responsabilidad de tcnicos paramdicos. Es de acuerdo al tipo de muestra y del volumen que llega al laboratorio. Debe ser sembrada lo antes posible. Se describen a continuacin las tcnicas para el procesamiento segn muestra (ver anexo 1 Tabla resumen) 3.1 Expectoracin y aspirados endotraqueales con volumen menor a 0.5 mL, se realiza cultivo simple (o cualitativo) Aspirado endotraqueal en horario inhbil se realiza cultivo simple Vorterear muestra por lo menos 1 minuto o hasta que este homognea. Seleccionar la porcin ms purulenta de la muestra Con pipeta recoger una porcin de la muestra e inocular en cada placa. Sembrar y aislar con asa estril en tres cuadrantes. 3.2 Aspirado endotraqueal, en horario hbil, se realiza cultivo cuantitativo: 1. Vorterear la muestra hasta que est homognea 2. Diluir con suero fisiolgico 0.9% agregando igual cantidad de suero que volumen de la muestra. 3. Agitar la muestra con las perlas de vidrio estriles durante 2 a 3 minutos. 4. Extraer con micropipeta 100 L (0,1 mL) de muestra y diluir con 9,9 mL de suero fisiolgico 0.9%, agitar. (Dilucin 1:100) 5. Sembrar 100 L (0,1 mL) de esta dilucin en placa de agar sangre y agar Mac Conkey. Marcar estas placas como D1 6. Sembrar 10 L (con asa estril de 10) las placas de agar sangre y agar MacConkey marcadas como D2 con estra unidireccional. 3.3. Lavado broncoalveolar: se realiza cultivo cuantitativo Homogeneizar la muestra En mitad de cada placa sembrar con asa de 1 uL haciendo una lnea central y luego pasando por la lnea en forma de zig zag. En la otra mitad de la placa sembrar de igual modo pero con un asa de 10 uL. Si se solicita hongos sembrar cuatro tubos de sabouraud. 4. Incubacin de las placas MacConkey es en atmsfera normal a 35 - 37 C y las placas sangre y chocolate en atmsfera de 5% CO2 a 35C. A las 24 horas de incubacin la mitad de los tubos sabouraud se deja incubando a temperatura ambiente y la otra mitad se mantiene a 35-37C. 5. Las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal fin hasta completar el estudio microbiolgico y se realice el informe final. 6. Las placas de cultivo son observadas al da siguiente por el profesional a cargo discriminando entre desarrollo de flora habitual del desarrollo de microorganismos patgenos, si corresponde se har recuento de colonias, identificacin y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se vuelven a incubar hasta completar su tiempo de estudio. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Interpretacin del cultivo: el responsable es el Tecnlogo Mdico. Son de importancia clnica Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacilos gram negativos, Nocardia, Haemophilus spp, entre otros. Si es predominante se informa Moraxella spp. En los cultivos cuantitativos el recuento indica probabilidad de colonizacin o infeccin por el microorganismo aislado. Tambin se debe informar si hubo desarrollo de flora habitual. Se considera para la descripcin cualitativa de cantidad: Informe Muy escaso desarrollo Escaso desarrollo Moderado desarrollo Abundante desarrollo Desarrollo en las placas de cultivo Crecimiento de muy pocas colonias aisladas (1 a 3 cols) crecimiento en primera parte de la siembra en placa crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placa crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en placa

Interpretacin de recuento cuantitativo: Aspirado endotraqueal Placas dilucin 1(D1) 1 colonia = 2.000 UFC/ mL (2 x 103) Ausencia colonias = <10 3 UFC/ mL 50 colonias = 100.000 UFC/ mL Placas dilucin 2 (D2) 1 colonia = 20.000 UFC/ mL (2 x 104) Ausencia colonias = <10 4 UFC/ mL 50 o ms colonias en D2 = >106 UFC/ mL Lavado broncoalveolar n colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 L) n colonias x 100 (siembra con asa de 10 L)

Tiempo de respuesta: Cultivo negativo a las 72 hrs. Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. hbiles Cultivo no apto: dentro del da hbil. Informe: Tincin de gram Cultivo no apto: Muestra respiratoria rechazada, Gram de screening alterado Cultivo negativo: Negativo a las 72 horas hbiles. Cultivo positivo: se indica el recuento si corresponde. Hubo desarrollo ........... de .............. con su correspondiente antibiograma. El informe debe incluir un detalle de cada microorganismo aislado, con su recuento y antibiograma correspondiente. Registros: El resultado quedar registrado en sistema informtico y en reverso de orden de examen. REFERENCIAS Fica A., Cifuentes M. y Herv B. Comit de Infecciones Intrahospitalarias, Sociedad Chilena de Infectologa. Actualizacin del Consenso Neumona asociada a ventilacin mecnica Primera parte. Aspectos diagnsticos. Rev Chil Infect 2011, 28(2):130.-151 ANEXOS Anexo 1: Resumen de tipo de cultivo segn muestra Muestra Expectoracin Aspirado endotraqueal Aspirado endotraqueal Aspirado endotraqueal Lavado broncoalveolar Tipo de cultivo a realizar Cultivo simple Cultivo simple Cultivo cuantitativo Cultivo simple Cultivo cuantitativo

Siempre Volumen < 0.5 mL Volumen > 0.5 mL en horario hbil En horario inhbil Siempre Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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N 10. PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE SECRECIONES DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras clnicas de acuerdo a mtodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de infecciones de piel y tejidos blandos, incluyendo a todas aquellas que afectan a piel, tejidos subcutneo y muscular. ALCANCE Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayora de las bacterias habituales y levaduras. Caldo Thioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Medios de cultivo: placa agar Sangre, agar MacConkey, caldo thioglicolato Portaobjetos kit para Tincin de Gram Pipetas pasteur asa estril medios de cultivos y kits para identificacin bacteriana Equipos: estufa de incubacin atmsfera normal, mechero Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO 1. 2. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. Siembra: responsable es el Tcnico Paramdico. La muestra generalmente llegar en trula con medio de transporte Stuart o trula estril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible despus de haber sido tomada, mantenida a t ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Si la muestra viene en trula seca se debe sembrar lo antes posible (2 horas), en caso que venga en un medio de transporte (Stuart) se puede mantener hasta 8 horas a temperatura ambiente. Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segn tipo de muestra, segn tcnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerbicos de este manual. Se siembra en tres cuadrantes cada placa de medio de cultivo y se realiza frotis para gram. En el caso de muestras de trozos de tejidos blandos (biopsia de piel, tejido subcutneo, tejido muscular, fascia, etc) se proceder segn lo descrito en procedimiento n 11: Cultivos de tejido seo. En un mortero Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 47 de 105

estril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homognea. Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey adems de realizar dos frotis para gram. Despus de finalizada la siembra, las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal, hasta la obtencin del informe final. Las placas se incuban en estufa de cultivo a 35 a 37C a atmsfera normal por 18 a 24 hrs. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al da siguiente por el Tecnlogo Mdico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso (ver interpretacin de cultivo). Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estn negativas se dejarn en incubacin hasta un perodo de 48 horas. Se considera para la descripcin cualitativa de cantidad: Informe Muy escaso desarrollo Escaso desarrollo Moderado desarrollo Abundante desarrollo Desarrollo en las placas de cultivo Crecimiento de muy pocas colonias aisladas crecimiento en primera parte de la siembra en placa crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placa crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en placa

3. 4.

5.

6.

Interpretacin del cultivo: el responsable es el Tecnlogo Mdico. Este tipo de muestra tiene una alta probabilidad de desarrollarse flora habitual que puede ser del mismo paciente como del ambiente. Se informa como desarrollo de flora habitual cuando hay presencia de Corynebacterium spp., Staphylococcus coagulasa negativo, Neisseria spp. no patgenas, y estreptococos alfa y no-hemoltico. Puede haber excepciones, se estudiaran cuando se encuentren en estado puro y se relacione con la clnica del paciente. Se informan como microorganismos patgenos a estreptococos beta-hemolticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae, tanto en las heridas agudas como en las crnicas.

Tiempo de respuesta: Cultivo negativo a las 48 horas, (si muestra corresponde a tejido se incuba 72 hrs) Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. hbiles Informe: Tincin de Gram. Cultivo negativo a las 48 horas hbiles Cultivo positivo: se informa Hubo desarrollo de ........ cantidad de .............. con su antibiograma. Registros: El resultado quedar registrado en sistema informtico y en reverso de orden de examen.

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N 11. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE TEJIDO SEO

OBJETIVO Realizar procedimientos para el diagnstico microbiolgico de infecciones de huesos y de tejidos obtenidos mediante biopsia de acuerdo a mtodos estandarizados para obtener resultados confiables. ALCANCE Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. Tcnicos Paramdicos, Tecnlogos Mdicos y Mdico Microbilogo de Seccin Microbiologa.

RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES Biopsia: procedimiento con tcnica asptica en que obtiene muestras de tejido para su posterior anlisis microbiolgico e histopatolgico. Placa Agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de Agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayora de las bacterias habituales y levaduras. Caldo Tioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Medios de Cultivo (placa agar sangre, agar Mac Conkey, caldo tioglicolato Portaobjetos, kit para Tincin de Gram Pipetas pasteur Mortero Equipos: estufa de incubacin, mechero Software: Omega

DESARROLLO DEL PROCESO 1. 2. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. Siembra: responsable es el Tcnico paramdico y de acuerdo al horario de recepcin se realiza siguiente procedimiento:

Horario hbil: En un mortero estril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homognea. Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey adems de realizar dos frotis para gram. Si la muestra es un tejido que no se puede macerar (ej cartlago o hueso denso) se coloca caldo thioglicolato en el frasco de la muestra en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente inmersa. Horario inhbil Se agrega al frasco en que viene la muestra caldo tioglicolato, en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 49 de 105

inmersa en el caldo, (como alternativa se puede usar caldo soya) 3. 4. 5. Incubacin en estufa de cultivo a 35 a 37C a atmsfera normal por 18 a 24 hrs. Las muestras deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo. Las placas de cultivo incubadas son observadas al da siguiente por el profesional a cargo. Aquellas muestras consideradas positivas se realiza identificacin microbiana y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se mantienen en incubacin, hasta su informe final siendo revisadas cada da. Las muestras que estn en caldo se siembran con el mismo procedimiento del horario hbil, se observa si presenta turbidez cada da y antes de completar los cinco das de estudio se traspasa a placas de agar sangre y agar Mac Conkey. Interpretacin del cultivo: el responsable es el Tecnlogo mdico La presencia de microorganismo de flora habitual solo se informar si es clnicamente significativa. Se consideran patgenos a estreptococos beta-hemolticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae. Aunque cabe considerar que por ser este tipo de muestras normalmente estriles, cualquier microorganismo podra tener significado clnico. La presencia de bacterias anaerobias se puede observar por la presencia de turbidez en caldo tioglicolato, las placas incubadas en atmsfera normal sern negativas. En estos casos la tincin de gram del caldo turbio y el gram directo de la muestra pueden orientar a la presencia de anaerobios. Tiempo de respuesta: Cultivo negativo 5 das hbiles Cultivo positivo: 48 a 72 hrs. hbiles Informe: Tincin de Gram: si la muestra es sugerente de presencia de anaerobios agregar comentario. Cultivo negativo a los 5 das de incubacin Cultivo positivo: Hubo desarrollo de.................. con su correspondiente antibiograma Registros: El resultado quedar registrado en sistema informtico y en reverso de orden de examen.

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N 12. PROCEDIMIENTO DE CULTIVOS DE SECRECIONES INTRAABDOMINALES

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de secreciones intraabdominales de acuerdo a mtodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localizacin. Esto incluye secreciones de peritonitis secundaria y terciaria, colecciones intraabdominales y retroperitoneales, y bilis. Se excluyen las muestras de lquido peritoneal o asctico de peritonitis primaria (peritonitis bacteriana espontnea que se incluye en Cultivo de lquidos estriles) INTRODUCCIN La peritonitis bacteriana se produce por la contaminacin de la cavidad abdominal por materia intestinal o del tracto genito-urinario, puede ser secundaria a una apendicitis o a una diverticulitis u otro proceso en que se produzca perforacin del tracto intestinal, necrosis isqumica de la pared o por translocacin bacteriana. Los abscesos intraabdominales pueden corresponder a infecciones intraabdominales evolucionadas que se presentan ya como abscesos intraabdominales en el momento del diagnstico inicial. Las peritonitis secundarias tambin pueden ser postoperatorias (por dehiscencia de sutura o perforacin iatrognica) o pueden aparecer tras un traumatismo abdominal penetrante o cerrado (peritonitis postraumticas). La peritonitis bacteriana espontnea (PBE) en adultos se presenta en pacientes con cirrosis heptica y ascitis. En general la peritonitis secundaria suele estar causada por una flora polimicrobiana mixta aerobia y anaerobia con predominio de enterobacterias, E.faecalis, Bacteroides fragilis y estreptococos anaerobios ALCANCE Seccin de microbiologia, servicio laboratorio clnico Tcnicos paramdicos, tecnlogos mdicos y medico microbilogo de seccin microbiologa. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo, de realizar los inculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tincin. DEFINICIONES Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayora de las bacterias habituales y levaduras.

DESARROLLO DEL PROCESO MUESTRA: Lquido peritoneal, lquido abdominal, lquido biliar o bilis, lquido pancretico, coleccin abdominal, absceso pared abdominal u otro contenido: heptico, vesicular, mesentrico, renal.

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SIEMBRA: En los medios establecidos (placa de agar sangre y agar Mac Conkey) realizando aislamiento en tres cuadrantes y segn procedimiento descrito (Procedimiento n 1: Siembra de muestras para cultivos aerbicos). En caso de solicitar estudio de anaerobios se proceder de acuerdo a procedimiento descrito para ello (n 16: Cultivos de bacterias anaerobias). DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO: Informe de tincin de gram Cultivo: Se estudiarn todos los microorganismos predominantes o microbiolgicamente relevantes, desarrollados en los medios de cultivos, de acuerdo a evaluacin realizada por TM. TIEMPO DE RESPUESTA: a. Cultivo negativo a las 72 horas b. Cultivo positivo: preinforme a las 24 o 48 hrs. segn corresponda Informe definitivo de cultivo y antibiograma a las 48 o 72 horas hbiles (excepcionalmente puede requerir ms tiempo (cepas de lento crecimiento, cultivos mixtos, necesidad de repeticin de pruebas de identificacin y/o susceptibilidad) INFORME a. b. Negativo a las 72 hrs. Cultivo positivo: Hubo desarrollo de: Antibiograma (si corresponde)

REGISTROS: El resultado quedar registrado en sistema informtico Omega y en reverso de orden de examen.

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13. CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO GENITAL

OBJETIVO Realizar el procesamiento de muestras de secreciones del aparato genital de acuerdo a mtodos estandarizados, para el diagnstico microbiolgico de infecciones de esta localizacin. Tambin se aplica al estudio de portadores de algunos agentes (ejemplo: Streptococcus agalactiae en mujeres embarazadas) ALCANCE Tecnlogos Mdicos y Tcnicos Paramdicos de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: responsable de la lectura e interpretacin de tincin de gram directa de muestra y examen al fresco, evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas obtenidas y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar los frotis segn corresponda. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Medios de Cultivo: placa Agar Sangre, Agar chocolate, agar Thayer Martin, agar Sabouraud, caldo Todd Hewitt y medios para identificacin. Tubos con suero fisiolgico estril Portaobjetos, kit para Tincin de Gram Pipetas Pasteur Asas estriles Equipos: estufa de incubacin, mechero, vrtex Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO 1. SECRECION URETRAL La uretritis (inflamacin del conducto por donde pasa la orina en el hombre) se subdivide en gonoccica (causada por Neisseria gonorrhoeae) y no gonoccica (causada por Chlamydia trachomatis y Ureaplasma urealyticum). Material: Trula estril con Stuart Agar Sangre Agar Chocolate Agar Sabouraud Agar Thayer Martin (para cultivo de gonococo) Muestra: 1 trula para cultivo corriente 2 trula para cultivo de gonococo y gram Procedimiento: 1. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la trula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate. 2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estra. 2.3. Inocular con la 2 trula en primer cuadrante de placa de agar Thayer Martin 2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un rea no mayor a 2 cm. con la trula. 2.4. Diseminar todas las placas, en 3 cuadrantes, esterilizar el asa entre 1 - 2 cuadrante. Terminar en estra. 3. Incubar a 35-37 C en estufa CO2 las placas de agar sangre, agar thayer Martin y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al da siguiente por el Tecnlogo Mdico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estn negativas se dejarn en incubacin hasta un perodo de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioqumicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioqumicas). Informe: Tincin de Gram: Cuando existe sospecha de gonorrea, la tincin de Gram es suficiente para confirmar el diagnstico clnico, aunque igual debe realizarse el cultivo. En infecciones agudas por gonococo, se observan diplococos gram negativos, intra y extracelulares, con aspecto de granos de caf. En las formas crnicas o en el inicio de la enfermedad, pueden hallarse diplococos gram negativos solo extracelulares. Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 72 hrs hbiles.

2. FLUJO VAGINAL / SECRECION VAGINAL Las infecciones vaginales son principalmente causadas por Trichomonas vaginalis, Candida albicans o se trata de una vaginosis bacteriana. En nias prepberes pude haber infecciones por otros agentes como Enterobacterias, Streptococcus pyogenes, entre otros. A estas muestras se realiza: cultivo corriente Cultivo de hongos (levaduras) Tincin de Gram Examen al fresco Cultivo de gonococo slo a nias prepberes en caso de sospecha. En resto de pacientes siempre debe ser muestra cervical Material: Agar Sangre Agar Chocolate Agar Sabouraud Agar Thayer Martin (slo si se solicita cultivo de gonococo) Considerar que las muestras vaginales no son la muestra indicada para estudio de gonococo, slo se aplicar estudio para pacientes menores. Muestra: Debe venir con 2 trulas (para cultivo corriente, cultivo de hongos, gram y examen al fresco) Procedimiento: 1. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la trula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate. 2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estra. 2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un rea no mayor a 2 cm. con la trula. 2.4. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1 - 2 cuadrante. Terminar en estra. 3. Incubar a 35-37 C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud 4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al da siguiente por el Tecnlogo Mdico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad si corresponde. En cambio las muestras que estn negativas se dejarn en incubacin hasta un perodo de 48 horas. Informe Tincin de gram Examen al fresco: en la observacin directa se informan clulas descamativas, leucocitos y bacterias, debe informarse la presencia o ausencia de elementos compatibles con Trichomonas vaginalis y levaduras Cultivo corriente, de hongos y gonococo: informe final 48 72 hrs. hbiles

3. SECRECIN CERVICAL La secrecin cervical es aquella que proviene del crvix (cuello uterino); la infeccin cervical (cervicitis) es, por lo general, causado por Neisseria gonorrhoeae y Chlamidia trachomatis Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 54 de 105

Material: Trula estril con Stuart Agar Sangre Agar Thayer Martin (para cultivo de gonococo) Muestra: Una trula para cultivo corriente y cultivo de gonococo y gram Procedimiento: 1. Recepcin, ingreso y numeracin: se sigue el procedimiento comn de muestras microbiolgicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la trula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y Thayer Martin. 2.2. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1 - 2 cuadrante. Terminar en estra. 3. Incubar a 35-37 C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar Thayer Martin, y en estufa normal el agar Sabouraud. 4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al da siguiente por el Tecnlogo Mdico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clnica en cada caso. Segn esto se realiza pruebas de identificacin de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estn negativas se dejarn en incubacin hasta un perodo de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioqumicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioqumicas). Informe: Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 72 hrs hbiles.

4. SECRECION INTROITO / SECRECION PERIANAL Consiste en la pesquisa de la colonizacin vaginal y/o rectal de Streptococcus beta hemoltico grupo B (S agalactiae) a las mujeres embarazadas entre las 35 y 37 semanas para luego administrar antibiticos intraparto a aquellas con cultivos positivos. Materiales: Agar Sangre Caldo Todd Hewitt Trula estril con medio de transporte Stuart Muestra: Debe venir en medio transporte stuart En la orden de examen, vendr como: secrecin perianal, introito, o portacin de Streptococcus hemoltico grupo B. Procedimiento: 1. Introducir la trula del medio de transporte en caldo todd hewitt 2. incubar por 3 hrs. a 37 C en estufa normal 3. despus del perodo de incubacin, agite la trula en el caldo 4. saque la trula del caldo y sembrar en la placa agar sangre 5. diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1 - 2 cuadrante, terminar en estra. 6. incubar placa de agar sangre a 35-37 C en estufa normal por 24 a 48 hrs. 7. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al da siguiente por el Tecnlogo Mdico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio. Informe: Cultivo corriente: informe final 48 72 hrs hbiles

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14. CULTIVOS MICROBIOLGICOS DE INSUMOS CLNICOS

OBJETIVO Realizar procesamiento de acuerdo a mtodos estandarizados, de muestras de soluciones preparadas que son administradas a pacientes por va oral o parenteral, con fines teraputicos, para el estudio de eventos adversos asociados a contaminaciones de estas soluciones. Este documento incluye cultivo de: Hemoderivados Nutricin parenteral ALCANCE Seccin de microbiologia, servicio laboratorio clnico Tcnicos paramdicos, tecnlogos mdicos y mdico microbilogo de seccin microbiologa. RESPONSABILIDAD Tecnlogo medico: responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de as cepas obtenidas y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: responsable de la siembra de la muestra segn el procedimiento y de ingresar los viales de cultivo al equipo automatizado. DEFINICIONES Hemoderivados: componentes derivados de sangre usados para transfusin a pacientes Nutricin parenteral (NP): solucin que contiene una mezcla de nutrientes, que se administra por va parenteral a travs de un catter de acceso vascular central o perifrico segn el tipo de NP. En el hospital se uitilizan soluciones listas para su uso de fabricacin comercial. DESARROLLO DEL PROCESO 1. CULTIVO DE HEMODERIVADOS 1.1 Objetivo: Identificar presencia o ausencia de microorganismos en concentrado de glbulos rojos, plasma, sangre total u otro hemoderivado. Se realiza en caso de presentarse alguna reaccin adversa en un paciente que est siendo transfundido. 1.2 Materiales e insumos - vial de hemocultivo aerobio para adulto placa de agar sangre jeringas
1.3 Instrumentacin o equipos y accesorios

estufa de incubacin atmsfera normal campana de flujo laminar para siembra Equipo automatizado de hemocultivos

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1.4 Procedimiento: 1.4.1 La va de infusin del hemoderivado al paciente, debe ser retirada por el tecnlogo mdico de banco de sangre y enviada al laboratorio de microbiologa con todos los datos del paciente. El estudio microbiolgico incluye bacterias aerobias y hongos. 1.4.2 Tcnico paramdico que recepciona debe: verificar rotulacin de bolsa. verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad lavado de manos clnico retire bolsa externa colocarse guantes desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70 utilizando algodn estril. Las trulas de algodn se pasan slo una vez y se eliminan. Repita este procedimiento en a lo menos 2 oportunidades. retire sello de 1vial de hemocultivo adulto y desinfecte goma con alcohol 70. con jeringa estril atraviese bolsa en el lugar desinfectado. aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial adulto. luego siembre en agar sangre unas gotas del conector de la bolsa. Disemine en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre cuadrantes incubar las placas en estufa CO2 a 35-37. ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial. 1.4.3 Diagnstico microbiolgico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincin de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente se realiza el estudio de identificacin bacteriana con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios u hongos. 1.5 Informe -

si no hay crecimiento, se informa como: negativo a los 10 das de incubacin. si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado.

1.6 Registros Sistema informtico del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente.

2. CULTIVO DE NUTRICIN PARENTERAL 2.1 Objetivo: Identificar presencia o ausencia de microorganismos en la nutricin parenteral. Se realiza en caso de sospecha de bacteremia asociada a nutricin parenteral (si proviene de un paciente), o como evaluacin indirecta de la tcnica asptica, en la preparacin de dicha nutricin (como control de calidad). El estudio microbiolgico de la nutricin parenteral incluye bacterias aerobias, anaerobias, anaerobias facultativas y hongos. 2.2. Materiales e insumos: - viales de hemocultivos: 1 frasco aerobio para adultos y 1 frasco anaerobio. agar sangre jeringas
2.3 Instrumentacin o equipos y accesorios

estufa de incubacin corriente campana de flujo laminar para siembra Equipo automatizado de hemocultivos

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2.4 Procedimiento: 2.4.1 Tcnico paramdico que recepciona debe: verificar rotulacin de bolsa. verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad lavado de manos clnico retire bolsa externa colocarse guantes 2.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70 utilizando algodn estril. Las trulas de algodn se pasan slo una vez y se eliminan. Repita este procedimiento en por lo menos 2 oportunidades. Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70 Con jeringa estril atraviese bolsa en el lugar desinfectado. Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto. 2.4.3 Nuevamente realice desinfeccin de bolsa retire sello de hemocultivo anaerobio y desinfecte tapn de goma con alcohol 70 abra nueva jeringa aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial anaerobio 2.4.4 Luego siembre en agar sangre varias gotas del conector de la bolsa. Disemine en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre cuadrantes. Incubar placa en estufa CO2 a 35-37. Nota: la nutricin parenteral proveniente de farmacia no llegar con conector o bajada de suero.

2.4.5 Ingrese viales a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular los viales. 2.5 Diagnstico microbiolgico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincin de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente el estudio de identificacin bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos, anaerobios u hongos. 2.6 Informe -

si no hay crecimiento en ambos viales, se informa como: negativo si existe crecimiento en uno o ms viales: se informa el microorganismo aislado.

2.7 Registros Sistema informtico del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente.

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N 15. PROCEDIMIENTO DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBITICOS

OBJETIVO Determinar la susceptibilidad de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, de acuerdo a mtodos estandarizados, con el propsito de emplear en una primera aproximacin, su resultado como factor predictivo de la eficacia clnica de la terapia en el paciente. En este procedimiento se describen: Antibiograma por difusin en agar o Tcnica de Kirby-Bauer Antibiograma por difusin-dilucin en agar (E-test) ALCANCE Tecnlogos Mdicos y Tcnicos Paramdicos de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de definir estudio, preparacin de inculos para antibiograma, de la lectura e interpretacin, registro de resultados y de la validacin del informe. El TM a cargo de la muestra en estudio que requiera antibiograma es el responsable directo. Tcnico paramdico: Responsable de la ejecucin de los antibiogramas por difusin en agar con los inculos de las cepas ya preparados por T. mdico. DEFINICIONES Antibiograma: estudio en que se define la actividad in vitro de un antibitico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o poblacin bacteriana El trmino sensible indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibicin puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en funcin del tipo de infeccin y de la especie considerada. El trmino intermedio indica que el halo de inhbicin traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas cocentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis ms elevadas de lo habitual. El CLSI tambin incluye en esta categora aquellos casos de antimicrobianos con mrgenes de toxicidad estrechos en los que pequeos errores tcnicos podran suponer cambios de interpretacin en la categora clnica. Finalmente, el trmino resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias especficos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada respuesta clnica cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano.

DESARROLLO DEL PROCESO 1. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIN EN AGAR (TCNICA DE KIRBY-BAUER) 1.1 Fundamento: El antibiograma por difusin en agar consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro impregnados con los diferentes antibiticos a testear. Tan pronto el disco se pone en contacto con la superficie hmeda del agar, el antibitico difunde al agar. Esta difusin es radial a travs del espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de concentracin. Transcurridas 18-24 horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicin. La concentracin de antibitico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentracin crtica y se aproxima a la concentracin mnima Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 59 de 105

inhibitoria (CIM) obtenida por mtodos de dilucin. Sin embargo, este mtodo no permite una lectura directa del valor de la CIM. Por ello, se compara con valores definidos de punto de corte que se han extrapolado de un gran nmero de cepas de CIM conocidas que han estado previamente determinadas por otros mtodos de determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: mtodo de dilucin). Existen, por lo tanto, unos dimetros de inhibicin, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibicin debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) segn las categoras establecidas por el CLSI , vigentes para cada ao. 1.2 Materiales, equipos y software Insumos: Placas de agar Mueller Hinton y agar Mueller Hinton sangre Sensidiscos comerciales Trulas estriles Tubo con suero fisiolgico o agua destilada estril regla para medicin de halo pinzas Equipos: Densitmetro (medidor de turbidez) Calibrador Mac Farland 0,5 Vrtex Estufa de incubacin atmsfera normal y CO2 Dispensadores de sensidiscos Software: Omega 1.3 Procedimiento 1.3.1 mantencin de sensidiscos: Todos los discos deben almacenarse en desecadores a temperaturas de menos 20 C (freezer). Los cartridge que estn en uso permanecen refrigerados en el dispensador. Sensidiscos de betalactmicos como ampicilina, oxacilina, penicilina, cefazolina, cefalosporinas de 3 generacin, cefoperazona-sulbactam, deben permanecer refrigerado slo la cantidad que se usar durante la semana, el resto debe permanecer congelado. Imipenem debe siempre permanecer congelado para su uso. Deben abrirse slo despus de que la temperatura interior del contenedor se haya equilibrado con el medio ambiente, a fin de evitar la condensacin de humedad en los discos. Retire del refrigerador 15-20 minutos y del congelador 1 hora antes de ser utilizados Slo aquellos discos con fecha de expiracin del fabricante dentro del plazo pueden ser usados. 1.3.2 Preparacin del inculo: Esta es la variable que influye ms poderosamente en el tamao de la zona de inhibicin. Los inculos muy concentrados darn zonas de inhibicin ms pequeas, y por el contrario, los muy diludos darn zonas de dimetros mayores, en ambos casos se falsean los resultados. El inculo debe estandarizarse ajustando su turbidez a la de un estndar 0,5 Mac Farland. Existen 2 mtodos de preparacin de inculo mtodo directo se toman 3-4 colonias de iguales caractersticas morfolgicas de un cultivo de no ms de 24 horas, y que sea de un medio no selectivo, y ajustar el inculo a una turbidez equivalente al 0.5 de la escala de MacFarland 0.5 en suero fisiolgico. Agitar en un vortex durante 15-20 segundos. La suspensin directa se realizar para todas las bacterias, a menos que exista muy pocas colonias en ese caso se realizar mtodo de crecimiento slo si es una enterobacteria, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa mtodo de crecimiento: Se toman 3 a 5 colonias de iguales caractersticas morfolgicas, se suspenden en 4 a 5 ml. de caldo nutritivo (caldo Mueller Hinton). Incube a 35 C por 2 a 6 horas, hasta que alcance o exceda la turbidez estndar 0.5 MacFarland. Ajuste turbidez a 0.5 Mac Farland, con caldo Mueller Hinton. Utilice el lector de turbidez. Slo puede ser utilizado para bacterias no fastidiosas

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1.3.3 Inoculacin en placas agar a utilizar: agar mueller hinton: enterobacterias acinetobacter pseudomonas aeruginosa burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia staphylococcus enterococcus agar mueller hinton suplementado con 5% de sangre de cordero streptococcus pneumoniae otros streptococcus spp Caractersticas generales del agar que debe objetivar debe cubrir uniformemente la placa. su profundidad debe ser de 4 mm. las placas deben ser perfectamente planas. Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo, Se sumerge una trula estril en tubo con el inculo de la cepa a estudiar, haciendo rotar la trula 2 o 3 veces y presionando firmemente la pared interior del tubo, para remover el exceso de inculo. Se inocula toda la superficie de la placa de agar que corresponda, sin dejar ninguna zona libre. Esto se consigue pasando la trula en tres direcciones (rotando la placa en 60 cada vez), pasando la trula de izquierda a derecha en lneas una tras otra hasta completar toda la placa, en cada direccin se realiza lo mismo. Dejar secar la superficie entre 3 a 5 minutos, pero nunca ms de 15 minutos, la tapa de la placa puede quedar entreabiertas. Esto se realiza para permitir que el exceso de humedad de la superficie se absorba antes de aplicar el disco con el antibitico. 1.3.4 Aplicacin de sensidiscos Se aplican los discos con los antimicrobianos a determinar. Esto puede ser con dispensadores automticos o utilizando pinzas. Los sensidiscos no pueden estar ms prximos entre s que una distancia de 24 mm. , medida de centro a centro de los discos. No ms de 9 sensidiscos en placa de 10cm Un disco no debe ser relocalizado una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar. 1.3.5 Incubacin de placas Las placas son invertidas y puestas en estufa a 35C en el lapso de 15 minutos despus de aplicados los discos. se debe incubar en estufa corriente por 16-18 horas. Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa. Enterococus y Staphylococcus (excepto para lectura de vancomicina y oxacilina) se debe incubar en estufa corriente por 24 horas para Deteccin de resistencia a cefoxitina (cloxacilina) en Staphylococcus spp. Sin embargo, puede informarse si resulta resistente a las 18 horas de incubacin. Deteccin de resistencia a vancomicina en Enterococcus y Stapylococccus Nota: se debe leer los otros antimicrobianos testados a las 16-18 horas de incubacin y se debe dejar incubando por 24 horas para la lectura de cefoxitin ( oxacilina) y vancomicina.

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Se debe incubar en estufa corriente por 20-24 horas: Acinetobacter Burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia Se debe incubar en estufa CO2 por 20-24 horas: streptococcus pneumoniae otros streptococcus. 1.3.6 Lectura de las placas e interpretacin de los resultados Lectura Despus de 16 a 18 horas se debe realizar lectura de los siguientes halos: Todos los antimicrobianos testados en Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa. Todos los antimicrobianos, excepto vancomicina y oxacilina testados en Enterococcus y Staphylococcus spp Entre 20-24 horas de incubacin se debe realiza lectura de los siguientes halos Todos los antimicrobianos testados en Streptococcus pneumoniae y otros streptococcus spp. Burkholderia cepacia Acinetobacter Stenotrophomonas maltophilia A las 24 horas de incubacin se debe realiza lectura de los siguientes halos vancomicina en enterococcus y staphylococcus oxacilina y cefoxitina en staphylococcus. Las zonas de inhibicin resultante debe ser uniformemente circular, en una capa homognea de crecimiento, si aparecen colonias individuales, el inculo puede haber estado muy diludo y debe repetirlo. Los dimetros son medidos en mm pasando por el centro del sensidisco. Lectura con uso de luz reflejada con fondo oscuro (que llega de arriba) La placa de petri se mantiene a una distancia de pocos centmetros sobre un fondo negro no reflactante y se ilumina con luz reflejada. Si es agar Mueller Hinton sangre las zonas son medidas en la superficie superior del agar iluminado con la luz reflejada sacando la tapa. Stx puede producir un doble halo, se miden los mrgenes ms obvios. En Proteus spp ignore invasin Un crecimiento pobre de pequeas colonias, las que se detectan con lente de aumento al borde de la zona de crecimiento inhibido, son ignoradas Cuando se usa medio con sangre debe medir zona de inhibicin no de hemlisis. Ignore colonias pequeas intrahalo (excepto vancomicina y oxacilina (pero estos se leen con luz transmitida). Cefoxitina se debe leer con esta tcnica Lectura con uso de luz transmitida ( luz que llega de abajo) Se utiliza para medir los halos de vancomicina y oxacilina en staphylococcus y enterococcus La placa de petri se ilumina con luz transmitida (placa se mantiene hacia la luz). El halo se mide midiendo el margen de la zona que no muestra evidencia ocular de cultivo visible Ignore las colonias diminutas con lupa en el margen Subcultive las colonias existentes dentro de las zonas de inhibicin neta. Consideraciones En general, se testearn y/o informarn, los antimicrobianos de segunda lnea en: Todas las cepas aisladas en unidad de paciente critico adulto o pediatra. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 62 de 105

Todas las cepas aisladas de lquidos estriles (sangre y LCR) Cepas resistentes a todos los antimicrobianos testeados o sensible slo a 1 antimicrobiano clnicamente til. Cualquier duda consulte al microbiologo o infectlogo.

1.3.7 Interpretacin Los tamaos de las zonas de inhibicin son interpretados segn tablas de CLSI (actualizadas anualmente) para ser informados como: sensible, Intermedio o Resistente Se deben seguir las indicaciones de CLSI respecto a consideraciones que dependen de combinacin microorganismo y antibitico. A continuacin se sealan las principales: En enterococcus spp si es beta lactamasa (+) informe como resistente a ampicilina Deteccin de resistencia inducida a clindamicina en Streptococcus pyogenes. y staphylococcus : resistencia a eritromicina solamente y clindamicina sensible : (halo pequeo de resistencia en eritromicina y halo de inhibicin de sensibilidad en clindamicina) resistencia a eritromicina y clindamicina ( halos pequeos de resistencia en los dos) resistencia a eritromicina y clindamicina (inducible) ( halos pequeo de resistencia en eritromicina y asimtrico en clindamicina con aplanamiento al lado de la eritromicina ). Lo que indica que la eritromicina indujo la expresin de resistencia en clindamicina. Se informa como resistente a ambos Deteccin de produccin de BLEE: ver instrucciones en tabla CLSI vigente (del ao) Enterobacter spp, citrobacter spp y serratia spp pueden desarrollar resistencia durante la terapia prolongada con cefalosporinas de 3 generacin. Por lo tanto, estos aislados pueden ser inicialmente susceptibles y luego resistentes despus de 4 das de tratamiento. Staphylococcus spp puede desarrollar resistencia durante el tratamiento prolongado con quinolonas. Por lo tanto, puede ser inicialmente sensible y luego resistente. La vancomicina en Staphylococcus y Enterococcus debe incubarse 24 horas y la presencia de halo o cualquier crecimiento en la zona de inhibicin indica resistencia. Debe realizarse mtodo que determine CIM Para enterococcus de sangre y LCR se debe realizar prueba de beta- lactamasa. Beta lactamasa (+) se informa resistente a ampicilina y/o penicilina, aunque por disco resultan sensibles.

1.3.8 control de calidad interno: Ver Manual de control calidad microbiologa 1.3.9 Informe Si la cepa es productora de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) se debe informar resistente a todas las cefalosporinas incluyendo cefepime y aztreonam. Adems se debe escribir en el informe cepa productora de BLEE (no con abreviatura si no nombre completo) Se debe informar los antimicrobianos determinados para la bacteria, el servicio y la muestra en estudio, segn lo establecido en el laboratorio de microbiologa del Hospital Padre Hurtado. Se debe revisar esquema de antibiograma con infectlogos adulto y peditrico, comit de IIH y Farmacia peridicamente . Cada antibitico ser informado como: sensible, resistente e intermedio, segn tablas de CLSI actualizadas anualmente.

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Resistencia a eritromicina y clindamicina (inducible) (halos pequeo de resistencia en eritromicina y asimtrico en clindamicina con aplanamiento al lado de la eritromicina ). Lo que indica que la eritromicina indujo la expresin de resistencia en clindamicina. Se informa como resistente a ambos Cefoxitina se debe informar como cloxacilina en satphylococcus spp Oxacilina se debe informar como penicilina en streptococcus pneumoniae En orina positivas de pacientes hospitalizados se debe informar: cefalotina predice la susceptibilidad a todas las cefalosporinas de 1 generacin excepto cefazolina.

1.3.10 Registros Se debe registrar el halo en mm de todos los antimicrobianos testados en pacientes hospitalizados. Siempre escribir los datos en el cuaderno correspondiente, agregando la medida de los halos y el resultado de laboratorio y otros mecanismos de resistencia detectados, por ejemplo produccin de BLEE y beta lactamasa

2. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIN-DILUCIN EN AGAR (E-TEST) 2.1. Fundamento: Consiste en una tira de plstico que contiene una gradiente de concentraciones predefinidas de un antimicrobiano con 15 diluciones dobles seriadas. El protocolo para preparar el inculo es el mismo que para la difusin en disco. Siguiendo el mtodo de difusin, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de Etest sobre su superficie, producindose de forma inmediata una difusin del antibitico desde el soporte hasta el agar, crendose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacin de las placas, se puede observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica. Despus de la incubacin la CMI ser el valor obtenido en el punto en el que el extremo de inhibicin intersecciona con la tira. 2.2 campo de aplicacin: En nuestro laboratorio se utiliza para la determinacin de susceptibilidad en determinados microorganismos en relacin con determinados antimicrobianos que no estn estandarizados por la tcnica de kirby bauer o es la recomendacin vigente. De acuerdo a nuestra realidad local, se realizar e-test (segn corresponda) a las siguientes bacterias aisladas de muestras clnicas que sean clnicamente significativas: Streptococcus pneumoniae para determinar susceptibilidad a penicilina, cuando el halo de inhibicin por tcnica kirby bauer es menor o igual 19 mm. Siempre cuando se trata de infecciones sistmicas Streptococcus pneumoniae para determinar susceptibilidad a cefalosporinas de 3 generacin. En enterococcus y satphylococcus para confirmar resistencia a vancomicina. En streptococcus viridans, incluyendo grupo anginosus con significancia clnica en penicilina Otras bacterias multiresistentes: imipenem/ colistin 2.3 Materiales e insumos: agar Mueller Hinton /agar Mueller Hinton sangre tiras impregnadas con antimicrobiano (comerciales) trulas estriles 2.4 Instrumentacin o equipos y accesorios medidor de turbidez 0.5 Mac Farland calibrador Mac Farland 0.5 Vortex estufa de incubacin corriente y CO2 2.5 Procedimiento 2.5.1 Mantencin de tiras de e.test: Todos los deben almacenarse en desecadores a temperaturas de menos 20c (freezer). Deben retirarse del congelador slo al ser utilizadas Retire del congelador 1 a 2 horas antes de utilizarlos Slo aquellas tiras con fecha de expiracin del fabricante dentro del plazo pueden ser usados. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 64 de 105

2.5.2 Preparacin del inculo: se aplica lo descrito en 1.3.2 2.5.3 Inoculacin en placas: se aplica lo descrito en 1.3.3 2.5.4 Aplicacin de tiras Se aplican las tiras con los antimicrobianos a determinar. Maximo 2 tiras por placa de 10 mm Una tira no debe ser relocalizada una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar. 2.5.5 Incubacin de placas: se aplica lo descrito en 1.3.5 2.5.6 Lectura de las placas e interpretacin de los resultados Lectura A las 24 horas de incubacin se debe realiza lectura de los siguientes halos vancomicina en enterococcus y staphylococcus los antimicrobianos testados en streptococcus pneumoniae y otros streptococcus spp. Los dimetros son medidos en mg/ ml. Lectura con uso de luz reflejada con fondo oscuro (ojo desnudo) La placa de petri se mantiene a una distancia de pocos centmetros sobre un fondo negro no reflactante y se ilumina con luz reflejada. Si es agar miller hinton sangre las zonas son medidas en la superficie superior del agar iluminado con la luz reflejada sacando la tapa. Cuando se usa medio con sangre debe medir zona de inhibicin no de hemlisis. Lectura con uso de luz transmitida (ojo desnudo) Se utiliza para medir los halos de vancomicina y oxacilina en staphylococcus y enterococcus La placa de petri se ilumina con luz transmitida ( placa se mantiene hacia la luz 2.5.7 Interpretacin Los tamaos de las zonas de inhibicin son interpretados segn tablas de CLSI (actualizadas anualmente)para ser informados como sensible, intermedio o resistente. 2.6 Control de calidad interno: Ver manual de control calidad de microbiologa 2.7 Informe Se debe informar los antimicrobianos segn lo establecido en el laboratorio de microbiologa del HPH Cada antibitico ser informado con su CIM en ug/ml y adems calificada como: sensible, resistente e intermedio, segn tablas de CLSI actualizadas anualmente. 2.8 Registros Se debe registrar el valor de CIM de todos los antimicrobianos testados en pacientes hospitalizados, en orden de examen y sistema informtico.

REFERENCIAS 1. Instituto de Salud Pblica. Instructivo sensibilidad por difusin en placas agar, 2009 en sitio web: www.ispch.cl 2. Garca JA., Cantn R., Garca JE., Gomez-Lus M., martinez L., Rodriguez C., Vila J. Mtodos bsicos para el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. 2000. Procedimientos de Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica. En: www. seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia

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ANEXOS Anexo 1: posicin de tiras de e-test en placas de medio cultivo

Copiado de inserto de Etest AB Biodisk

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N 16. PROCEDIMIENTO CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIAS

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras clnicas de acuerdo a mtodos estandarizados para recuperar agentes patgenos en el diagnstico microbiolgico de infecciones producidas por anaerobios o mixtas. ALCANCE Tecnlogos Mdicos y Tcnicos Paramdicos de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del cultivo, identificacin de las cepas en desarrollo y de la validacin del informe. Tcnico Paramdico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES Jarra de anaerobiosis: jarra plstica con tapa hermtica usada para generar e incubar muestras en atmsfera de anaerobiosis Atmsfera de anaerobiosis: se logra introduciendo dentro de una jarra plstica, que contiene en su interior las placas sembradas con la muestra en estudio, un sobre con un sistema generador de gas y cerrando inmediatamente con tapa hermtica. Rpidamente se absorbe el O2 atmosfrico de la jarra con la generacin simultnea de CO2. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Placas de agar sangre con suplemento para anaerobios Placas de agar sangre con suplemento ms inhibidor Placas de agar sangre Placas de agar chocolate con suplemento Caldo tioglicolato Hemocultivos para anaerobios generador de gas para anaerobiosis asa estril mortero estril jarra de anaerobiosis indicador de anaerobiosis reactivos para tincion de Gram y Kinyoun kit con batera de pruebas para identificacin de anaerobios Equipos: Estufa de incubacin Software: Omega

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DESARROLLO DEL PROCESO Consideraciones de la muestra: De no contar con medio de transporte para anaerobios, se debe avisar al laboratorio unos 15 minutos antes de extraer la muestra para tener tiempo de preparar el material para su estudio y enviar inmediatamente luego de su obtencin, para minimizar al mximo su exposicin al oxgeno. Puede enviarse en la misma jeringa, sin aguja y con tapn de plstico. (Ver procedimiento de obtencin de las muestras y muestras apropiadas y no apropiadas para estudio de bacterias anaerobias en Manual de toma de muestras). 1. Responsable de recepcin y siembra: Tcnico Paramdico. 1.1 Los lquidos estriles deben venir inoculados en frasco de hemocultivo para anaerobios. Ingresar a equipo de hemocultivos (mismo procedimiento que resto de hemocultivos). 1.2 Las muestras de pus, abscesos o colecciones sembrar en: placa agar sangre con suplemento para anaerobios placa agar sangre con suplemento ms inhibidor y caldo thioglicolato Introducir estos cultivos en la jarra de anaerobiosis, agregar indicador de anaerobiosis y el sobre generador de gas inmediatamente luego de sacarlo de su envoltorio. Cerrar rpidamente con la tapa hermtica. (se deben reunir todos los materiales necesarios previamente). Incubar en estufa normal a 35C En paralelo sembrar: placa de agar sangre placa agar chocolate Incubar estas placas en estufa de CO2 a 35C. 1.3 Los trozos de tejido se deben moler en un mortero estril con 2 o 3 ml de caldo thioglicolato y luego proceder como se indica anteriormente. 2. Simultneamente se realiza frotis de la muestra para tincin de gram y kinyou. 3. Diagnstico microbiolgico 3.1 Observar tincin de gram directa de la muestra 3.2 Abrir jarra de anaerobiosis despus de 48 hrs. de incubacin, observar desarrollo de colonias en ambas placas bajo lupa estereoscpica. 3.3. Paralelamente observar placas incubadas en atmsfera de 5% CO2, para descartar bacterias facultativas. Para ello traspasar cada tipo de colonia a una placa de agar sangre normal y otra con suplemento para anaerobios (dividir la placa en cuadrantes) y numerar cada colonia con numero idntico en ambas placas. 3.4 Incubar ambas placas en atmsfera segn corresponda en CO2 o anaerobiosis por 48 hrs. Luego de la incubacin proceder a descartar bacterias facultativas y estudiar las cepas anaerobias. 3.5 Realizar tincin de gram a cada colonia y segn observacin macroscpica, caractersticas de la colonia; microscpica, (morfologa microbiana), y pruebas bioqumicas, proceder a su identificacin de acuerdo a esquemas de diferenciacin. Informe Si no hay crecimiento en los cultivos en anaerobiosis y aerobios despus de 5 das de incubacin, informar: no hubo desarrollo de microorganismos. Si hay desarrollo idntico en placa en aerobiosis y anaerobiosis, informar: no hubo desarrollo de bacterias anaerobias. hubo desarrollo de bacterias facultativas (segn corresponda). Si hay desarrollo de anaerobios, informar: hubo desarrollo de (nombre de la o las bacterias correspondientes).

Registros: Sistema informtico del laboratorio y al reverso de la orden de examen que se guarda segn fecha de ingreso de la muestra en archivos, por un periodo de 3 aos. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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N 17. PROCEDIMIENTOS TCNICOS DE DIAGNSTICO DE PARASITOLOGA CLNICA

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras clnicas para el diagnstico de enfermedades parasitarias de acuerdo a mtodos estandarizados. Los parsitos que pueden provocar enfermedad en el ser humano, incluyen protozoos, helmintos y algunos artrpodos. Son causa de enfermedades sistmicas y localizadas. Presentan diversas formas evolutivas como son huevos, larvas, quistes, trofozotos, etc., y dependiendo del agente y cuadro clnico de sospecha, se emplearn determinados mtodos de laboratorio para su diagnstico. En este Procedimiento se incluyen las Tcnicas de ejecucin de los siguientes exmenes: Parasitolgico seriado de deposiciones Test de Graham Gota gruesa Acarotest Tincin de Cryptosporidium (Ziehl Neelsen modificado)

ALCANCE Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del laboratorio de parasitologa, quien efecta la lectura del examen y la validacin del informe. Auxiliar paramdico: Responsable de la recepcin, ingreso, preparacin de la muestra para su lectura (si corresponde), preparacin del material para la toma de muestras para exmenes parasitolgicos y de realizar frotis (si corresponde) DOCUMENTOS RELACIONADOS Orden de examen Manual de Toma de Muestras Reglamento de Traslado de Muestras de Laboratorio Manual de Procedimientos de Control de Calidad de Microbiologa DESARROLLO DEL PROCESO 1. PARASITOLGICO SERIADO DE DEPOSICIONES (MTODO DE BURROWS) 1.1.- OBJETIVO ESPECFICO: Diagnosticar enteroparasitosis. 1.2.- FUNDAMENTO El mtodo de Burrows otorga un buen rendimiento para el diagnostico de quistes y trofozotos por ser un mtodo de concentracin por sedimentacin en dos fases, una para determinar quistes y otra para trofozotos. El mtodo en si consiste en macerar la deposicin con el fijador (PAF) para as formar una solucin homognea la que despus es centrifugada varias veces, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo con suero fisiolgico hasta lograr un sobrenadante limpio, el que finalmente tambin se elimina. El sedimento restante se analiza microscpicamente, colocando una gota de este con una gota de colorante entre lmina y laminilla; en este deberan aparecer formas evolutivas de algn parsito si lo hubiere.

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Los colorantes utilizados de preferencia son MIF y Tionina los cuales dan un buen contraste a las muestras y permiten ver mejor los quistes con sus estructuras internas, en caso necesario tambin se puede utilizar Lugol como colorante.

1.3.- MATERIALES E INSUMOS Paletas de madera de 1-1,5 cm. de ancho por 5- 10 cm. de largo. Vasos corrientes plsticos o de vidrio, de 150ml o ms capacidad. Mallas de acero inoxidable, cortadas en cuadrados de 10 x 10 cm., aproximadamente. Portaobjetos corrientes. Cubreobjetos de 20 x 20mm o de 22 x 22 mm. Pipetas de 10 ml, 5 ml y 1 ml. Pipetas Pasteur. Tubos para centrifuga de fondo cnico, de 15 ml de capacidad. Gradilla para tubos de centrifuga. Bandeja de plstico o vidrio, 20 x 30 x 4 cm., con tapa de vidrio (cmara hmeda). Papel filtro (para cmara hmeda) Aceite de inmersin Eter Sulfrico o etilco. Solucin de PAF (Phenol, Alcohol (etanol al 95%), Formaldehyde 40%). Solucin de MIF (Merthiolate, lugol, formaldehdo) Solucin de Tionina 10mg/dl. Solucin de Lugol Cloruro de Sodio. Agua destilada.

1.4.- INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Centrifuga clnica, con tacmetro. Microscopio binocular con lentes objetivos de 10x, 40x, 100x y oculares de 10x.

1.5.- DESARROLLO DEL PROCESO Tcnico Paramdico debe corroborar que la muestra venga identificada con los datos del paciente y con su orden respectiva. Tcnico Paramdico realiza la preparacin de la muestra. Se recomienda el uso de guantes de goma o desechables, los que deben ser lavados, sin retirarlos con agua y jabn entre cada muestra diferente. Numerar 2 portaobjetos, 2 vasos y 2 tubos de centrifuga con el mismo nmero asignado a cada muestra (nmero de ingreso a sistema omega). Marcar un portaobjeto con la letra T (trofozotico) y otro con la letra Q o E (qustico o ter). Abrir el frasco y resuspender la emulsin fecal con una paleta de madera. Vaciar el contenido de cada frasco en un vaso y agregar fijador si la emulsin es muy espesa. Tamizar la emulsin a travs de la malla de acero hacia un vaso limpio. Una vez terminado el proceso de la muestra la malla debe ser lavada con agua y detergente y posteriormente flameada al mechero. Observar el material retenido en el tamiz para buscar parsitos macroscpicos. Colocar aproximadamente 10ml del tamizado en un tubo centrifuga. Para cada muestra se tendra dos tubos. Balancear los tubos de manera que queden de igual peso en capachos opuestos de la centrifuga. Centrifugar entre 1500 a 1800 r.p.m. durante 3 minutos. Eliminar sobrenadante invirtiendo el tubo. Resuspender el sedimento en solucin salina isotnica (NaCl 0.85%) hasta completar aproximadamente 10 ml. Centrifugar nuevamente entre 1500 a 1800 r.p.m durante 3 minutos. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 70 de 105

Eliminar sobrenadante invirtiendo el tubo. Volver a resuspender con NaCl y centrifugar hasta obtener un sobrenadante relativamente limpio (suelen ser necesarias 2 a 4 centrifugaciones). Colocar 1 gota de tincin de Tionina o de MIF en el portaobjeto marcado con la letra T, separadas 3 cm. entre si. Colocar 2 gotas del sedimento, de uno de los tubos, una junto a cada gota de tincin. Con un ngulo de un cubreobjetos mezclar sedimento y tincin; cubrir. Guardar en cmara hmeda. Esta es la Fase Trofozotica de la tcnica. En el otro tubo de centrifuga ya resuspendido con solucin salina agregar una columna de aproximadamente 1cm de altura de ter sulfrico. Ocluir el tubo con el dedo pulgar (enguantado) o con parafilm y agitar enrgicamente. Destapar lentamente para reducir la presin generada. Centrifugar por 4 minutos entre 1500 y 1800 r.p.m. Vaciar el sobrenadante en forma brusca, invirtiendo el tubo. Colocar 1 gota de tincin de Tionina o de MIF en el portaobjeto marcado con la letra Q, separadas 3 cm. entre si. Colocar 2 gotas del sedimento, una junto a cada gota de tincin. Con un cubreobjeto mezclar sedimento y tincin. Colocar el mismo cubreobjeto sobre la mezcla. Esta es la Fase Qustica de la tcnica. Colocar en cmara hmeda hasta el momento de la lectura que puede ser hasta 24 horas despus de preparadas si se conserva la cmara en refrigerador a 4C. Tecnlogo Mdico realiza la lectura. Leer ambas preparaciones de la fase qustica con aumento de 100x (oculares 10x y objetivos 10x), 400x (oculares 10x y objetivos 40x) y si fuera necesario 1000x (oculares 10x y objetivos 100x), por ejemplo para el diagnstico de Entamoeba histolytica. Leer ambas preparaciones de fase trofozotica con aumento de 400x (oculares de 10x y objetivos 40x) y si fuera necesario con aumento de 1000x (oculares de 10x y objetivo 100x), para el diagnstico de Entamoeba histolytica. La lectura debe ser ordenada y sistemtica, abarcando toda la preparacin. (ver anexo n 1) Despus de informar el examen, se puede eliminar el resto de muestra que quedo en los frascos.

1.6.- CONTROL DE CALIDAD INTERNO Ver procedimiento de Control de calidad de Microbiologa 1.7.- INFORME Se registra los resultados en el Sistema Informtico Omega. Si el resultado es negativo debe informarse: No se observan elementos parasitarios. Si el resultado es positivo debe informarse segn el siguiente ejemplo: -Trofozotos de Entamoeba histolytica. -Quistes de Giardia lamblia. -Huevos de Hymenolepis nana El tiempo de demora en entregar el resultado del examen es como mximo dentro de 3 das hbiles.

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2. TEST DE GRAHAM 2.1.- OBJETIVO: Este examen confirma la sospecha de enterobiosis, la infeccin intestinal producida por el helminto Enterobius vermicularis, mediante el hallazgo de las larvas o sus huevos. 2.2. FUNDAMENTO: Se basa en el hecho de que en la Enterobiasis, la hembra grvida emigra del intestino ciego a la zona perianal, generalmente durante las ltimas horas de la tarde o por la noche, y deposita los huevos en los pliegues de la piel perianal, los cuales quedan adheridos a la piel por una sustancia gomosa. Estos son rescatados en la maana al adherir la cinta scotch alrededor del orificio anal y as se pueden visualizar al examinar las lminas por microscopa. 2.3- MATERIALES E INSUMOS Cinta scotch de 1 2 cm. de ancho Lminas portaobjetos desengrasados Bolsas contenedoras Mascarillas El set por paciente consta de 5 lminas con cinta adhesiva (scotch) y una hoja de instrucciones para la toma de muestra los cuales sern entregados en una bolsa.

2.4.- INSTRUMENTACIN O EQUIPOS Y ACCESORIOS Microscopio ptico Normas de bioseguridad: la lectura de las lminas debe efectuarse con mascarilla por el riesgo de inhalacin de huevos.

2.5.- DESARROLLO DEL PROCESO Al recepcionar muestras se debe corroborar identificacin correcta del paciente, nmero de lminas, y que cumpla con los requisitos de muestra adecuada. (Ver Manual de toma de muestras) Las lminas se leen directamente, la lectura la realiza Tecnlogo Mdico encargado de Parasitologa. Emplear aumento de 10x y para diferenciar un huevo de una burbuja, utilizar 40x. Leer sistmica y ordenadamente la superficie de la cinta, cuidando que los lmites de los recorridos se superpongan entre s, para no dejar reas sin examinar. Si se encuentra otro elemento parasitario, continuar la lectura en bsqueda del huevo de E. vermicularis. Detener la lectura al encontrar huevos de este parsito. (Ver anexo n 2)

2.6.- CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Ver Procedimiento de Control de calidad de Microbiologa (Parasitologa) 2.7.- INFORME Se ingresa los resultados en el sistema informtico de acuerdo el nmero de peticin para cada examen y paciente. En caso de ser menor a 5 lminas se debe consignar el n de lminas ledas. Si es negativo debe informarse: Test de Graham No se observan huevos de Enterobius vermicularis. Si es positivo se debe informar: Test de Graham Huevos de Enterobius vermicularis Si se encuentran otros elementos parasitarios, se identifican e ingresan como resultado en la misma peticin.

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3.

EXAMEN DE GOTA GRUESA

3.1 OBJETIVOS: Realizar el diagnstico de hemoparasitosis, por la visualizacin directa de los parsitos o sus estadios de desarrollo. Esta tcnica se aplica ante la sospecha de Enfermedad de Chagas, malaria, filariasis y trypanosomiasis africana, fundamentalmente en la etapa aguda de estas parasitosis, momento en el cual existe una alta parasitemia. 3.2 FUNDAMENTO El mtodo habitual para diagnosticar los parsitos en sangre, es el estudio de las pelculas de sta. Se preparan dos tipos de pelculas: fina y gruesa. La primera corresponde al frotis que se utiliza en hematologa para la lectura del hemograma, teido con May Gruenwald-Giemsa. El examen de gota gruesa tiene las ventajas de que, permite concentrar la sangre del paciente, con lo que aumentan las probabilidades de detectar infecciones mnimas; tambin permite disminuir el tiempo necesario para efectuar un exmen fiable, en 5 minutos se puede examinar aproximadamente la misma cantidad de sangre con lentes de inmersin en aceite, que en una pelcula delgada en 30 minutos. Esta tcnica consiste en concentrar la sangre en una pequea porcin del portaobjeto. Luego desfibrinarla con aguja hipodrmica y deshemoglobinizar con Giemsa. Durante la tincin los eritrocitos se lisan, por consiguiente slo sern visibles los leucocitos y los parsitos, si stos ltimos estn presentes. 3.3 MATERIALES E INSUMOS Lancetas , agujas hipodrmicas o alfiler Algodn o gasa Alcohol de 70% Portaobjetos desengrasados Pipetas pasteur Agua destilada 3. INSTRUMENTACIN O EQUIPOS Y ACCESORIOS Microscopio binocular con lentes objetivos de 10,40 y 100x. 3.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE La muestra debe venir con los datos del paciente (nombre y dos apellidos, servicio y diagnostico) y con su orden respectiva. Durante la toma de muestra, lectura y descarte de material, se deben observar rigurosamente todas las medidas de bioseguridad que corresponden al trabajo con fluidos corporales, en especial sangre. El sitio de puncin ideal es la yema del dedo anular o medio. La zona debe estar tibia, lo que se logra al colocar el dedo en agua tibia si fuese necesario. Otros sitios de puncin son el lbulo de la oreja y en recin nacidos, el taln del pie. La muestra ideal debe tomarse con lanceta; en caso de realizar puncin venosa, tomar la muestra directamente de la aguja. El sitio de puncin se debe limpiar y desinfectar con gasa o algodn al 70%. Luego secar la zona con gasa estril; es preferible al algodn, el que puede dejar fibras que dificulten la lectura. Pinchar la zona elegida con lanceta estril. La primera gota de sangre se debe limpiar con gasa. La segunda gota se coloca en el portaobjeto. Se requiere preparar como mnimo 6 lminas. Estas se dejan en cmara hmeda para que las gotas no se sequen. Luego se procede a desfibrinar al lado del paciente. Transportar al laboratorio en cmara de bioseguridad. 3.6 DESARROLLO DEL PROCESO Colocar dos o tres gotas de la sangre en el portaobjetos, directamente del dedo del paciente. (Se recomienda no comprimir el dedo). Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 73 de 105

Desfibrinar la muestra mediante movimientos circulares de la gota con aguja hipodrmica o alfiler durante 3 minutos. Dejar secar al ambiente por 4-8 horas o en una estufa a 37C por 90 minutos. No colocar al calor directo, porque interfiere con los pasos siguientes. Deshemoglobinizar, colocando por 5 minutos Giemsa diluido (1 gota de Giemsa por 2 ml de agua destilada). El frotis debe adquirir un color rojizo por la hemoglobina disuelta. Repetir 2 o 3 veces este proceso; cambiar el Giemsa cada vez. El frotis debe adquirir un color azulino transparente a los 15 o ms minutos, debido a la dbil tincin de glbulos blancos, plaquetas y parsitos y a la desaparicin de glbulos rojos. Cubrir la lmina con Giemsa concentrado (1 gota de Giemsa por 1 ml de agua destilada). Dejar la tincin por 45 a 50 minutos. Lavar la lmina colocndola dentro de una cubeta con agua destilada por 3 a 5 minutos. No lavar al chorro de agua, porque se puede desprender la preparacin. Secar al ambiente en posicin vertical. Este exmen tiene mejor rendimiento si se realiza en forma seriada. La lectura se realiza recorriendo el preparado completamente con aumentos de 40 y 100x, cuidando de no dejar zonas sin observar. (Ver anexo 3)

3.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO Las preparaciones del paciente deben procesarse junto con un control biolgico positivo. Esto permitir demostrar que la tincin se ha realizado exitosamente. 3.8 INFORME Se ingresa los resultados en el sistema informtico. Si el resultado es negativo debe informarse: "No se observan elementos parasitarios" Si el resultado es positivo debe informarse: "Se observan formas circulantes de Trypanosoma cruzi" (en el caso de E. de Chagas) 3.9 RESPONSABLE DIRECTO Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del Laboratorio de Parasitologa, quien realiza la tcnica y efecta la lectura del exmen.

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4. ACAROTEST 4.1 OBJETIVO: Pesquisar los diferentes estadios evolutivos del parsito (Sarcoptes scabiei) y as confirmar la sospecha clnica de escabiosis y como control de tratamiento. 4.2 FUNDAMENTO: Consiste en raspar lesiones sospechosas con un portaobjeto adhiriendo la cinta scotch en la piel para obtener el material que ser visualizado al microscopio en la bsqueda de huevos y ejemplares de Sarcoptes scabiei. Se deben tomar 10 muestras. 4.3 MATERIALES E INSUMOS Diez portaobjetos por paciente Cinta adhesiva transparente de 1 a 2 cm de ancho Guantes y pechera plstica Povidona yodada Algodn 4.4 INSTRUMENTACIN O EQUIPOS Y ACCESORIOS Microscopio ptico 4.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE Se deben ubicar lesiones directas representadas por el surco acarino (que corresponde a los tneles o galeras causadas por las hembras grvidas); se aprecian como trazos lineales de algunos milmetros hasta 1.5 cm de longitud, son delgados, algo levantados, de color amarillento sucio y en su extremo suele encontrarse una pequea vescula serosa transparente, es la vescula perlada de Bazin donde se encuentra acantonada la hembra. El paciente no deber haberse aplicado ningn acaricida (Ej.: gamexano o lindano) por lo menos una semana antes del exmen. Tampoco debe aplicarse talco, pues dificultara la lectura. Las lminas deben ser transportadas al laboratorio en una bolsa cerrada, identificndola con el nombre y los apellidos del paciente. 4.6 DESARROLLO DEL PROCESO Utilizar guantes y pechera plstica para la realizacin de este exmen. Las lminas se leen al microscopio con aumento de 10x y cuando sea necesario con aumento de 40x. Leer sistemticamente toda la superficie de la cinta adhesiva, cuidando que los lmites de los recorridos no se superpongan para no dejar reas sin examinar. Detener la lectura al encontrar ejemplares de Sarcoptes scabiei o de sus huevos. El caro mide 150 micrones el macho y 300-350 micrones la hembra. Su forma es oval, con 4 pares de patas, 2 anteriores y 2 posteriores. El cuerpo posee numerosas cerdas y espinas quitinosas dirigidas hacia atrs. Los huevos son ovales y miden 150-180 micrones. (Ver anexo 4) 4.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Se evaluar semestralmente la observacin microscpica., ya sea, observando un control positivo y uno negativo, antes de ver las muestras problema. 4.8 INFORME Debe incluir el nombre completo del paciente, Rut, procedencia, en el sistema informtico. Se debe consignar el nmero de lminas ledas Si es negativo se debe informar: No se observan ejemplares ni huevos de Sarcoptes Scabiei Si es positivo se debe informar: Se observan ejemplares o huevos de Sarcoptes Scabiei, segn corresponda. 4.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del Laboratorio de Parasitologa, quien efecta la lectura del Acarotest.

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5. TINCIN PARA CRYPTOSPORIDIUM (ZIEHL NEELSEN MODIFICADO) 5.1 OBJETIVOS: Detectar ooquistes de Cryptosporidium parvum. Examen indicado para determinar la etiologa de una diarrea acuosa sin sangre en pacientes inmunocomprometidos. 5.2 CAMPO DE APLICACIN: Se solicita principalmente en pacientes inmunocomprometidos como personas infectadas con VIH, pacientes en quimioterapia, transplantados en tratamiento con inmunosupresores. Tambin se hace en todo nio menor de 2 aos en forma simultnea con el parasitolgico seriado, ya que pueden exponerse al parsito por tener contactos con animales y sus excretas o ingerir alimentos contaminados con ooquistes. 5.3 FUNDAMENTO: La Tincin de Ziehl-Neelsen se basa en la capacidad que tienen algunos parsitos y bacterias de resistir a la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos (fucsina). Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de lpidos en su envoltura celular, que confiere un ambiente hidrfobo. El colorante fucsina bsica se compone de fenol, lo que facilita la penetracin de la fucsina en la envoltura celular; este proceso de tincin requiere de calentamiento, ya que el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared celular que contiene ceras. En la etapa posterior se decolora con un decolorante orgnico que es una mezcla de cido y alcohol (HCl y alcohol etlico 95%), con lo cual se logra extraer el colorante (fucsina) a todas las clulas excepto a las alcohol-cido resistentes. La posterior tincin con el colorante de contraste (Azul de Metileno) tie a las clulas que no resistieron el tratamiento orgnico, por lo tanto, se tien de azul, y de esta manera resaltan los organismos alcohol-cido resistentes los cuales estn teidos de rosa. Dentro de los parsitos coccidios el Crytosporidium parvum, se caracteriza por sus propiedades de alcohol-cido resistencia. 5.4 MATERIALES E INSUMOS Vasos corrientes plsticos o de vidrio, de 150 ml o ms capacidad. Mallas de acero inoxidable. Portaobjetos corrientes. Tubos de centrifuga de fondo cnico. Gradilla para tubos de centrifuga. Aceite de inmersin. Solucin PAF. Azul de Metileno. Acido Clorhdrico. Alcohol etlico 95%. Fucsina bsica. Pinzas de madera. Mechero Bunsen o de alcohol.

5.5 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Microscopio ptico con lente de inmersin 100x Centrifuga clnica. 5.6 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE: La muestra es deposicin. La toma de muestra es la misma que para el parasitolgico seriado de deposiciones. (ver Manual de toma de muestras) Las muestras fijadas pueden ser almacenadas durante varias semanas en un lugar fresco y si es posible en refrigerador a 4C. 5.7 DESARROLLO DEL PROCESO Se debe corroborar que la muestra venga con nombre y apellidos, servicio y con su respectiva orden. Confeccin del frotis: Homogeneizar la muestra de deposicin tomada con fijador PAF, diluyndola con suero fisiolgico si fuera necesario. Tamizar con malla fina de acero inoxidable. Centrifugar 5 minutos a 1500 r.p.m. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 76 de 105

Botar el sobrenadante. Con una gota del sedimento, hacer un extendido en un portaobjetos. Dejar secar a temperatura ambiente.

Tincin: Cubrir la lmina con fucsina completamente Calentar la lmina hasta la emisin de vapores blancos (sin que hierva) Dejar 15 minutos y lavar con agua Decolorar con alcohol cido durante 1 minuto. Lavar con agua. Cubrir la lmina con azul de metileno durante 7 minutos Lavar con agua Secar a temperatura ambiente. Lectura: Se debe recorrer el frotis completamente con objetivo de inmersin 100 x. Los ooquistes de cryptosporidium se tien de color rojo y se puede reconocer pared y contenido. (Ver anexo 6) 5.8 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Es imprescindible aplicar controles biolgicos al preparar nuevos colorantes y al efectuar tinciones de muestras problemas, es decir, se debe tener muestras positivas con Cryptosporidium parvum, con las cuales se realiza un frotis para luego teir con los nuevos colorantes junto a las muestras problemas para as asegurar un resultado fidedigno y evitar falsos positivos y negativos. El resultado de este control se debe registrar en planilla correspondiente. 5.9 INFORME: Se ingresa los resultados al sistema informtico: Si el resultado es positivo se debe informar: Tincin Ziehl Neelsen modificado: Positiva al observar ooquistes de Cryptosporidium parvum Si el resultado es negativo se debe informar: Tincin Ziehl Neelsen modificado: Negativo al No observar ooquistes de Cryptosporidium parvum 5.10 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del laboratorio de parasitologa, quien efecta la lectura del examen. MTODOS DE SUPERVISIN Y RESPONSABLES Los responsables de supervisin son Mdico Jefe Laboratorio de Microbiologa y Tecnlogo Mdico encargado de Parasitologa. REFERENCIAS Atas A., Neghme A. Parasitologa Clnica, 3 edicin. Manual de Control de Calidad en el Laboratorio Clnico, Ministerio de Salud 1998, Instituto de Salud Pblica de Chile. Procedimientos en Parasitologa, Berbeli Astorga, Instituto de Salud Pblica de Chile, 1993. Diagnsticos y tratamientos clnicos por el laboratorio, John Bernard Henry, 9 edicin, Masson Parasitologa al da 9, 80-83, 1985. http://www.seimc.org/control/infdef2001/pdf/para101.pdf http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html http://www.members.tripod.com http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html

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ANEXOS

Anexo 1. Imgenes al microscopio de formas evolutivas de algunos enteroparsitos.

Huevo de Ascaris lumbricoides

Quiste de Endolimax nana

Huevo de Hymenolepis diminuta

Quiste de Entamoeba histolytica

Huevo de Fasciola hepatica

Huevo de Hymenolepis nana

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Anexo 2: Imgenes al microscopio de Huevos de Enterobius vermicularis

Anexo 3. Gota gruesa

Formas circulantes de Tripanosoma cruzi

Forma anillo de Malaria falciparum

Anexo 4: Acarotest

Huevo de Sarcoptes scabiei.

Ejemplar adulto octpodo de Sarcoptes scabiei. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Anexo 5: Ooquistes de Cryptosporidium parvum, tincin de Ziehl-Neelsen. Aumento 100 x

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N 18. PROCEDIMIENTO TCNICO DE DIAGNSTICO DE MICOLOGA CLNICA

OBJETIVO: Realizar procedimientos de diagnstico microbiolgico de micosis superficiales y sistmicas, de acuerdo a mtodos estandarizados y segn las recomendaciones nacionales e internacionales.

QUIENES DEBEN APLICARLA: Tecnlogos Mdicos, Mdico Microbilogo y Tcnicos Paramdicos de seccin Microbiologa de Laboratorio RESPONSABLE DE SUPERVISAR: Tecnlogos Mdicos encargados de exmenes micolgicos (segn rotacin)

RESPONSABILIDADES: Tcnicos Paramdicos: responsables de toma de muestras (en caso de micosis superficiales), recepcin e ingreso de muestras. Tecnlogo Mdico es responsable de la siembra de muestras para dermatofitos, evaluacin de cultivos, ejecucin de pruebas y subcultivos para identificacin, ejecucin y lectura de exmenes microscpicos, informe y validacin de resultados.

DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO Se describe proceso por separado para muestras clnicas de micosis superficiales y micosis sistmicas o profundas.

I. Micosis superficiales En las micosis superficiales estn involucrados principalmente: dermatofitos, Candida spp. y Fusarium (uas). 1. TIPO DE MUESTRAS Piel Cabello y Pelo Uas TOMA DE MUESTRAS Consideraciones generales: Cantidad suficiente Bordes activos de las lesiones Paciente sin tratamiento antifngico previo (en caso contrario suspenderlo a lo menos 1 semana antes si es tpico o 15 das si es oral). Paciente limpio. Bao o limpieza solo con agua y jabn (no desinfectante) Antisepsia de piel con alcohol 70 Piel Raspado del borde activo de la lesin con bistur, esptula o portaobjetos estril Si existen vesculas debe cortarse el techo. Raspado y cinta adhesiva transparente (en Pitiriasis versicolor)

2.

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Intrtrigo Raspar escamas Si esta macerado tomar con trula humedecida en suero estril

Uas Las uas no deben estar pintadas Tomar escamas mas profundas posibles, lmite entre ua sana y enferma. Raspado en la porcin distal del espacio subungueal donde se acumula la hiperqueratosis (reas blancas) En caso de onicomicosis superficial se raspa la cara externa de la ua

Pelos Limpiar cuero cabelludo con alcohol Arrancar 10-20 pelos cortados del borde de la alopecia con pinzas Muestra de cuero cabelludo se raspa con bistur

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Otras muestras Ojos : - conjuntival (trula estril) - cornea (procedimiento mdico) Odos: - con trula estril tomar material purulento o costroso Cavidad oral: - aseo oral - raspar lesiones blanquecinas Flujo vaginal - con espculo Glande, prepucio, regin anal y perianal - tomar con trula estril

Transporte de muestra Envase limpio y seco Las escamas, pelos, costras o raspados se depositan: en placa de petri estril Rechazo de Muestra Muestra escasa. Paciente en tratamiento. Muestra sin orden de examen y/o diagnstico presuntivo. Muestra sin datos mnimos del paciente y de la lesin.

3.

PROCEDIMIENTO

3.1. Examen microscpico directo con KOH 10% El examen microscpico directo del material clnico es uno de los procedimientos ms simples y tiles en el diagnstico de infecciones fngicas. La observacin de elementos fngicos en escamas de piel, pelos uas pueden proporcionar una clara indicacin del tipo de micosis superficiales envueltas: dermatofitosis, candidiasis o pitiriasis versicolor. 1. Colocar el material a estudiar en un porta-objeto y se cubre con una a dos gotas de KOH al 10%. 2. Luego cubrir la preparacin con un cubre-objeto. Nunca se debe presionar el cubre-objeto con los dedos, ya que los cidos grasos naturales de la piel dificultan la observacin. Cuando la muestra es muy espesa es aconsejable presionar el cubre-objeto con una pinza u otro objeto. De esta manera el hongo puede ser liberado del material biolgico, lo que permite su visualizacin. 3. Guardar en cmara hmeda hasta el momento de la lectura. 4. Observar con objetivo 40 X Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 83 de 105

5. Informe de resultados: - Se observan levaduras en +, ++, +++ - Se observan pseudohifas en +,++,+++ - Se observan levaduras y pseudohifas en +, ++, +++ - Se observan hifas y levaduras en +, ++, +++ - Se observan hifas septadas en +, ++, +++ - Se observan artroconidios en +, ++, +++ - Se observan clamidosporas en +, ++, +++ - No se observan elementos micticos. 3.2. Cultivo de hongos: 1. Se siembra la muestra en Agar Sabouraud en placa y en tubo. 2. Incubacin a 25C. 3. Tiempo de desarrollo: 4 semanas (dermatofitos). Luego se realiza un directo de la colonia con azul de metileno: se coloca una gota de azul de metileno en un porta objeto, se toma un trozo de cinta adhesiva se pasa se manera suave por encima de la colonia y despus se coloca sobre la gota de azul de metileno en el porta, se observa al microscopio con objetivo 40 x.

4.

Trichophyton rubrum

Trichophyton mentagrophytes

T. rubrum

T. mentagrophytes

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CRITERIOS DE INTERPRETACION

II. Micosis invasivas o sistmicas 1. INTRODUCCION Las enfermedades fngicas invasivas son entidades cada vez ms frecuentes, dado el aumento de pacientes susceptibles por la utilizacin de frmacos inmunosupresores. Hay que tenerlas en cuenta en el diagnstico diferencial de las infecciones en los pacientes con factores de riesgo y solicitar las pruebas diagnsticas especficas, ya que el diagnstico precoz puede mejorar el pronstico de estas infecciones, de alta mortalidad. 2. TIPO DE MUESTRAS Sangre Lquidos estriles Biopsias TOMA DE MUESTRAS Examen: Preparacin paciente: Tcnica de recoleccin: Material: Transporte: Cantidad:

3.

HEMOCULTIVO TRADICIONAL con bsqueda de hongos Afebril Antes uso de Antifngicos Antisepsia de piel con OH 70% Desinfeccin de tapa con OH 70% Simultneos, pero distintos sitios puncin Frascos de hemocultivo (mnimo 2),para adultos o peditrico segn corresponda < 2 h, T Ambiente 10 mL adultos, 3-5 mL nios, 1 mL neonatologa.

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4.

PROCEDIMIENTO Siembra en Medio Sabouraud (tubo) muestras lquidas (LCR, biopsias). Hemocultivo tradicional Tincin de gram Realizar cultivo.

Muestras Sistmicas (Sangre)

Hemocultivos Im portante observar *. Turbidez *. Gas *. Hem lisis *. Presencia de Colonias

Directo KOH 20% + Tinta

Gram

Giemsa

25 C

35 C

Tubos de Sabouraud Con CAF

III. Candidiasis Las candidiasis constituyen un grupo de infecciones causadas por un hongo oportunista del gnero Candida, de los cuales Candida albicans es la ms frecuente. Pueden producir una infeccin clnica en prcticamente en cualquier sistema orgnico. El espectro de infecciones abarca desde la enfermedad mucosa y cutnea superficial hasta la diseminacin hematgena extensa con afectacin de rganos diana como el hgado, bazo, rin, corazn y cerebro. En la mujer, la mucosa vaginal tambin constituye un lugar frecuente de infeccin. Se puede transmitir por ropas, objetos y tambin por contacto sexual. Estos hongos estn siempre presentes en la piel y en la mucosa del tracto digestivo, genitourinario y respiratorio de la mayora de las personas, pero se encuentran controlados por otros microorganismos no patgenos. Cuando se produce un desequilibrio, el aumento desmedido de la poblacin de hongos produce esta u otras micosis. 1. Muestra clnicas: Raspados de piel y fanreos Secreciones (heridas, flujo vaginal) Sangre y lquidos estriles Lavado broncoalveolar (LBA) Dispositivos implantables (catteres, prtesis) 2. Procesamiento 2.1. Microscopa: Examen directo: Pueden observarse blastoconidias y en algunos casos la presencia de Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 86 de 105

pseudohifas. KOH 20% en muestras clnicas, principalmente procedentes de la piel, fanreos y mucosas.

Blastoconidios

Pseudohifas

Tincin de Gram

2.2. Cultivos Agar Sabouraud: siembra primaria. Cuando hay desarrollo de levadura se siembra en otros medios para su identificacin. Agar cromgeno: Permite identificar presuntivamente algunas especies de Candida, pero fundamentalmente identifica C. albicans.

Candida albicans

Candida krusei

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Identificacin por microcultivo Agar de harina de maz (Corn Meal Agar): para diferenciar distintas especies de Candida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulacin de hongos miceliales. Colocar un trozo circular de papel filtro sobre el fondo de una placa Petri. Colocar un par de varillas de madera dentro de la placa encima del papel, stas funcionaran como apoyo de un porta objeto de vidrio. Colocar un trozo pequeo de agar Corn Meal sobre el porta objeto. Inocular el agar, haciendo tres lineas con una pequea porcin de la colonia a estudiar. Humedecer el papel filtro, y colocar el porta objeto sobre las varillas, tapar la placa e incubar a 37c po 48 hrs. Luego de la incubacin, colocar un cubre objeto sobre el agar inoculado y observar el desarrollo al microscopio con objetivo 40x.

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N 19. PROCEDIMIENTO TCNICO PARA EL DIAGNSTICO POR INMUNOFLUORESCENCIA

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de secreciones respiratorias de acuerdo a mtodos estandarizados para ddeterminar la etiologa de cuadros respiratorios (bronquitis, neumonas, etc.), utilizando tcnicas de inmunofluorescencia. En este procedimiento se incluyen las tcnicas de diagnstico para: Inmunofluorescencia para Virus respiratorios (parainfluenza, influenza A y B, virus sincicial respiratorio y adenovirus) Inmunofluorescencia directa para Bordetella ALCANCE Tecnlogos Mdicos y Tcnicos Paramdicos de Seccin Microbiologa, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la lectura, interpretacin de resultados y validacin del informe. Auxiliar paramdico: Responsable de la recepcin, ingreso y preparacin de la muestra. DEFINICIONES Inmunofluorescencia: Es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados o fluorocromos. Puede ser directa en un solo paso que detecta antgeno o indirecta en el que se detecta anticuerpo. FITC: conjugado de isotiocianato de fluorescena, fluorocromo ms utilizado, que es una molcula qumica que absorbe energa a cierta longitud de onda y emite fluorescencia en otra, Se utiliza unido a anticuerpos especficos para antgenos del agente a detectar. La cantidad de fluorescencia con la cual una clula se tie es proporcional a la cantidad de sitios de unin. DESARROLLO DEL PROCESO Las muestras deben llegar a la hora fijada, por razones de procesamiento y entrega oportuna de resultados por el laboratorio. 1. Deteccin de Virus Respiratorios 1.1 Fundamento del test El proceso que se realiza para identificar virus respiratorios consta de dos etapas; la primera consiste en hacer un screening para el virus sincicial respiratorio (VRS), diferencindolo de otros virus como adenovirus, Influenza A o B y Parainfluenza 1, 2 y 3, mediante una inmunofluorescencia directa (ID). Para realizar esta tcnica en el laboratorio se dispone de un kit llamado Simulfluor Respiratory Screen, el cual contiene 2 componentes, el primero de ellos esta dirigido contra Adenovirus, Influenza (A y B) y Parainfluenza (1, 2, 3), mientras que el segundo esta dirigido contra VRS. Para realizar la reaccin antgeno-anticuerpo, primero se debe tener fijada la muestra con acetona fra en un pocillo de un portaobjeto, la funcin que cumple la acetona es fijar la muestra y permeabilizar la membrana de la clula facilitando la entrada de los anticuerpos a ella; despus se agrega el reactivo Simulfluor, se incuba en estufa a 37C, para que de esta manera ocurra la reaccin antgeno-anticuerpo y posteriormente se lava con buffer (PBS), para sacar el exceso de anticuerpo no fijado a las clulas. El primer componente del kit se une a las clulas infectadas con alguno de los virus ya mencionados, dndoles un tono verde manzana, debido a que los anticuerpos de este componente estn marcados con FITC, en cambio, el segundo componente del kit se une a las clulas infectadas con VRS dndoles un color amarillo oro; las clulas no infectadas se tien de rojo debido a la presencia de Azul de Evans en el reactivo, estas tinciones se aprecian con microscopio de luz ultravioleta. Si se observan clulas teidas de amarillo oro, indica VRS positivo, puede haber adems Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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clulas teidas de verde manzana, lo que indica la presencia de uno de los otros virus mencionados, por lo tanto, se deben diferenciar realizando la segunda etapa. En la segunda etapa, primero se debe tener fijada la muestra en el portaobjeto (4 pocillos), se agregan los anticuerpos antivirales monoclonales (adquiridos al ISP) contra cada uno de los virus restantes (uno en cada pocillo), se incuba a 37 C, se lava con PBS, y posteriormente se agregan los anticuerpos antiespecie que van marcados con FITC; este anticuerpo se unira al anticuerpo monoclonal anterior que estara unido al antgeno viral en la clula, por lo tanto, se va a observar en el pocillo donde se encuentre el antgeno para el anticuerpo monoclonal especifico, una fluorescencia color verde manzana en las clulas, transmitida por el FITC bajo luz ultravioleta. Esta tcnica es una Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). 1.2.- Materiales y Equipo Micropipeta automtica para volumen de 20 uL Punta de micropipeta automtica (Tips) Cmara hmeda Cubreobjetos Portaobjetos Kit (I.S.P): Anticuerpos anti-virales y anticuerpos anti-especie marcados con FITC Kit (comercial) Simulfluor Respiratory Screen Solucin Tampn Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Agua destilada Microscopio de inmunofluorescencia Cmara estufa a 37C Congelador a 20C Vrtex Reloj o Timer. 1.3 Procedimiento 1.3.1 Primera etapa: inmunofluorescencia directa a) Procesamiento de la muestra. Vortear la muestra hasta obtener turbidez, (desprendimiento de clulas) Depositar 10 uL de muestra sobre un portaobjeto con pocillo limpio Dejar secar a 37C Fijar con acetona fra por 10 minutos Secar a temperatura ambiente, se debe teir lo antes posible, si es necesario guardarlos coloque los portaobjetos en un contenedor a <20 C. b) Tincin inmunofluorescente directa (instructivo Simulfluor Respiratory Screen) Agregar una gota de DFA Reagent, debe ser suficiente para cubrir la muestra Incubar en cmara hmeda a 37 C por 15 minutos Enjuague el portaobjeto con una piseta de PBS para eliminar el exceso de anticuerpo Secar cuidadosamente los bordes del portaobjeto. Montaje Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) Cubrir con cubreobjeto Lectura Leer de inmediato con aumento de 40X. Si esto no es posible, los portaobjetos se deben guardar protegidos de la luz entre 2 a 8 C.

c)

d)

1.3.2 Segunda etapa: Inmunofluorescencia indirecta Se realiza una vez leda los portaobjetos de la primera etapa y se busca identificar clulas infectadas con virus que no sean VRS en aquellas muestras con fluorescencia positiva. Repetir procesamiento indicado en letra a), para cada muestra se utilizarn cuatro pocillos. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Una vez seco agregar una gota de globulina antiviral (monoclonal) de cada virus (Adenovirus, Influenza A o B, Parainfluenza) en el pocillo correspondiente. Incubar en cmara hmeda a 37 C por 30 minutos Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) y cubrir Realizar lo antes posible lectura con aumento 40X, en caso contrario guardar los portaobjetos protegidos de la luz a temperatura entre 2 a 8 C. La muestra es positiva cuando se observa clulas con fluorescena en alguno de los cuatro pocillos, y negativa si estn las clulas de color rojo. 1.4 Interpretacin Se considera muestra positiva si tiene al menos 3 clulas teidas, un resultado negativo, es indicado por ausencia de fluorescena en un mnimo de 20 clulas observndose estas de color rojo. Una muestra con menos de 20 clulas se considera Muestra Escasa. Las clulas infectadas por adenovirus, Influenza A o B, y Parainfluenza 1, 2, 3 mostrarn fluorescencia verde manzana brillante en el ncleo, en citoplasma o ambas se acuerdo al virus. Las clulas infectadas con virus sincicial muestra una fluorescencia de color amarillo oro o dorado anaranjado en el citoplasma. 1.5 Informe: Si es positivo para uno o dos virus, se debe indicar con palabras positivo e informar el resto de los virus como negativo. Se informa cada virus que ha sido estudiado. 1.6 Tiempo de Respuesta: dentro del da hbil (si la muestra ha sido recepcionada antes de 10:00 hrs) 1.7 Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen.

2. Deteccin de Bordetella pertussis Es un bacilo gram negativo pequeo mide entre 0.2 - 0.7 m es un microorganismo muy exigente por lo que si aislamiento es difcil, utilizndose para su diagnostico tcnicas de inmunofluorescencia o mas sensibles como PCR. Causan patologas respiratorias principalmente en nios pequeos y lactantes, los cuales pueden presentar cuadros de bronquiolitis, laringotraquitis, etc; acompaados de sntomas como congestin nasal, estornudos y fiebre; una de sus caractersticas la tos grave, repetitiva y convulsiva, siendo esta etapa la mas contagiosa. 2.1 Fundamento del test La tcnica de ID implica la preparacin de un frotis a partir de la muestra clnica o aislado de cultivo se hace la tincin con un anticuerpo especfico que est unido a un marcador fluorescente (FITC) dirigido contra B. pertussis. Despus de la incubacin con la preparacin de anticuerpos, se examinan con un microscopio de fluorescencia. 2.2 Materiales y Equipos Micropipeta automtica para volumen de 20 uL Punta de micropipeta automtica (Tips) Cmara hmeda Cubreobjetos Portaobjetos Difco FA Bordetella Pertussis (Becton Dickinson) Solucin Tampn Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Agua destilada Microscopio de inmunofluorescencia Cmara estufa a 37C Congelador a 20C Vortex Las muestras deben llegar a la hora fijada, por razones de procesamiento y entrega oportuna de resultados por el laboratorio. 2.3 Procedimiento a) Procesamiento de la muestra Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 92 de 105

Vortear la muestra hasta obtener turbidez, (desprendimiento de clulas) Depositar 15 uL de muestra sobre un portaobjeto nuevo (esparcir) Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar con acetona fra por 1-2 minutos Secar a temperatura ambiente, se debe teir lo antes posible, si es necesario guardarlos coloque los portaobjetos en un contenedor a <20 C. b) Tincin inmunofluorescente directa Agregar 15 uL de conjugado, debe ser suficiente para cubrir la muestra Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente por 30 minutos Enjuague el portaobjeto con una pisceta de PBS para eliminar el exceso de anticuerpo Lavar 10 minutos en buffer PBS, enjuagar con agua destilada Dejar secar Montaje Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) Cubrir con cubreobjetos Lectura Leer de inmediato con aumento de 100X. Si esto no es posible, los portaobjetos se deben guardar protegidos de la luz entre 2 a 8 C.

c)

d)

2.4 Interpretacin Se considera muestra positiva si se observan bacilos minsculos teidos con fluorescena dando un color verde intenso, se debe tener cuidado con tincin no especifica sobre algunos diplococos gram negativos, cocos gram positivos y bacilos similares a difteroides 2.5 Informe: Si es positivo para Bordetella pertussis, se debe indicar con palabra positivo, en caso contrario informar como negativo. 2.6 Tiempo de Respuesta: dentro del da hbil 2.7 Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen. REFERENCIAS Curso de inmunofluorescencia 2010 para virus respiratorios (Instituto de Salud Publica). ANEXOS

Anexo 1:

En la fotografa se observan clulas nasofarngeas infectadas con virus (verde) y clulas negativas (rojo).

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N 20. MTODOS DE DETECCIN DE ANTGENOS Y ANTICUERPOS EN MICROBIOLOGA

OBJETIVO Realizar determinaciones de tipo cualitativos o cuantitativos para la deteccin de antgenos y anticuerpos de agentes microbiolgicos de acuerdo a mtodos estandarizados para obtener resultados confiables en el diagnstico de patologas infecciosas. ALCANCE Seccin de microbiologia, servicio laboratorio clnico Tcnicos paramdicos, tecnlogos mdicos y medico microbilogo de seccin microbiologia. RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la evaluacin del resultado obtenido en el kit, ingresar resultados al sistema informtico y de la validacin del informe. Tcnico paramdico: Responsable de la realizacin de la determinacin de acuerdo al protocolo entregado por el proveedor. DEFINICIONES Antgeno: Son aquellas sustancias que inducen una respuesta por parte del sistema inmune al reconocerla como extraa. Puede ser ambiental como qumicos o microorganismos. Anticuerpo: O inmunoglobulinas son glicoprotenas empleadas por el sistema inmune para neutralizar elementos extraos. Cada tipo de anticuerpo es nico y defiende al organismo de un tipo especfico de antgeno. Inmunocromatografa: Tcnica que consiste en una membrana slida en la cual se encuentra los anticuerpos dirigidos contra el antgeno que se quiere detectar en la muestra clnica. DESARROLLO DEL PROCESO 1. Determinacin de Rotavirus Es el responsable mas comn de de las gastroenteritis aguda en nios pequeos, es transmitido va fecal oral y tiene un periodo de incubacin de uno a tres das, siendo entre los das dos y quinto de la enfermedad los mejores para realizar pesquisa de este virus. Debido a que el virus es difcil de cultivar no es apropiado usar mtodos de aislamiento del virus, por eso hoy en da existe una gran variedad de tcnicas de enzimoinmunoensayo. En nuestro hospital se utiliza un kit comercial de ensayo inmunocromatogrfico de deteccin cualitativa. 1.1 Fundamento del kit Consiste en una determinacin en placa de un solo paso, en donde la membrana de la placa es precubierta con un anticuerpo antirotavirus (banda de prueba), durante la prueba el espcimen migra por la membrana por accin capilar y en la banda reacciona si hay presencia del virus formndose una lnea coloreada. 1.2 Materiales y Equipos Suministrados por el kit: placas, cuentagotas, tubos colectores. Los reactivos se deben mantener refrigerados entre 2 y 8 C No requiere equipo 1.3 Procedimiento Antes de usar se debe temperar placa y buffer. La muestra viene recolectada de acuerdo al Manual de Toma de Muestra Procesamiento muestras slidas: Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 94 de 105

Desenrosque la tapa del tubo colector, luego al azar clave el aplicador en la muestra fecal al menos en tres sitios distintos para colectar aprox. 50 mg. de heces. Ajuste la tapa del colector y luego agite vigorosamente para mezclar buffer con la muestra. Procesamiento muestras lquidas Sostenga el gotero, aspire muestra fecal y transferir dos gotas (50uL) dentro del tubo colector. Ajuste la tapa del colector y luego agite vigorosamente para mezclar buffer con la muestra.

Sostenga el tubo colector hacia arriba y rompa la punta del tubo. Invierta y transfiera 2 gotas de la mezcla al pocillo correspondiente a la muestra en la placa. Leer a los 10 minutos y no ms de 20 minutos. Visualizar dos lneas coloreadas una corresponde al control interno y la otra a la muestra en estudio. 1.4 Interpretacin Positivo: Dos lneas coloreadas aparecen. La intensidad del color puede variar dependiendo de la carga viral. Negativo: una lnea coloreada que corresponde al control interno. No vlido: la lnea de control no aparece. Revisar procedimiento y repetir prueba. 1.5 Informe: Positivo o negativo para rotavirus 1.6 Tiempo de Respuesta: 2 horas 1.7 Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen.

2. Determinacin de toxina A (o A y B) de Clostridium difficile Este agente es responsable del 90% de los casos de colitis pseudomembranosa y de aproximadamente 20% de los casos de diarrea asociada al uso de antibiticos. Uno de los factores de virulencia es la toxina A, esta enterotoxina interfiere a nivel de clulas epiteliales del intestino. El diagnstico de referencia se realiza por medio de cultivos celulares pero este mtodo en poco prctico en un laboratorio por lo que los test de enzimoinmunoensayo son de preferencia. En el hospital se utiliza un kit comercial. 2.1 Fundamento del kit Esta dado por la formacin del complejo antgeno-anticuerpo en una placa que tiene anticuerpos mono y policlonal para la deteccin del antgeno (toxina A o ambas toxinas). La formacin de este complejo se visualiza por la formacin de una lnea coloreada en la placa. 2.2 Material y Equipo Suministrado por el kit: Placas, Solucin de extraccin, Pipetas Los reactivos se deben mantener refrigerados entre 2 y 8 C Centrfuga. 2.3 Procedimiento Antes de usar se debe dejar los reactivos a temperatura ambiente La muestra viene recolectada de acuerdo al Manual de toma de muestra Procesamiento de muestras slidas: Colocar una pequea muestra dentro del tubo con la solucin de extraccin Procesamiento de muestras lquidas: Transferir 200 uL de la muestra al tubo con la solucin de extraccin Agitar hasta obtener una mezcla homognea. Centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto Usando la pipeta colocar 6 gotas en el pocillo de la placa o decantar la muestra Leer los resultados a los 15 minutos.

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2.4 Interpretacin Positivo: Se observan dos lneas coloreadas una de ellas corresponde al control interno y la otra a la muestra. Negativo: Se observa solo una de las lneas que corresponde al control interno. No vlido: No se observan lneas, se debe repetir la prueba. 2.5 Informe Positivo o negativo para toxina A, o para ambas toxinas (depende del kit en uso) 2.6 Tiempo de Respuesta: 2 horas 2.7 Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen.

3. Deteccin de anticuerpos para Mycoplasma pneumoniae La infeccin por Mycoplasma pneumoniae es causa frecuente de infecciones respiratorias agudas en nios, siendo responsable de hasta 40% de las neumonas adquiridas en la comunidad (NAC). Diversos estudios sugieren que esta enfermedad comprende entre el 15 y el 50% de todos los casos de neumonas en adultos e incluso ms en los nios en edad escolar. Las manifestaciones clnicas son inespecficas, los sntomas ms frecuentes son fiebre, tos, compromiso del estado general y cefalea. El diagnstico se puede establecer determinando niveles de IgM en fase aguda. 3.1 Fundamento del kit. Detecta los anticuerpos de tipo IgM para Mycoplasma pneumoniae. El suero es incubado en las placas marcadas con el antgeno, si existe presencia de anticuerpo se formar el complejo antgeno-anticuerpo el cual est marcado con el conjugado emitiendo una fluorescencia visible en el microscopio, en caso no haber anticuerpos no habr formacin de complejo ni emisin de fluorescencia. 3.2 Material Y Equipos Micropipeta automtica Punta de micropipeta automtica (Tips) Tubos kahn Cmara hmeda Cubreobjetos Portaobjetos Kit (comercial) Zeus Scientific Mycoplasma Pneumoniae IgM antibody Solucin Tampn Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Microscopio de inmunofluorescencia Cmara estufa a 37C Congelador a 20C Vrtex 3.3 Procedimiento La muestra utilizada es suero, y es obtenida de acuerdo al manual de Toma de Muestras. En caso de no procesar en el mismo da se debe almacenar a -20 C. Almacenamiento del Kit Placas con sustrato de Mycoplasma pneumoniae se deben guardar a -20C Suero control Positivo/Negativo se almacenan refrigerado entre 2 y 8 C Conjugado marcado (FITC) almacenar refrigerado entre 2 y 8 C Retirar la placa del freezer y esperar a que adquiera temperatura ambiente Preparar una dilucin 1:8 del suero del paciente con buffer PBS Dispensar alrededor de 15-20 ul de la dilucin en el pocillo correspondiente. Incubar en cmara hmeda a 37C por 60 minutos Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 96 de 105

Remover el exceso de muestra con un papel absorbente y lavar suavemente usando piseta con buffer PBS Lavar dos veces por 5 minutos cada vez y con agitacin usando PBS Remover el exceso de buffer y dejar secar Disponer 15 ul del conjugado en cada uno de los pocillos Incubar en cmara hmeda a 37C por 30 minutos Retirar el exceso de conjugado Lavar suavemente con piseta con buffer Lavar dos veces por 5 minutos cada vez y con agitacin usando PBS Remover exceso y dejar secar Dispensar una gota de medio de montaje Cubrir con cubreobjetos Leer a 10X y 40X en microscopio de inmunofluorescencia

3.4 Lectura Positivo: se observa una fluorescencia verde en el pocillo Negativo: no se observa fluorescencia 3.5 Tiempo de Respuesta Se realiza los jueves (en caso de fuerza mayor excepcionalmente se cambiar da). 3.6 Informe: Positivo o Negativo. 3.7 Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen.

4. Reaccin de Widal (pruebas tficas) El objetivo de esta prueba es detectar en suero la presencia de anticuerpos contra los antgenos febriles de Salmonella Typhi y Paratyphi. Almacenamiento del kit de antisueros: se almacenan refrigerado entre 2 y 8 C Procedimiento: Sacar previamente el kit de reactivos a temperatura ambiente. En una placa de vidrio se delimitan con lpiz demarcador las reas de reaccin. Dispensar una gota de cada reactivo por rea. Aadir a cada rea (con su respectivo reactivo) una gota de suero del paciente. Extender cada mezcla en el rea de reaccin. Rotar suavemente la placa de vidrio. La reaccin positiva no tarda ms de 2 min. Interpretacin: Resultado Positivo: aparece aglutinacin con uno o ms de los reactivos. Resultado Negativo: No aparece aglutinacin. Cuando el resultado es positivo se realizan diluciones: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640. Informe de resultados: Positivo: Se informa positivo y la ltima dilucin a la que se produjo aglutinacin. Negativo: Se informa negativo. Registro: Sistema informtico del laboratorio y en la orden de examen

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N 21. PROCEDIMIENTOS TCNICOS PARA EXMENES BIOQUMICOS EN DEPOSICIN

OBJETIVO Realizar procesamiento de muestras de deposicin para la determinacin de analitos de acuerdo a mtodos estandarizados. ALCANCE Seccin Qumica de deposiciones a cargo de Tecnlogo Mdico de Parasitologa, Servicio de Laboratorio. Este protocolo incluye los procedimientos tcnicos de los siguientes exmenes: Test de Benedict Test de Sudan Test de Guayaco o deteccin de hemorragias ocultas en deposicin. Esteatocrito cido

RESPONSABILIDAD Tecnlogo Mdico: Responsable de la ejecucin de las tcnicas, de la interpretacin de resultados y de la validacin del informe. Auxiliar paramdico: Responsable de recepcin, registro en cuaderno de recepcin, ingreso a sistema informtico de peticin y preparacin de muestras.

DOCUMENTOS RELACIONADOS Orden de examen Manual de Toma de Muestras Microbiolgicas

DESARROLLO DEL PROCESO 1. TEST DE BENEDICT: DETERMINACIN DE MONOSACRIDOS Y POLISACRIDOS EN DEPOSICIONES

1.1 OBJETIVOS Identificar carbohidratos en deposicin, que indiquen alteracin en la absorcin intestinal de algunos glcidos. Determinar la etiologa de un cuadro diarreico posterior al consumo de alimentos con lactosa. 1.2 FUNDAMENTO Existen varios test para detectar carbohidratos en deposicin, uno de ellos es el test de Benedict, mtodo de tipo cualitativo, presenta muy buena sensibilidad; aqu se aprovechan las propiedades reductoras de los azcares para identificarlos. Se basa en la propiedad de los azcares (grupos aldehdo o cetona libres) de reducir con rapidez el cobre (agente oxidante) de la solucin alcalina del reactivo de Benedict, hacindolo pasar de ion cprico a oxido cuproso, con formacin de un precipitado de color rojo ladrillo; dicha coloracin evidencia la presencia de azcares en deposicin. Esta tcnica presenta dos fases; si la primera fase es positiva refleja la presencia de monosacridos, y si esta fase da negativa se debe realizar la segunda fase para determinar polisacridos; en sta se usa cido clorhdrico y temperatura para romper los enlaces glicosdicos y de esta manera obtener monosacridos con poder reductor; con esto se explica que la primera fase d negativa y que pueda dar positiva la segunda. 1.3 MATERIALES E INSUMOS Reactivo de Benedict Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 98 de 105

Acido clorhdrico 0.1 N Tubos de vidrio de 16 x 160 cc. Vaso precipitado Propipeta Mechero Trpode

1.4 INTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Esta tcnica no requiere de equipos. 1.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio) y con su orden respectiva. Tipo de muestra: deposicin Dieta previa no requiere. La muestra debe ser fresca. Debe ser transportada en un frasco plstico limpio con tapa rosca por razones de bioseguridad. No se debe llenar excesivamente el frasco, solo se requiere una pequea cantidad. La muestra debe llegar al laboratorio identificada con los datos del paciente. 1.6 DESARROLLO DEL PROCESO Verificar que la muestra venga identificada con nombre y dos apellidos del paciente, adems servicio y orden respectiva. Procesar la muestra: Fase I: Determinacin de monosacridos Emulsionar aproximadamente 1 gramo de deposicin en 5 ml de agua. Dejar decantar o centrifugar a 1500 r.p.m. por 5 minutos. Agregar 0.2 ml del sobrenadante a un tubo con 2 ml de reactivo de Benedict. Poner a hervir por 6 minutos a bao Mara. Leer la reaccin. (Ver anexo 1) La reaccin es positiva cuando la solucin toma una de las siguientes coloraciones: Color verde: indicios Color ladrillo suave: + Color ladrillo intenso: ++ Color rojo ladrillo: ++++ Color anaranjado suave: +++ La reaccin es negativa cuando la solucin permanece del mismo color (celeste). Fase II: Determinacin de polisacridos. Agregar dos gotas de HCl 0.1 N a 0.2 ml de sobrenadante. Hervir a bao Mara por 1 a 2 minutos. Retirar del fuego y agregar 2 ml del reactivo de Benedict. Poner a bao Mara por 6 minutos. Leer e informar igual que la fase anterior.

pH en deposicin: Si adems del test de Benedict, se solicita pH en deposicin; este ltimo se debe determinar con la cinta reactiva de pH la cual al estar en contacto con la deposicin vira de color, este color resultante se compara con una gama de colores donde cada uno corresponde a un determinado pH. Las determinaciones del pH de las deposiciones indican si se producen cantidades significativas de cidos orgnicos (lctico, actico) a partir de los carbohidratos no absorbidos. Un pH menor a 6 en individuos con diarrea puede reflejar problemas en la absorcin de carbohidratos. Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Pgina 99 de 105

1.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: De rutina no se requiere, pero para dudas diagnsticas se puede controlar en forma mensual el reactivo de Benedict, utilizando agua con glucosa, con la cual la reaccin debe dar positiva. 1.8 INFORME El informe debe incluir: nombre completo del paciente, procedencia y fecha de emisin, segn formato del sistema informtico. Si el resultado es positivo se informa Test de Benedict positivo. Si el resultado es negativo se informa Test de Benedict negativo. 1.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnlogo Medico a cargo de la seccin de Parasitologa y Qumica de deposicin.

2. TEST DE SUDAN. DETERMINACIN DE GRASAS Y CIDOS GRASOS EN DEPOSICIN 2.1 OBJETIVOS Ayudar en el diagnstico de patologas asociadas a alteraciones en la absorcin intestinal de grasas. Detectar un cuadro de esteatorrea. 2.2 FUNDAMENTO Las grasas presentes en la deposicin se colorean selectivamente de rojo anaranjado en presencia de la solucin alcohlica de Sudan III. Este colorante es soluble en aceite (lipoflico), por lo tanto, difunde en las gotas de grasa, tornndolas rosadas anaranjadas (gotas de grasas neutras, vistas en la primera fase). Existe una segunda fase en la cual se repite el procedimiento aadiendo varias gotas de cido actico al 36% a la mezcla de heces y colorante, posteriormente se calienta sobre una llama, transformando las grasas neutras en cidos grasos, que tambin se tien con Sudan III. 2.3 MATERIALES E INSUMOS Reactivo de Sudan III Alcohol 76 Acido Actico glacial Tubos de vidrio cnico Portaobjetos Cubreobjetos Placas de Petri Mechero Gradilla.

2.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Microscopio binocular con lente objetivo 40x. 2.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE} La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre y dos apellidos y servicio) y con su respectiva orden. Tipo de muestra: Deposicin recin emitida Cantidad requerida: Debe ser del tamao de una nuez. Transporte: Se debe transportar al laboratorio en un frasco plstico limpio y seco con tapa rosca, el cual debe estar rotulado con los datos del paciente. Este frasco es suministrado por el laboratorio. Dieta previa: No requiere; pero para evitar resultados poco fidedignos el paciente no debe haber ingerido purgantes oleosos. 2.6 DESARROLLO DEL PROCESO Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Verificar que la muestra venga identificada con los datos del paciente. Tcnica: (ver anexo 2) Diluir una punta de esptula de Sudan III en 2 ml de alcohol corriente. Agitar y dejar decantar. Sacar 1 ml del sobrenadante y hacer una emulsin con igual cantidad de deposicin. Poner una gota entre lmina y laminilla. Observar al microscopio con lente objetivo 40x. Si se observan 60 o mas gotas de grasa por campo la reaccin es positiva; indica la presencia de grasas neutras. Al ser la reaccin anterior positiva se puede determinar la presencia de cidos grasos de la siguiente manera: Agregar 3 gotas de cido actico glacial a la emulsin de deposicin y sudan III. Mezclar bien y calentar al mechero. Poner una gota entre lmina y laminilla. Observar al microscopio con aumento objetivo 40x. Si se observan 60 o ms gotas de grasa por campo, la reaccin es positiva, indica presencia de cidos grasos. Reaccin negativa: no se observan gotas de grasa o gotas aisladas. * Si se observaran menos de 60 gotas de grasa por campo, pero ms que gotas aisladas, se debe tener criterio para informar, ya sea, considerando el diagnstico del paciente, y adems teniendo en cuenta que existe un margen normal de grasa en deposicin. Disctalo con su Jefe. 2.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO Realizar trimestralmente un control positivo del reactivo de Sudan III de la siguiente manera: Disponer en una gradilla dos tubos de ensayo. Colocar en ambos tubos 2 ml de aceite. Aadir a uno 4 a 5 gotas de Sudan III, al otro aadir 4 a 5 gotas de tinta roja. Agitar ambos tubos y dejar reposar. Se observara en el tubo al que se le aadi Sudan, que todo el aceite aparece teido, en cambio, en el frasco que se aadi tinta roja, la tinta se va al fondo y el aceite aparece sin teir. 2.8 INFORME El informe debe incluir al menos nombre y dos apellidos del paciente, numero de ficha, procedencia y fecha de emisin, segn formato del sistema informtico. Si el resultado es positivo el informe debe decir: "Test de Sudan III positivo". Si el resultado es negativo el informe debe decir: " Test de Sudan III negativo". 2.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del laboratorio de parasitologa, quien efecta la lectura del examen.

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3. TEST DE GUAYACO, TEST DE HEMORRAGIAS OCULTAS 3.1 OBJETIVOS: Detectar sangre en deposiciones, lo que apoya al diagnstico de enfermedades tales como: cncer de colon y determinar etiologas de anemia ferropnica de origen indeterminado. 3.2 FUNDAMENTO: El test de sangre oculta en deposicin se fundamenta en la capacidad de las enzimas catalasa y peroxidasa presentes en la hemoglobina humana que frente al perxido de hidrogeno oxida un compuesto fenlico incoloro (guayaco) a una estructura quinona provocando as un viraje en su coloracin. La oxidacin del guayaco produce una coloracin azul. Este test cualitativo es el ms utilizado porque es un mtodo rpido, pero tiene el siguiente inconveniente, adems de detectar hemoglobina humana, detecta hemoglobina no humana, es decir, puede arrojar falsos positivos con la ingesta de determinados alimentos (carnes rojas, vsceras, productos con peroxidasas) y frmacos (AINES, hierro), tambin da falsos negativos con el consumo de vitamina C, ah radica la importancia que tiene la dieta previa. El Kit comercial de hemorragias ocultas que dispone el laboratorio es Hema screen . Presenta tarjetas donde se hace la reaccin bioqumica, impregnadas con el guayaco, solucin reveladora que contiene perxido de hidrogeno. 3.3 MATERIALES E INSUMOS Kit comercial HEMA SCREEN Timer o reloj. 3.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: No requiere de equipos o instrumentos. 3.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio) con su orden respectiva. Tipo de muestra: Deposicin. Indicaciones de toma de muestra en Manual de Toma de muestras 3.6 DESARROLLO DEL PROCESO Revisar las muestras; que venga con los datos requeridos y condiciones adecuadas. Abrir la caja del Kit Hema screen y sacar tres sobres para la reaccin de hemorragias ocultas, siempre y cuando sea seriado el examen. La muestra de deposicin se expande en la zona circular que esta en uno de los dos lados del sobre de reaccin. Luego se debe cerrar el sobre de reaccin, de modo que la superficie con la deposicin quede tapada. Al reverso de este sobre se agrega una gota de la solucin reveladora, justo en la zona donde dice Neg Pos, con el objetivo de controlar la tcnica, agregar otra gota del revelador en la zona para la muestra problema, lo mismo se hace para las otras muestras. Despus de 30 segundos y antes de 2 minutos leer los resultados. Cualquier coloracin azul en la zona para la muestra problema se considera positiva. Si no da la coloracin azul se considera negativa. A veces puede resultar una coloracin verde azulada, la cual tambin se considera positiva. Para validar la tcnica el control positivo debe dar azul y el negativo incoloro despus de los treinta segundos, independientemente del resultado de la muestra problema. 3.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: El control de calidad se realiza en forma simultnea con una muestra problema, esto se realiza agregando gotas de perxido de hidrgeno en una zona indicada en el sobre de reaccin. 3.8 INFORME Se ingresa los resultados en el sistema informtico del laboratorio. Si el resultado es positivo se informa : Test de Guayaco positivo Si el resultado es negativo se informa: Test de Guayaco negativo

3.9 RESPONSABLE DIRECTO: El responsable es el Tecnlogo Mdico a cargo del laboratorio de parasitologa y qumica de deposiciones, quien supervisa al tcnico paramdico que realiza la tcnica.

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4. ESTEATOCRITO CIDO 4.1 OBJETIVOS: Determinar semicuantitativamente el porcentaje de grasas presentes en una muestra de heces en pacientes con sintomatologa de mala absorcin intestinal. 4.2 CAMPO DE APLICACIN: En pacientes con sospecha, de insuficiencia pancretica, y en pacientes con fibrosis qustica siendo usado adems en estos como seguimiento del progreso de la terapia. La prueba de esteatocrito cido confirma la esteatorrea y es un micromtodo simple con mayor sensibilidad que otros mtodos como el clsico Van de Kamer 4.3 FUNDAMENTO: Consiste en separar mediante centrifugacin una muestra de heces en fase slida, acuosa y lipdica, la cual previamente es acidificada. Se lee con un lector de microhematocrito obtenindose el porcentaje de grasas presente en las heces. 4.4 MATERIALES E INSUMOS Tubos Khan Pipetas Vidrios Capilares Plasticina Acido perclorico 5M (ver Instructivo Preparacin de reactivos) Lupa 10X

4.5 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Centrifuga microhematocrito Sonicador 4.6 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio del paciente) y con su orden respectiva. Dieta previa: no requiere Obtener la muestra por eliminacin espontnea. Cantidad mnima requerida, cucharadita de t. Depositar la muestra en un frasco limpio no estril; debe ser un frasco tapa rosca por condiciones de seguridad. En el caso que se trate de un lactante: La muestra debe tomarse directamente del paal con una esptula de madera. Cantidad mnima requerida, un tercio de la esptula. 4.7 DESARROLLO DEL PROCESO 1.- Introducir una muestra de heces en un tubo khan limpio alrededor de 0.5 gr. Y se diluye con dos partes de agua destilada. 2.- Tapar y homogenizar en vrtex por 2 minutos 3.- Colocar en el sonicador por 30 a 40 minutos 4.- Colocar 0.5 ml del homogenizado en un tubo khan y se agrega 0.1 ml de cido perclrico 5 M, mezclar en vrtex 5.- La mezcla, se introduce por capilaridad en un capilar de los utilizados para microhematocrito. Se cierra por un extremo con plastilina, se realiza dos capilares por cada muestra. 6.- Se centrifuga por 15 minutos a 13.000 rpm Lectura Se diferencian cuatro fases: 1. FMF: Fase formada por la materia fecal 2. FA: Fase formada por el agua, parte intermedia. 3. FHF: Fase heces flotantes 4. FG: Fase formada por la grasa, sobrenadante Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad

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Fase Slida corresponde a (FMF+FHF) Se lee en un lector de hematocrito el porcentaje de Fase Grasa (FG) respecto a la Fase (F Slida +FG). El resultado se expresa en porcentaje: ESTEATOCRITO (%) =FG/ (FG+FS) * 100 Valores de referencia Normales de 0 a 2 % Patolgicos: superiores a 5 % 4.8 INFORME Se ingresa el resultado del porcentaje en el sistema omega y se deja por escrito en la orden del paciente. 4.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnlogo Mdico a cargo del laboratorio de parasitologa, quien efecta el examen y la lectura del mismo.

REFERENCIAS http://bioweb.wku.edu/courses/Biol121/Carbo/carbo1.asp www.umanitoba.ca/.../lab2/images/benedict.jpeg Diagnsticos y tratamientos clnicos por el laboratorio, John Bernard Henry, 9 edicin, Masson. http://www.geocites.com/CapeCanaveral/Campus/1768/esteato.html http://www.Laboratoriodomingo.com/Labodata/Producto.asp http://www.aecirujanos.es/formacion/coloproc/hemorragias.html Guia Clinica Minsal N 51 Fibrosis Quistica 2007

ANEXOS

Anexo 1: Test de Benedict

La sacarosa es un azcar no reductor, razn por la cual, da negativo el test de Benedict

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Anexo 2: Tcnica de Test de Sudan

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