1

Dr. Heni Rachmawati

School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
Biologically active peptides and proteins are
becoming an increasingly important class of
LATAR BELAKANG
m g g y mp f
drugs.
Their use for human and animal treatment is
problematic, however, because some of these
drugs are generally ineffective when taken
orally
2
STUDI PREFORMULASI
Formulasi protein/peptida sangat berbeda dengan formulasi
obat lainnya karena struktur protein (1 2 3 4) yang reaksi obat lainnya, karena struktur protein (1,2,3,4) yang reaksi
degradasinya tidak satu tahap, hasil degradasi tidak bisa
dideteksi dengan hanya 1 metode analisis
Saat pengembangan formulasi harus diperhatikan:
Struktur protein
Faktor-faktor yang mempengaruhi stabilitas kimia dan f y g p g
fisika
Teknik yang digunakan untuk stabilisasi protein
Studi preformulasi:
Mempelajari data fisikokimia protein dan eksipiennya
Evaluasi kelarutan
Evaluasi stabilitasnya
Mempelajari metode analisisnya
Pemahaman data kelarutan, stabilitas, dan titik
isoelektrik akan menentukan pH yang paling sesuai pada
saat pengembangan formulasi
3
PROTEIN
Senyawa organik makromolekul (BM 5500
220.000 dalton atau 50 2000 asam amino)
Tersusun dari asam amino-asam amino
(BUILDING BLOCK)
Ikatan yang menghubungkan asam amino satu
dengan lainnya adalah ikatan peptida,
menghubungkan gugus karbonil dengan gugus menghubungkan gugus karbonil dengan gugus
amin
4
ASAM AMINO ESENSIAL
5
BIOSINTESIS PROTEIN
Sintesis protein dikode oleh gen tertentu (genetic
code)
Setiap protein mempunyai sekuen (urutan) asam
amino yang unik yang diturunkan dari sekuen
nukleotida pengkode protein (genetic code)
Kode gen merupakan rangkaian terdiri dari 3
nukleotida disebut kodon.
Setiap kodon akan mengkode 1 asam amino
STRUKTUR PROTEIN
Primer:
sekuen dari rantai asam-asam amino
Sekunder:
Jika sekuen asam amino
dihubungkan oleh ikatan hidrogen dihubungkan oleh ikatan hidrogen
Tersier
Jika terjadi interaksi antara alfa
heliks dan beta sheet.Struktur
distabilisasi oleh ik hidrogen,
jembatan garam, disulfida, dan inti
hidrofobik
Kuarterner
Protein yang terdiri dari lebih dari 1
molekul protein: dimer, trimer,
oligomer, baik homomer atau
heteromer.
6
IKATAN KIMIA DALAM PROTEIN UNTUK STABILISASI PROTEIN
Metabolisme: enzim, hormon
FUNGSI PROTEIN
(protein endogen = dihasilkan oleh tubuh)
,
Imunologi: antibodi, sitokin
Pertumbuhan: hormon, faktor pertumbuhan
Transport dan penyimpanan: hemoglobin
Dan lain-lain
Potensial sebagai obat
7
Karakteristik khusus senyawa protein Karakteristik khusus senyawa protein
1. Merupakan senyawa makromolekul yang sangat
kompleks
2. Aktivitas biologinya sangat dipengaruhi oleh
struktur dan konformasinya (primer, sekunder,
tersier, dan kuarterner) tersier, dan kuarterner)
3. Sangat poten (dosis terapi sangat kecil)
4. Sangat tidak stabil oleh berbagai faktor
Beberapa protein endogen diproduksi
secara konstitutif (diproduksi pada kondisi
SIFAT PRODUKSI PROTEIN ENDOGEN
secara konstitutif (diproduksi pada kondisi
normal): hormon, enzim, albumin
Beberapa protein endogen diproduksi
secara induktif (diproduksi hanya kalau ada
stimulus): antibodi, sitokin, faktor
pertumbuhan, enzim
Beberapa protein diproduksi konstitutif Beberapa protein diproduksi konstitutif
dan induktif: albumin, hormon, enzim
8
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN ENDOGEN SEBAGAI OBAT
Jumlah protein yang diproduksi tidak mencukupi untuk terapi
Produksi protein terinhibisi/menurun pada kondisi tertentu roduks prote n ter nh b s /menurun pada kond s tertentu
PERLU ASUPAN/TAMBAHAN PROTEIN DARI LUAR
TUBUH (PROTEIN EKSOGEN)
PROTEIN EKSOGEN HARUS DIISOLASI
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN EKSOGEN SEBAGAI OBAT
Keterbatasan donor atau tidak memungkinkan
secara etik secara etik
Reaksi penolakan jika digunakan donor dari
spesies yang berbeda
PROTEIN REKOMBINAN
9
ORGANISME UNTUK REKOMBINASI PROTEIN TERAPI
BAKTERI
RAGI (YEAST)
TANAMAN
MAMALIA
TERGLIKOSILASI
( d l )
TIDAK TERGLIKOSILASI
(tid k d l ) (mengandung gugus gula) (tidak mengandung gugus gula)
AKTIVITAS?
STABILITAS?
10
DEGRADASI (PENGURAIAN PROTEIN)
KIMIA
FISIKA
BIOLOGI
11
PROSES DEGRADASI PROTEIN DAPAT TERJADI SELAMA:
ISOLASI ISOLASI
PEMURNIAN
PENYIMPANAN
PENANGANAN LANJUT
PENGGUNAAN
PENYIAPAN BAHAN BAKU PROTEIN
REKOMBINAN
DEGRADASI PROTEIN DAPAT MENYEBABKAN
PROTEIN KEHILANGAN AKTIFITASNYA
12
FAKTOR KIMIA PENYEBAB DEGRADASI PROTEIN
Reaksi kimia dapat merusak protein sehingga aktivitas
biologinya hilang
Sumber pemicu reaksi kimia p
Air
Keasaman/kebasaan (pH)
Bahan tambahan yang digunakan dalam formulasi
Pelarut pembantu
suhu
senyawa garam
ion-ion logam
mekanik (pengocokan)
konsentrasi protein
13
Protein disusun oleh rantai polipetida membentuk p p
struktur 3 dimensi yang unik
Struktur protein distabilisasi oleh kombinasi interaksi
elektrostatik dan hidrofobik, dengan fleksibilitas
molekul pada struktur bagian dalam yang tinggi
Dalam larutan, struktur molekul dapat terganggu jika
kondisi lingkungan berubah termasuk perubahan dalam
ukuran molekulnya.
Stabilitas protein dalam larutan
Reaksi kimia pemicu instabilitas protein
Deamidasi
Hidrolisis Hidrolisis
Isomerisasi
Deglikosilasi
Oksidasi
Reaksi Maillard
14
Contoh reaksi degradasi protein
Degradasi protein kondisi
Pemotongan (cleavage) bFGF sangat asam
D id i hEGF t l b Deamidasi hEGF netral basa
Deamidasi bFGF netral basa
Deamidasi insulin pH < 5
Deamidase RNase A pH tinggi
Oksidasi rhPTH pH 10
Suksinimidasi bFGF pH 4 - 5
(DENATURASI)
Adalah perubahan lipatan global dari protein (gangguan Adalah perubahan lipatan global dari protein (gangguan
pada struktur molekul tertingginya, yaitu struktur
tersier)
Denaturasi juga sering terjadi karena perubahan pada
struktur sekundernya.
15
Agregasi dan presipitasi
AGREGASI
Proses utama dari instabilitas fisika.
k k k
Bentuk non-native self association dari suatu protein
yang masih berada dalam larutan dan secara visibel
tidak dapat terlihat dengan mata telanjang
Pada kondisi tertentu, struktur sekunder, tersier dan
kuarterner protein dapat berubah, menyebabkan agregasi
Aktivitas Kelarutan Imunogenesitas berubah
PRESIPITASI
Suatu proses makroskopik yang menghasilkan perubahan
yang visibel (peningkatan viskositas atau kekeruhan pada
larutan)
Faktor fisik penyebab agregasi dan presipitasi
Suhu (peningkatan atau penurunan)
Kekuatan ion
Reaksi polimerisasi (kovalen) dan agregasi (nonkovalen) berperan
terhadap pembentukan presipitat yang tidak larut
Kekuatan ion
mekanik (Vorteks)
pH
Penambahan pelarut organik, surfaktan
16
Perubahan suhu menyebabkan hilangnya struktur
natif protein: natif protein:
Ikatan hidrogen menjadi lemah
Interaksi hidrofobik menjadi kuat
Gaya nonkovalen terganggu
Protein menjadi lebih fleksibel menyebabkan rot n m nja h f s m ny a an
unfolding parsial
Frekuensi kolisi (tumbukan) meningkat
menghasilkan agregat
17
pH dari larutan protein merupakan faktor paling
penting dalam menentukan struktur protein.
pH rendah menurunkan stabilitas sebagai akibat pH rendah menurunkan stabilitas sebagai akibat
terjadinya interaksi elektrostatik yang dipicu oleh
peningkatan muatan positif dari protein.
pH tinggi menurunkan stabilitas melalui tolak-menolak
muatan negatif dari protein.
Kebanyakan protein menunjukkan stabilitas maksimum
pada atau mendekati titik isoelektrik, di mana muatan
netto protein adalah netral
Banyak protein membentuk struktut unfolded pada
pH asam (2-3)
Reversibilitas agregat protein
Reversibel
dapat dilarutkan kembali dalam zat
pereduksi/pendenatur p p
Tidak reversibel
tidak dapat dilarutkan kembali dalam
zat pereduksi/pendenatur
Dalam farmasi jika unfoleded protein tidak dapat kembali ke
keadaan natifnya melalui refolding mis dengan penurunan suhu,
maka denaturasinya disebut irreversible
Karakteristik fisika agregat yang reversibel dan tidak
reversibel adalah sama
Struktur agregat reversibel: secara energi lebih
stabil, susunannya lebih teratur, serta lebih longgar
18
EKSIPIEN PADA FORMULASI PROTEIN
1. SISTEM DAPAR
Dapar yang bisa digunakan untuk formulasi protein: p y g g p
Fosfat (pH 6,2-8,2)
Asetat (pH 3,8 5,8)
Sitrat (pH 2,1 6,2; pK 3,15 dan 6,4)
Suksinat (pH 3,2 6,6; pK 4,2 dan 5,6)
Histidin (pK 1,8;6 dan 9)
Glisin (pK 2,35 dan 9,8) (p )
Arginin (pK 2,18 dan 9,1)
Trietanolamin (pH 7-9)
Tris-hidroksimetilaminometan (pK 8,1)
Maleat
Fungsi dapar dalam formulasi:
Menjaga stabilitas sediaan dan bioaktivitas protein
Mempengaruhi kelarutan protein, selain kekuatan ion
Muatan protein ~ titik isoelektrik
0 pada pH di titik isoelektriknya
+ pada pH di bawah titik isoelektriknya + pada pH di bawah titik isoelektriknya
- Pada pH di atas titik isoelektriknya
Pendaparan sangat dekat dengan titik isoelektrik
tidak disarankan
19
2. KELARUTAN PROTEIN
Kelarutan protein: sangat larut, agak larut, tidak larut
bergantung pada urutan asam amino dan konformasinya
Kelarutan asam amino berbanding terbalik dengan Kelarutan asam amino berbanding terbalik dengan
ukuran dan bagian nonpolarnya
Kelarutan protein ditentukan oleh kemampuan gugus
polar berinteraksi dengan air
Kelarutan protein umumnya minimum pada titik
isoelektriknya karena muatannya 0 sehingga interaksi
antara protein-protein menjadi maksimum antara protein protein menjadi maksimum
Dipengaruhi:
pH
Jenis eksipien yang digunakan
Suhu
3. PENGAWETAN SEDIAAN
Sediaan mengandung protein rentan terkontaminasi
ik b s hi t k k mikroba, sehingga pengawet merupakan komponen
penting terutama untuk multiple dose
Pemilihan pengawet merupakan faktor kritik karena
dapat mempengaruhi stabilitas fisik sediaan
(presipitasi atau turbiditi larutan)
Contoh:
NaHSO3 sebagai pengawet sediaan injeksi
menyebabkan degradasi insulin pada pH 4-7
20
JENIS EKSIPIEN
1.Albumin (human serum albumin, HSA)
Protein (BM 66,4 kDa) berperan dalam ikatan
dengan berbagai macam senyawa
Karena kelarutan dan stabilitasnya luar biasa,
albumin banyak digunakan sebagai eksipien
(stabiliser dan mencegah adsorpsi peptida atau
protein lain pada berbagai permukaan)
Albumin mencegah adsorpsi protein lain pada
permukaan karena kompetisi adsorpsi dengan
protein lain di mana albumin lebih cenderung
teradsorpsi (preferentially adsorption)
Kekurangan albumin sebagai eksipien:
Mengganggu analisa protein lain
Kemungkinan kontaminasi oleh patogen (diatasi Kemungkinan kontaminasi oleh patogen (diatasi
dengan pengembangan rekombinan HSA)
21
2. Asam amino
Fungsi:
Mengurangi adsorpsi Mengurangi adsorpsi
Menghambat agregasi
Menstabilkan protein terhadap denaturasi
karena panas
Meningkatkan kelarutan protein
Asam amino yang sudah digunakan untuk y g g
formulasi protein: glisin, arginin, alanin
3. Karbohidrat
Senyawa gula berfungsi menstabilkan protein
terhadap situasi stres: panas, liofilisasi
Stabilisasi protein oleh gula adalah dari
efeknya terhadap struktur air
Melindungi agregasi protein yang dipicu oleh
lembap
Contoh: sukrosa, maltosa, laktosa, trehalosa
- Sukrosa,
Dapat meningkatkan tegangan permukaan air
oleh karenanya meningkatkan stabilitas protein oleh karenanya meningkatkan stabilitas protein
Zat yang paling efektif melindungi hemoglobin
dari oksidasi spontan menjadi methemoglobin
selama proses liofilisasi dan penyimpanan
22
4. Zat pengkhelat
Beberapa anion dan kation dapat berikatan dengan
protein dan menurunkan kelarutannya p y
Fungsi zat pengkhelat:
Menghilangkan ion-ion tersebut dan
mempertahankan kelarutan protein
Menghambat reaksi oksidasi gugus sulfidril dari
protein yang dipicu oleh logam
Meningkatkan stabilitas terhadap agregasi yang Meningkatkan stabilitas terhadap agregasi yang
dipicu oleh pana
Contoh pengkhelat: EDTA
5. Siklodekstrin
Siklodekstrin adalah senyawa karbohidrat tapi
mempunyai mekanisme stabilisasi yang lebih unik
dibandingkan karbohidrat lain
Fungsi:
Meningkatkan kelarutan protein
Menstabilkan protein (mencegah agregasi)
Pembawa dalam sistem penghantaran protein
23
Struktur siklodekstrin
Struktur ring siklodekstrin menjadikannya
mempunyai kemampuan membentuk kompleks
inklusi karena sifat hidrofobik dari bagian
dalamnya dalamnya
Ukuran kantung sekitar 5-10
Siklodekstrin yang paling banyak dipakai adalah
siklodekstrin (walaupun kelarutan dalam air
sangat rendah)
Asam amino aromatik dapat membentuk kompleks Asam amino aromatik dapat membentuk kompleks
dengan siklodekstrin
24
6. Alkohol polihidrat
Contoh:
gliserol, eritritol, arabitol, xylitol, sorbitol, manitol
Fungsi: stabilisasi protein (mencegah agregasi) F g p (m g g g )
7. Polietilen glikol
Fungsi:
Mengurangi adsorpsi protein pada permukaan
Meningkatkan stabilitas protein (fisik + kimia) Meningkatkan stabilitas protein (fisik + kimia)
Meningkatkan kelarutan protein
Melalui ikatan kovalen
8. Senyawa Garam
Berfungsi meningkatkan kelarutan protein
pada kekuatan ion rendah (salting in) akan pada kekuatan ion rendah (salting in) akan
tetapi jika konsentrasi garam terlalu tinggi,
maka terjadi kompetisi antara ion dan
protein untuk molekul air menghasilkan
penurunan kelarutan protein (salting out)
Konsentrasi garam harus diperhatikan
25
9. Surfaktan
Surfaktan berfungsi meningkatkan stabilitas
protein pada kondisi optimal
Surfaktan yang paling banyak digunakan dalam Surfaktan yang paling banyak digunakan dalam
formulasi protein adalah tween 80
Pada pemakaian tween 80 perlu diperhatikan
cemaran peroksida karena peroksida dapat
mempercepat degradasi protein
Mekanisme stabilisasi protein oleh surfaktan
diduga melalui preferential absorption pada diduga melalui preferential absorption pada
permukaan
Tanpa surfaktan dimerisasi agregasi
+ surfaktan, tidak terjadi agregasi
26
Pangsa pasar protein rekombinan
Pertimbangan preformulasi dan
penapisan bentuk molekul yang formulable
tuntutan keberhasilan
formulasi sediaan protein
g p p m
berkembang pesat
Eksipien penstabil dan peranannya dalam
mencapai waktu simpan yang sesuai
Teknik yang mengindikasikan stabilitas
(memonitor pembentukan atau
peningkatan cemaran
p p y g
Modifikasi struktur
Substitusi asam amino meningkatkan termostabilitas
Glikosilasi (menambahkan gugus gula) meningkatkan
k k i ik f k ki ik i i li ik bili karakteristik farmakokinetik, resistensi proteolitik, stabilitas
termal
Pembentukan ikatan disulfida: perlindungan protein terhadap
denaturasi
Pegilasi (+ PEG) dapat meningkatkan kelarutan, menurunkan
imunogenisitas, meningkatkan t1/2 dan menurunkan toksisitas
27
28
Cryoprotectants : mencegah pembentukan kristal es saat
menyimpan protein pada suhu -20C
Penambahan eksipien
y p p p
Contoh krioprotektan: senyawa gula (non-reducing sugar), poliol,
Inhibitor protease untuk mencegah degradasi proteolitik
Antimikroba (natrium azide, NaN3) pada konsentrasi akhir
0.02-0.05% (w/v) atau timerosal pada konsentrasi akhir 0.01%
Logam pengkhelat (EDTA) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk Logam pengkhelat (EDTA) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk
mencegah oksidasi yang dikatalisis oleh logam
Zat pereduksi (DTT, ditiotritiol dan merkaptoetanol, 2-ME)
pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk mempertahankan protein
dalam keadaan tereduksi dengan mencegah oksidasi sistein, Cys.
Polimer seperti serum albumin, siklodekstrin: mencegah
adsorpsi permukaan protein
Asam-asam amino, seperti histidin dan metionin: antioksidan
29
Formulasi sediaan protein rekombinan
Sediaan cair
Sediaan padat
Mengontrol ukuran partikel dan distribusi ukuran
partikel dalam sediaan cair protein merupakan hal
yang sangat sulit.
Formulasi dalam sediaan kering (lebih diminati)
Spray-drying
Freeze drying/
liofilisasi
Teknologi cair
superkritik
Protein yang stabil selama proses dan penyimpanan
30
Proses Spry freeze drying/liofilisasi untuk formulasi
sediaan protein serbuk
Atomisasi larutan protein + pembawa Atomisasi larutan protein + pembawa
ke dalam nitrogen cair
dispersi kasar
Pemindahan dispersi padat
ke precooled freeze dryer
Pengeringan menggunakan
Stabilitas protein tetap terjamin:
Struktur
Aktivitas
reconsitutable
program standar freeze drying
Liofilisat protein
Kadar air < 3%
31
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan
dalam proses liofilisasi protein
1 Jenis dan konsentrasi krioprotektan 1. Jenis dan konsentrasi krioprotektan
2.Konsentrasi protein
3.Konsentrasi bulking agent
Contoh formulasi tripsinogen dengan liofilisasi
Pengaruh konsentrasi terhadap aktivitas produk akhir
Liofilisasi versus stabilitas protein : aktivitas
32
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
33
Pengaruh konsentrasi protein
AAPS PharmsciTech 2005
Liofilisasi versus stabilitas protein : agregasi
J .Pharm.Sci., 2001, 90
34
Pengaruh jenis dan konsentrasi lioprotektan
J .Pharm.Sci., 2001, 90
Pengaruh konsentrasi protein
35
Liofilisasi versus rekonstitusi
Pengaruh konsentrasi protein terhadapa struktur liofilisat
Konsentrasi protein
Pengaruh konsentrasi protein terhadap waktu rekonstitusi
10 min setelah rekonstitusi
36
Sediaan protein liofilisat Sediaan protein liofilisat
Freeze dryer
Sistem penghantaran
Merupakan bagian integral dari pengembangan produk farmasi
terutama untuk biomolekul.
Berperan tidak hanya dalam pengaturan siklus hidup suatu
molekul tapi juga pada aspek farmakologinya
Salah satu tantangan dalam terapi menggunakan protein adalah
b im n sist m p n h nt n n t p t bagaimana sistem penghantaran yang tepat
Nyaman bagi pengguna
Efektif
Efisien
37
Sistem penghantaran pertama dan yang masih
dipertahankan sampai sekarang untuk protein dan
peptida
RUTE INJEKSI
Ketidaknyamanan penggunaan
Merupakan rute invasif
Jaminan yang tinggi akan sterilitas sediaan
peptida
Jaminan yang tinggi akan sterilitas sediaan
Biaya dan keterbatasan penggunaan
LIMITATION
1. Penghantaran protein melalui paru-paru (pulmonary
delivery): untuk insulin
2. Penghantaran melalui oral :terutama untuk pengobatan
Alternatif sistem penghantaran protein terapetik
g p g
jangka panjang: MOST TARGET
Penggunaan carrier untuk menghindari degradasi GI
Strategi pengembangan untuk meningkatkan absorpsi
3. Penghantaran melalui nasal
Merupakan pengembangan terkini penghantaran
protein melalui absorpsi transmukosa, sangat efektif protein melalui absorpsi transmukosa, sangat efektif
dan tidak iritan
Peluang pasar untuk sediaan protein terapetik
38
39
40
TUJUAN FORMULASI PROTEIN
Secara umum sama dengan tujuan formulasi senyawa obat:
1 k k k d 1. Meningkatkan penerimaan kepada pasien
2. Meningkatkan stabilitas dan efikasi
3. Memudahkan penggunaan
4. Meningkatkan performan