Anda di halaman 1dari 33

ENKAPSULASI METFORMIN DENGAN CHITOSAN NANO PARTIKEL SEBAGAI OBAT ANTIDIABETES TIPE II

Usulan Penelitian

MOCHAMMAD IQBAL ARDI WIBOWO MUHAMMAD GUFRON

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

ENKAPSULASI METFORMIN DENGAN CHITOSAN NANO PARTIKEL SEBAGAI OBAT ANTIDIABETES TIPE II

MOCHAMMAD IQBAL ARDI WIBOWO MUHAMMAD GUFRON

Usulan Penelitian Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Departemen Teknologi Hasil Perairan

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

PRAKATA
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh Puja puji serta syukur penulis ucapkan pada Allah SWT yang telah menjadi motivasi terbesar penulis untuk menyelesaikan usulan penelitian ini dengan menciptakan dunia dan semesta alam yang melimpah akan ilmu pengetahuan ini. Tak lupa pula shalawat serta salam kepada Nabi Muhammad SAW yang telah menjadi panutan serta pemimpin di dunia ini sehingga penulis dapat termotivasi dan lancar dalam penyelesaian usulan penelitian ini. Terima kasih juga penulis ucapkan pada Bapak Dr. Ir. Bustami Ibrahim, MS dan Ibu Dr. Pipih Suptijah, MBA atas bantuan dan bimbingannya sehingga penulis dapat menyelesaikan usulan penelitian ini sebaik mungkin. Penulis juga mengucapkan terima kasih yang sangat besar pada kedua orang tua penulis atas doa dan motivasinya untuk kelancaran serta kesuksesan penulis. Penulis juga mengucapkan terimakasih sebesar-besarnya kepada Iqbal, Rama, teman-teman Teknologi Hail Perairan (angkatan 43, 44, 45 dan 46) serta karyawan Departemen Teknologi Hail Perairan yang setia membantu dan memberikan semangat kepada penulis. Penulis sadar bahwa penulisan usulan penelitian ini masih jauh dari kesempurnaan yang diharapkan, oleh karena itu saran dan kritik yang dapat membuat usulan penelitian ini menjadi lebih baik sangat diharapkan oleh penulis. Penulis berharap penelitian ini akan berjalan dengan baik dan lancar. Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh

Bogor, Januari 2012

DAFTAR ISI
PENDAHULUAN .............................................................................................................. 1 Latar Belakang ................................................................................................................ 1 Rumusan Masalah ........................................................................................................... 3 Tujuan Penelitian ............................................................................................................ 3 Manfaat Penelitian .......................................................................................................... 3 Hipotesis Penelitian ........................................................................................................ 4 TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................................... 4 Diabetes Melitus ............................................................................................................. 4 Pengobatan Diabetes Melitus .......................................................................................... 7 Metformin ....................................................................................................................... 7 Hewan Coba .................................................................................................................. 10 Nano Partikel Chitosan ................................................................................................. 11 Enkapsulasi ................................................................................................................... 14 BAHAN DAN METODE ................................................................................................. 14 Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................................... 14 Bahan dan Alat .............................................................................................................. 14 Metode Pembuatan Nano Partikel Chitosan .....................Error! Bookmark not defined. Tahapan pengujian dan menganalisis karakteristik nano chitosan................................ 15 Proses Enkapsulasi (Hsio dkk, 2003; Chang dan Chiu, 2003)...................................... 15 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 17 LAMPIRAN...................................................................................................................... 20

PENDAHULUAN Latar Belakang Perkembangan peradaban manusia terus berkembang dan menjadi peradaban yang berteknologi tinggi. peradaban yang tinggi tersebut memiliki banyak keunggulan sifat dan beberapa keuntungan dalam memudahkan kepentingan manusia. Hal tersebut dapat dilihat dari cara atau mekanisme dalam kehidupan sehari-hari yang serba praktis dan tersedia. Perkembangan ini juga memiliki banyak efek negatif dalam kehidupan manusia, salah satu efek diantara banyak efek negatif dalam kehidupan manusia dalam perkembangan peradaban ialah masalah penurunan kesehatan. Banyak penyakit yang muncul dikarenakan dari perkembangan kehidupan manusia yang berkembang cepat dan serba praktis. Diantaranya ialah penyakit kanker dan Diabetes mellitus. Penyakit kanker dan infeksi merupakan salah satu ancaman utama terhadap kesehatan masyarakat. Meskipun usaha pengobatan kanker secara intensif telah dilakukan namun hingga saat ini belum ditemukan obat yang dapat mengatasi kanker secara memuaskan. Hal ini disebabkan karena rendahnya selektifitas obat-obat anti kanker yang digunakan atau karena patogenesitas penyakit itu sendiri belum jelas benar. Di lain pihak masyarakat Indonesia telah mengenal berbagai ramuan tradisional yang dinyatakan sebagai obat kanker (Meiyanto dan Sugiyanto, 1997). Diabetes melitus merupakan penyakit akibat gangguan metabolisme tubuh yang dicirikan tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) disertai gangguan pada metabolisme karbohidrat, lipid dan protein sebagai dampak dari menurunnya fungsi insulin (Dirjen Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan 2005). Penderita diabetes mellitus mengalami peningkatan pada produksi radikal bebas sehingga sistem pertahanan antioksidan terganggu yang berujung pada terjadinya kerusakan seluler pada sel pankreas (Winarto 2007). Tekanan darah yang baik bagi penderita diabetes mellitus adalah kurang dari 130/80 mmHg, sedangkan indeks massa tubuhnya harus dijaga normal yang berkisar 18,5-22,9 kg/m2. Menurut survei yang di lakukan oleh organisasi kesehatan dunia (WHO), jumlah penderita Diabetes mellitus di Indonesia pada tahun 2000 terdapat 8,4 juta orang, jumlah tersebut menempati urutan ke-4 terbesar di dunia, sedangkan urutan di atasnya

adalah India (31,7 juta), Cina (20,8 juta), dan Amerika Serikat (17,7 juta). Diperkirakan jumlah penderita Diabetes mellitus akan meningkat pada tahun 2030 yaitu India (79,4 juta), Cina (42,3 juta), Amerika Serikat (30,3 juta) dan Indonesia (21,3 juta). Jumlah penderita Diabetes Mellitus tahun 2000 di dunia termasuk Indonesia tercatat 175,4 juta orang, dan diperkirakan tahun 2010 menjadi 279,3 juta orang, tahun 2020 menjadi 300 juta orang dan tahun 2030 menjadi 366 juta orang (Darmono 2007). Metformin adalah obat yang membantu menurunkan kadar gula darah dalam tubuh dengan mengurangi jumlah gula yang diproduksi oleh hati, serta secara bersamaan meningkatkan kemampuan penyerapan gula dari otot-otot. Metformin juga telah ditunjukkan untuk mengurangi LDL (low-density lipoprotein, atau "buruk") kadar kolesterol.Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, metformin merupakan salah satu dari dua obat yang ada antidiabetik oral dan satu-satunya yang telah terbukti dapat mencegah komplikasi kardiovaskular diabetes. Metformin biasanya dijual di bawah nama merek Glucophage, Glucophage XR, Glumetza, Fortamet dan Riomet. Sebelum mengkonsumsi metformin, dianjurkan mulai dengan dosis rendah untuk memungkinkan tubuh untuk mendapatkan digunakan untuk obat. Saat ini tidak ada pedoman dosis yang ditetapkan. Dokter hanya meresepkan dosis berdasarkan toleransi dan kebutuhan individu. Penggunaan metformin yang direkomendasikan tidak melebihi 2.550 mg per hari untuk orang dewasa dan 2.000 mg per hari untuk anak-anak. Metformin diperkirakan 50%-60% bioavalabilitasnya oral, kelarutannya dalam lipid rendah, dan volume distribusinya pada cairan tubuh. Metformin mempunyai t 1,5-3 jam, tak terikat protein plasma, tidak dimetabolisme, dan dieksresi oleh ginjal sebagai senyawa aktif. Kerja metformin pada

glukoneogenesis di hati di duga mengganggu pengambilan asam laktat oleh hati. Pada pasien insufisiensi ginjal (terjadi akumulasi Metformin) dapat meningkatkan risiko asidosis laktat sehingga dapat berakibat fatal. Absorpsi metformin relatif lambat dan dapat diperpanjang jadi sekitar 6 jam. Obat ini diekskresikan dalam urin dengan kecepatan klirens ginjal yang tinggi yaitu 450 ml/menit. Eliminasi awal metformin adalah cepat dengan waktu paruh bervariasi antara 1.7 dan 3 jam. Salah satu cara untuk mengatasi kelemahan tersebut ialah dengan cara

mikroenkapsulasi metformin dengan suatu penyalut. Penyalut yang telah digunakan adalah chitosan (Sugita 2010). Chitosan adalah polisakarida alami yang memiliki sifat nontoksik, biokompatibel, dan biodegradabel, hanya saja dalam bentuk gel bersifat rapuh sehingga perlu dimodifikasi. Modifikasi chitosan dapat dilakukan baik secara kimia maupun fisika dan berguna untuk meningkatkan sifat reologinya. Modifikasi kimia chitosan yang pernah dilakukan adalah dengan menambahkan glutaraldehida sebagai agen penautsilang dan polimer alami atau sintetis sebagai bahan saling tembus (interprenetrating agent). Polimer alami yang ditambahkan adalah sejenis hidrokoloid, diantaranya gom guar, alginat, karboksimetilselulosa (CMC) dan gom xantan, sedangkan polimer sintetis diantaranya polivinil alkohol (PVA). Modifikasi chitosan dengan penaut silang glutaraldehida yang telah diujicobakan untuk sistem pengantaran obat metformin baik melalui kajian disolusi secara in vitro maupun difusi adalah chitosan-gom guar, chitosan-CMC, chitosan-alginat dan chitosan-gom guar-alginat. Kinerja membran chitosan termodifikasi tersebut melalui uji difusi memberikan gambaran bahwa mekanisme pelepasan ketoprofen diawali dengan proses pembengkakan (swelling) membran saat membran kontak dengan cairan, selanjutnya pembukaan pori sehingga obat terlepas (Sugita 2010). Rumusan Masalah Metformin yang digunakan untuk penyembuhan diabetes selama ini masih memiliki efek samping yang berbahaya pada tubuh pemakainya. Chitosan Nanopartikel yang memiliki kemampuan menghilangkan senyawa tak stabil dan antidiabetes diharapkan dapat menghilangkan efek samping metformin dan menambahkan aktivitas antidiabetes. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menguji kemampuan antidiabetes dari enkapsulasi Nano Chitosan-Metformin terhadap tikus galur Sparague dawley. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan bermanfaat sebagai jalan keluar terhadap potensi obat-obatan yang selama ini digunakan namun masih memiliki efek samping yang dapat membahayakan tubuh dengan cara membuat enkapsulasi

nano chitosan. Manfaat lain yang didapatkan ialah penambahan mutu dari aktivitas antidiabetes metformin yang ditambah kemampuan antidiabetes dari nano chitosan. Hipotesis Penelitian Hipotesis penelitian ini adalah penambahan enkapsulasi nano chitosan pada metformin akan dapat menetralisir efek samping dari penggunaan metformin dan menambah kemampuan dari aktivitas antidiabetes metformin.

TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Melitus Indonesia adalah salah satu negara dengan penderita diabetes terbanyak di dunia. Banyaknya penderita diabetes di Indonesia karena gaya hidup masyarakat yang tidak memperhatikan pola hidup sehat, seperti mengkonsmsi gizi seimbang dan berolah raga cukup. Jumlah penderita diabetes pun semakin meningkat karena penyakit ini dapat dilanjutkan ke keturunan. Menurut survei yang di lakukan oleh organisasi kesehatan dunia (WHO), data pada tahun 2000 negara dengan jumlah penderita Diabetes mellitus tertinggi di dunia adalah India sebanyak 31,7 juta, Cina 20,8 juta, Amerika Serikat 17,7 juta, dan Indonesia terdapat 8,4 juta orang. Diperkirakan jumlah penderita Diabetes mellitus akan meningkat pada tahun 2030 yaitu India (79,4 juta), Cina (42,3 juta), Amerika Serikat (30,3 juta) dan Indonesia (21,3 juta). Jumlah penderita Diabetes Mellitus tahun 2000 di dunia termasuk Indonesia tercatat 175,4 juta orang, dan diperkirakan tahun 2010 menjadi 279,3 juta orang, tahun 2020 menjadi 300 juta orang dan tahun 2030 menjadi 366 juta orang (Darmono 2007). Diabetes melitus didefinisikan sebagai suatu penyakit kelainan metabolik kronis secara serius yang memiliki dampak signifikan terhadap kesehatan yang ditandai dengan tingginya kadar gula dalam darah. Salah satu penyebab diabetes melitus yaitu ditandai dengan menurunnya hormon insulin yang diproduksi oleh sel beta pulau Langerhans dalam kelenjar pankreas. Insulin merupakan hormon yang berperan dalam metabolisme glukosa khususnya sebagai perantara masuknya glukosa di dalam darah ke sel-sel jaringan tubuh lainnya seperti otot dan jaringan lemak (Garret & Grisham 2002).

Diabetes melitus merupakan penyakit akibat gangguan metabolisme tubuh yang dicirikan tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) disertai gangguan pada metabolisme karbohidrat, lipid dan protein sebagai dampak dari menurunnya fungsi insulin. Diabetes melitus salah satu penyakit degeneratif yang bersifat kronis. Penyakit ini dapat menimbulkan kerusakan pada semua organ tubuh dan menimbulkan berbagai keluhan atau komplikasi, seperti komplikasi kronik pada mata, ginjal, pembuluh darah dan lain-lain (Dirjen Bina Kefarmasian & Alat Kesehatan 2005). Penderita diabetes mellitus mengalami peningkatan pada produksi radikal bebas sehingga sistem pertahanan antioksidan terganggu yang berujung pada terjadinya kerusakan seluler pada sel pankreas (Winarto 2007). Tekanan darah yang baik bagi penderita diabetes mellitus adalah kurang dari 130/80 mmHg, sedangkan indeks massa tubuhnya harus dijaga normal yang berkisar 18,5-22,9 kg/m2 (WHO 2010). Hiperglikemia merupakan keadaan saat konsentrasi kadar gula dalam darah melewati batas normal. Keadaan ini dapat terjadi akibat adanya defisiensi insulin sehingga penyerapan glukosa ke dalam sel menjadi terhambat (Ohta 2002). Kadar gula dalam darah normal kurang dari 100 mg/dL, sesaat setelah makan kadar gula dalam darah dapat meningkat hingga 120 mg/dL dan dapat kembali normal 2 jam setelah makan (Soegondo 2004). Gejala umum yang timbul pada diabetes melitus diantaranya, sering haus, sering buang air kecil, kesemutan, penglihatan mulai terganggu, banyak makan akan tetapi berat badan menurun, cepat merasa lelah, dan sering mengantuk (Purwakusumah 2003). Penyakit diabetes melitus dapat disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya pola makan, obesitas, faktor genetik, bahan kimia dan obatobatan, serta infeksi pada pankreas (Wijayakusuma 2004). Diabetes melitus terbagi menjadi dua tipe yaitu diabetes tipe I (Insulin Dependent Diabetes Melitus) dan diabetes tipe II (Insulin Independent Diabetes Melitus). DM tipe I dapat didefinisikan sebagai tipe diabetes yang tergantung pada insulin. Dibetes tipe I ini sel pankreasnya mengalami kerusakan sehingga sel-sel -pankreas tidak dapat menseksresikan insulin atau jika dapat mensekresi insulin, maka insulin yang disekresikan hanya berjumlah sedikit. Kerusakan pada sel-sel -pankreas disebabkan adanya peradangan, karena hal inilah penderita DM tipe I selalu bergantung pada adaanya insulin. Berbeda dengan DM tipe I, DM tipe II

merupakan tipe diabetes yang tidak tergantung pada insulin. Hal ini terjadi bukan karena sel -pankreas yang rusak namun karena jumlah insulin yang dihasilkan menurun. Penurunan tersebut disertai defisiensi insulin hingga resistensi insulin (Murray 2003). DM tipe II ini umumnya disebabkan oleh obesitas atau kelebihan berat badan. Pengobatan terhadap diabetes tipe ini dilakukan dengan pengaturan pola makan dan olahraga, namun dapat pula diobati dengan obat-obat antidiabetes tertentu (Matsumoto et al. 2002). Menurut Wijayakusuma (2004), selain DM tipe I dan II terdapat pula satu tipe diabetes melitus yang terjadi pada saat kehamilan. Penyakit tersebut umumnya dialami oleh wanita hamil dan akan kembali normal setelah melahirkan. Seorang wanita hamil membutuhkan lebih banyak insulin untuk mempertahankan metabolisme karbohidrat. Jika tidak menghasilkan lebih banyak insulin, wanita hamil dapat menderita penyakit diabetes yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan metabolisme glukosa (karbohidrat) dan metabolisme lainnya yang terjadi dalam tubuh. Gagalnya secara wajar gula darah masuk ke dalam sel menyebabkan kandungan gula darah di dalam cairan darah menjadi meningkat. Beberapa anjuran untuk dilakukan bagi penderita diabetes tipe-1 untuk mengontrol kandungan gula darah didalam carian darahnya adalah: melakukan diet, khususnya terhadap makanan yang mengandung banyak glucosa; melakukan latihan fisik secara teratur, dan terapi insulin sebagai solusi kurangnya suplai insulin oleh sel-. Diabetes tipe-2 sangat dipengaruhi oleh factor obesitas. Obesitas dapat menyebabkan meningkatnya resistansi reseptor insulin pada membran sel. Oleh karena itu diabetes tipe-2 erat kaitannya dengan faktor keturunan dan budaya yang berkembang di lingkungannya. Seseorang dapat mengalami salah satu tipe diabetes di atas dan dapat pula mengalami sekaligus keduanya. Beberapa cara penyelesaian telah dilakukan untuk dapat mengatasi atau menyembuhkan penderita, namun hasil yang diperoleh belum mencapai titik yang paling optimum. Oleh karena itu beberapa alternatif pengembangan sedang diinvestigasi yang salah satunya adalah melibatkan nanoteknologi (Zhirno dan Cavin, 2011; Mishra et al., 2008).

Pengobatan Diabetes Melitus Pengobatan diabetes melitus umumnya dilakukan dengan pengaturan diet, pemberian obat antidiabetik oral, dan terapi insulin. Akan tetapi pemberian obat-obat antidiabetik oral dapat menimbulkan efek samping yang berbahaya. Efek tersebut dapat berupa gangguan mekanisme dalam tubuh hingga kematian (Tuyet & Chuyen 2007). Pemberian obat secara oral merupakan cara pemberian obat yang paling umum dilakukan karena mudah, murah dan aman. Umumnya pemberian obat antidiabetik oral hanya dilakukan untuk penderita DM tipe II, obat tersebut terbagi menjadi dua jenis, diantaranya obat sintetik dan obat tradisional (Mathur & Shiel 2003). Obat sintetik yang memiliki aktivitas antidiabetik dibagi menjadi 4 kelas menurut mekanisme kerjanya. Pertama, golongan sulfonylurea yang memiliki mekanisme kerja utama pada peningkatan insulin. Obat dari golongan ini banyak digunakan dalam pengobatan diabetes adalah glimepiride. Kedua, golongan biguanida yang dapat mengurangi produksi glukosa hati sehingga dapat meningkatkan sensitivitas periferal dan mengurangi penyerapan glukosa intestinal, contoh obat golongan ini adalah glucophage, diabex, glucotica, dan lain-lain. Ketiga, golongan inhibitor -glukosidase salah satunya adalah acarbose. Obat ini dapat menghambat enzim spesifik yang menguraikan pati dalam usus halus sehingga menunda penyerapan glukosa hasil pemecahan karbohidrat di dalam usus. Keempat, merupakan insulin eksogen yang berperan dalam meningkatkan sensitivitas insulin secara tidak langsung dan menekan produksi gula hati . obat lainnya yang sering digunakan dalam terapi diabetes adalah pioglitazon, yang termasuk ke dalam golongan thiazolidinedione. Pioglitazone bekerja dengan cara meningkatkan sensitivitas insulin pada jaringan target, seperti menurunkan glukoneogenesis di hati (Tuyet & Chuyen 2007). Metformin Metformin adalah satu-satunya obat antidiabetes yang telah meyakinkan ditunjukkan untuk mencegah komplikasi kardiovaskular diabetes. Ini membantu mengurangi kolesterol LDL dan trigliserida, dan tidak terkait dengan peningkatan berat badan. Pada 2010, metformin merupakan salah satu dari hanya dua obat antidiabetik oral di Daftar Organisasi Kesehatan Dunia Model Obat Esensial

(glibenklamid). Metformin menyebabkan efek samping sedikit (yang paling umum adalah gangguan pencernaan) dan berhubungan dengan risiko rendah hipoglikemia. Asidosis laktat (penumpukan laktat dalam darah) dapat menjadi perhatian serius dalam overdosis dan ketika itu diresepkan untuk orang dengan kontraindikasi, tetapi sebaliknya, tidak ada risiko yang signifikan. Pertama disintesis dan ditemukan untuk mengurangi gula darah pada tahun 1920, metformin dilupakan selama dua dekade berikutnya sebagai penelitian dialihkan ke insulin dan obat antidiabetes lain. Minat metformin muncul kembali di akhir 1940-an setelah beberapa laporan bahwa hal itu bisa menurunkan kadar gula darah pada orang, dan pada tahun 1957, Perancis dokter Jean Sterne diterbitkan percobaan klinis pertama metformin sebagai pengobatan untuk diabetes. Ini diperkenalkan ke Britania Raya pada 1958, Kanada pada tahun 1972, dan Amerika Serikat pada tahun 1995. Metformin sekarang diyakini menjadi obat antidiabetes paling banyak diresepkan di dunia,. Di Amerika Serikat saja, lebih dari 48 juta resep diisi pada tahun 2010 untuk formulasi generiknya. Metformin adalah terutama digunakan untuk diabetes tipe 2 Namun semakin banyak digunakan dalam sindrom ovarium polikistik (PCOS), nonalkohol penyakit hati berlemak (NAFLD) dan pubertas dini, tiga penyakit lain yang fitur resistensi insulin , ini indikasi masih dianggap eksperimental. Manfaat metformin pada NAFLD belum ekstensif dipelajari dan mungkin hanya sementara;. meskipun beberapa percobaan terkontrol acak telah menemukan peningkatan yang signifikan dengan penggunaan, bukti masih cukup. Penggunaan utama untuk metformin dalam pengobatan mellitus tipe, diabetes 2 terutama pada orang gemuk. Dalam kelompok ini, lebih dari 10 tahun pengobatan, metformin mengurangi komplikasi diabetes dan kematian secara keseluruhan sekitar 30% bila dibandingkan dengan insulin dan sulfonilurea (glibenclamide dan klorpropamid) dan sekitar 40% bila dibandingkan dengan kelompok hanya diberikan saran diet. Perbedaan ini diselenggarakan pada orang yang diikuti selama lima sampai 10 tahun setelah penelitian. Sejak kontrol glukosa intensif dengan metformin muncul untuk mengurangi risiko yang berkaitan dengan diabetes endpoint pada orang gemuk dengan diabetes, dan berhubungan dengan berat badan kurang. dan serangan hipoglikemik lebih sedikit dibandingkan insulin dan sulphonylureas, mungkin

10

menjadi terapi lini pertama farmakologis pilihan dalam kelompok ini. Selain itu, metformin itu tidak berpengaruh pada berat badan: Selama periode pengobatan 10 tahun, kelompok metformin diperoleh sekitar 1 kg, sama seperti kelompok nasihat diet, sedangkan kelompok sulfonilurea naik 3 kg, dan kelompok insulin, 6 kg. Sebagai metformin affords tingkat yang sama kontrol gula darah terhadap insulin dan sulfonilurea, tampaknya menurunkan angka kematian terutama melalui serangan jantung menurun, stroke dan komplikasi kardiovaskular lainnya. Metformin memiliki risiko hipoglikemia lebih rendah dibandingkan dengan sulfonilurea, meskipun telah jarang terjadi selama latihan intens, defisit kalori, atau bila digunakan dengan agen lain untuk glukosa darah yang lebih rendah. Metformin juga tidak berhubungan dengan penambahan berat badan, dan sederhana mengurangi kadar LDL dan trigliserida.

Gambar 1. Susunan biokimia metformin (Murfida 2001)

Hewan Coba Tikus putih yang biasanya dijadikan percobaan terdiri atas lima macam yaitu Long Evans, Osborne Mendel, Sherman, Sprague-Dawley dan Wistar. Tikus percobaan memiliki beberapa karakteristik diantaranya adalah nokturnal, yaitu aktivitasnya malam hari dan tidur pada siang hari, tidak mempunyai gall blader (kantung empedu), tidak dapat mengeluarkan isi perut (muntah), dan tidak pernah berhenti tumbuh, walaupun kecepatan pertumbuhannya akan menurun setelah 100 hari (Muchtadi 1989).

11

Menurut Smith dan Mangkoewidjojo (1988) tikus yang digunakan untuk percobaan memiliki berat badan 35-40 g setelah berumur empat minggu dan berat badan dewasa rata-rata 200-250 g, tetapi bervariasi bergantung pada galur. Galur sprague-dawley paling besar, hampir sama dengan tikus liar. Smith dan Mangkoewidjojo juga menuliskan ada dua sifat yang membedakan tikus dari hewan percobaan lainnya yaitu tikus tidak dapat muntah karena struktur anatomi yang tidak lazim di tempat esophagus bermuara ke dalam lambung dan tidak mempunyai kantung empedu. Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jenis Sparague-Dawley berjenis kelamin jatan dengan berat badan sekitar 150-250 g. Tikus Sparague-Dawley dengan jenis kelamin betina tidak digunakan karena kondisi hormonal yang sangat berfluktuasi pada saat mulai beranjak dewasa, sehingga dikhawatirkan akan memberikan respon yang berbeda dan dapat mempengaruhi hasil penelitian. Tikus normal memiliki kadar glukosa sebesar 60100 mg/dl (Safitri 2005). Tikus diadaptasi terlebih dahulu selama 7 hari, hal ini bertujuan agar tikus terbiasa dengan lingkungan penelitian dan mengembalikan kondisi hewan coba dari stres karena pemindahan dan transportasi. Selain itu pada masa adaptasi dilakukan pengamatan terhadap kondisi kesehatan tikus hingga layak digunakan untuk penelitian. Ransum yang diberikan selama masa adaptasi merupakan ransum standar. Ransum standar dan air diberikan secara ad libitum, yang berarti tikus-tikus tersebut diberi keleluasaan makan dan minum kapan saja (Safitri 2005).

Nano Partikel Chitosan Nanomaterial adalah suatu materi yang ukurannya berada pada kisaran 1100 nanometer (nm). Materi ini dapat dalam bentuk kristal yang atomatomnya tersusun secara teratur maupun dalam bentuk non-kristal (Kumar et al., 2005). Ditemukan bahwa perilaku materi yang berukuran nanometer sangat berbeda dibanding dengan perilaku pada ukuran yang lebih besar (bulk). Perbedaan yang sangat dramatis terjadi pada sifat fisika, kimia dan sifat biologinya. Perbedaan yang terjadi memberikan manfaat yang sangat besar sehingga membawa material

12

berukuran nanometer sebagai material unggul pada berbagai bidang terapan, termasuk biologi dan farmasi (Sigma-Aldrich 1999). Proses sintesa nanomaterial dapat dilakukan secara top down maupun secara bottom up (Kumar et al., 2005). Secara top down, material yang berukuran besar digiling (grinding) sampai ukurannya berorde nanometer. Alat penggiling paling popular adalah ball mill. Di samping itu dilakukan dengan cara evaporasi. Material berukuran besar dipanaskan sampai pada temperatur uapnya sehingga terevaporasi menghasilkan partikel-partikel berukuran nanometer. Nanomaterial yang dihasilkan pada kedua cara di atas distabilisasi dengan menggunakan larutan kimia seperti polyvinyl alcohol (PVA) atau polyethilene glycol (PEG) sehingga membentuk nanokoloid yang stabil. Sayangnya, cara evaporasi berbiaya tinggi karena menggunakan peralatan yang mahal. Secara bottom up sintesa nanomaterial dilakukan dengan mereaksikan berbagai larutan kimia dengan langkah-langkah tertentu yang spesifik sehingga terjadi suatu proses nukleasi yang menghasilkan nukleus-nukleus sebagai kandidat nanpartikel setelah melalui proses pertumbuhan. Laju pertumbuhan nukleus dikendalikan sehingga

menghasilkan nanopartikel dengan distribusi ukuran yang relatif homogen.

Gambar 2. Skema proses pembentukan nanomaterial secara bottom up (Kumar et al., 2005).

12

Chitosan adalah biopolimer alami hasil modifikasi dari kitin, yang merupakan struktur utama komponen dari pena cumi, dinding sel dari beberapa jamur, karapas udang dan cangkang kepiting. Kitin dan chitosan memiliki sifat spesifik yang ramah lingkungan dan mudah terdegradasi, serta memiliki afinitas tinggi dan non-toksisitas. Chitosan memiliki efek yang kuat pada pertanian, seperti bertindak sebagai sumber karbon untuk mikroba dalam tanah, mempercepat proses transformasi materi organik menjadi anorganik materi dan membantu sistem akar tanaman untuk menyerap lebih banyak unsur hara yang ada di tanah. Chitosan diserap ke akar setelah diurai oleh bakteri dalam tanah. Selain itu, efek chitosan terhadap tanaman dapat mengatur sistem kekebalan tubuh tanaman, menginduksi enzim ekskresi resisten, mengaktifkan sel-sel dan kemampuan tahan serangga (Suchada, 2008). Menurut Mohanraj (2006), kebanyakan nanopartikel dibuat dengan tiga metode, yaitu dispersi polimer, polimerisasi monomer, dan proses gelasi ionik disperse polimer merupakan teknik umum yang digunakan untuk membuat nanopartikel biodegradable dari PLA (poly lactic acid). PLG (poly D, Lglycolide), PLGA (poly-D, L-actide-co-glycolide), dan PCA (poly-cyanoacrylate). Teknik disperse polimer ini dapat digunakan dalam berbagai cara, antara lain metode evaporasi pelarut, dan metode difusi pelarut. Dalam metode evaporasi pelarut, pelarut dan obat masing-masing dilarutkan dalam pelarut organic. Campuran larutan polimer dan obat tersebut kemudian di emulsifikasi dalam larutan yang mengandung surfaktan untuk membentuk emulsi minyak dalam air (o/w). setelah emulsi yang terbentuk stabil, pelarut kemudian diuapkan. Untuk metode polimerisasi, monomer di polimerisasi untuk membentuk nanopartikel dalam larutan berair. Suspense nanopartikel selanjutnya dipisahkan dari penstabil dan surfaktan yang digunakan dengan ultrasentrifugasi dan partikel disuspensikan kembali dalam medium yang isotonis. Metode yang paling umum dalam pembuatan nanopartikel menurut Mohanraj (2006) adalah melalui proses gelasi ionic. Banyak penelitian difokuskan untuk membuat nanopartikel dari polimer yang biodegradable seperti chitosan, gelatin, dan sodium alginate. Salah satu contoh metode gelasi ionik ini adalah mencampurkan polimer chitosan dengan polianion sodium tripolifosfat yang

13

menghasilkan interaksi antara muatan positif pada gugus amino chitosan dengan muatan negative tripolifosfat. Menurut Haskell (2005), nanopartikel dapat dibuat dengan 4 metode, yaitu emulsifikasi, pemecahan, pengendapan, dan difusi emulsi. Metode emulsifikasi menggunakan bahan dasar cairan / larutan dan energy mekanik atau ultrasonic diberikan untuk mengurangi ukuran partikel (umumnya < 300nm). Metode ini memiliki keuntungan, yaitu menggunakan peralatan yang umum, sepeti homogenizer. Sedangkan kelemahan metode ini antara lain pengisian obat ke dalam nanopartikel rendah, serta memerlukan energy tinggi untuk dekomposisi kimia. Metode pemecahan menggunakan bahan dasar padatan yang dipecah dengan cara menggiling butiran-butiran padatan. Metode ini memiliki kelebihan antara lain cocok untuk senyawa yang kelarutannya rendah, sedangkan kekurangan metode ini antara lain pemecahan partikel padayan memerlukan energy dan waktu yang lebih besar daripada bahan cairan / larutan, dapat menghasilkan panas, kondisi proses berbeda-beda dari satu obat ke obat lainnya, dan ukuran partikel yang dihasilkan terbatas, yaitu lebih besar dari 100 nm. Metode pengendapan dilakukan dengan mengendalikan kelarutan bahan di dalam larutan melalui perubahan pH, suhu, atau pelarut. Endapan yang dihasilkan dari kondisi sangat jenuh memiliki banyak partikel berukuran kecil. Metode ini memiliki kelebihan antara lain dapat menghasilkan partikel lebih kecil dari 100 nm dan pemakaian energy sangat rendah. Akan tetapi, kekurangan metode ini adalah pengisian obat ke dalam nanopartikel rendah dan memerlukan penguapan banyak pelarut. Metode yang terakhir adalah difusi emulsi yang merupakan gabungan dari metode emulsifikasi dan pengendapan. Dalam metode ini, emulsi yang mengandung obat dihasilkan terlebih dahulu melalui penggunaan pelarut dengan volatilitas yang tinggi. Setelah preparasi, fase yang mengandung obat dihilangkan melalui evaporasi, yang berlanjut pada pengendapan obat dalam droplet emulsi. Tidak seperti metode pengendapan langsung dimana pembentukan partikel terjadi di seluruh larutan, dalam metode ini pengendapan terbatas pada fase yang mengandung obat sehingga droplet berperan sebagai cetakan (template) untuk pembentukan nanopartikel. Metode difusi emulsi memiliki kelebihan antara lain proses pengendapan dapat dikendalikan secara merata sehingga lebih efektif

14

menghasilkan nanopartikel, sedangkan kekurangan metode ini adalah prosesnya lebih rumut karena banyak tahapan yang dilakukan, biaya lebih besar, serta memerlukan kemampuan khusus untuk pemilihan pelarutan yang sesuai. Enkapsulasi Enkapsulasi merupakan teknik untuk menyalut suatu senyawa (dapat berupa padatan, cairan, maupun gas) dengan suatu polimer. Enkapsulasi ini merupakan cara baru yang digunakan dalam sistem pengangkutan obat dalam tubuh. Enkapsulasi senyawa obat dibentuk dalam ukuran yang sangat kecil untuk memaksimumkan khasiat obat secara lebih aman (Wukirsari 2006). Babstov et al. (2002) dalam Wukirsari (2006) menyatakan bahwa enkapsulasi dalam ukuran kecil memiliki beberapa keuntungan, antara lain melindungi suatu senyawa dari penguraian dan mengendalikan pelepasan suatu senyawa aktif. Proses enkapsulasi memungkinkan pengubahan bentuk suatu senyawa dari cair menjadi padat dan juga memisahkan senyawa-senyawa yang berbahaya jika berinteraksi satu sama lain. Senyawa aktif suatu obat yang memerlukan proses enkapsulasi adalah senyawa adalah senyawa dengan paruh waktu eleminasi yang singkat, obat yang harus diminum secara teratur (Wukirsari 2006), dan obat yang memiliki efek negatif terhadap sistem pencernaan (Wukirsari 2006).

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini akan dilaksananakan mulai bulan Februari hingga bulan Juni 2011 di Laboratorium Teknologi Hasil Perairan Institut Pertanian Bogor (IPB), Kampus IPB Dramaga, Bogor. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun wungu, akuades, etanol 30%, etanol 70%, etanol 96%, enzim -glukosidase, p-nitrofenil-D-glukopiranosa (p-NPG), larutan bufer fosfat (pH 7), serum bovine albumin, acarbose (glukobay), dimetilsulfoksida (DMSO), HCl 2N, H2SO4 2 M, dan Na2CO3.

15

Alat-alat yang dipakai adalah corong kaca, kertas saring, penangas air, neraca analitik, maserator, corong pisah, pipet mikro, pipet volumetrik, pipet tetes, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, microplate dan ELISA reader. Tahapan pengujian dan menganalisis karakteristik nano chitosan Uji stabilitas ukuran partikel dengan PSA (Partikel Size Analizer) untuk mengetahui potensial Zeta, distribusi partikel, dan diameter nano chitosan. Selanjutnya nano chitosan yang paling stabil dilakukan pengeringan dengan spray dryer dan oven. Tahap terakhir menganalisis karakterisasi nanopartikel yang dihasilkan melalui SEM untuk mengetahui karakteristik dan morfologi nanopartikel chitosan serta keadaan missel yang memiliki stabilitas yang konstan. Kemudian setiap harinya dilakukan uji stabilitas nano chitosan dengan menggunakan mikroskop. Setelah itu, dilakukan uji FTIR untuk mengetahui DD (derajat deasetilasi) nano chitosan tersebut. Proses Enkapsulasi (Sugita, dkk. 2010) Sebanyak 250 mL larutan chitosan 2.25% (b/v) dalam larutan asam asetat 1% (v/v) ditambahkan dengan 40 mL larutan karagenan 0,625% sambil diaduk. Setelah itu, sebanyak 7.50 mL tripoliposfat 4,5% (v/v) ditambahkan ke dalam larutan chitosan-karagenan sambil diaduk hingga homogen. Sebanyak 250 mL larutan metformin 1.00% (b/v) dalam air dicampurkan ke dalam larutan chitosankaragenan tersebut sehingga nisbah bobot chitosan metformin 2 : 1. Setelah itu, 5 mL Tween-80 dengan ragam konsentrasi 0.4% di dalam pelarut air ditambahkan dan campuran diaduk dengan magnetic stirrer dengan lamanya waktu pengadukan (40-60) menit. Nanopartikel dibentuk menggunakan alat pengering semprot (spray dryer). Enkapsulasi Nano khitosan-Metformin yang terbentuk lalu dibagi menjadi 3 kelompok. Pembagian kelompok ini berdasarkan pembagian konsentrasinya kemudian akan dilakukan uji kualitas nano partikel.

16

Tabel 2. Formulasi Enkapsulasi Nano Chitosan-Metformin Formulasi Larutan 1 : Chitosan 2,25% (b/v), Karagenan 0,725% (b/v) tripoliposfat 4,5% (v/v) Larutan 2 : Metformin 1.00% (b/v) dalam air

Tabel 3. Pembagian Konsentrasi Formula Nano Chitosan-Metformin


Formula A B C Konsentrasi Nano Khitosan-Metformin (b/v) 2.25 3.00 3.50

Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Nano Chitosan

Nano Chitosan (cair)

Emulsifikasi dengan penambahan Karagenan

Penambahan Metformin

Spray Dryer / Freeze Dryer

Metformin Time Release Gambar 4. Diagram Alir Pembuatan Metformin Time Release

17

DAFTAR PUSTAKA Babstov V, Shapiro Y, Kvitnitsky E,penemu; Tagra Biotechnologies Ltd. 30 Sep 2002. Method of microencapsulation. US patent 6 932 984. [BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2005. Gerakan Nasional Minum Temulawak. Jakarta : BPOM RI. Darmono. 2007. Perpustakaan Sekolah: Pendekatan Suatu Aspek Manajemen dan Tata Kerja. Jakarta : Gramedia Widiasmara Indonesia. Garret, R.H. and Grisham, C.M. 1995. Biochemistry. Saunders College Pub. Fort Wort; Nelson D.L. and Cox, M.M. 2000. Lehninger Principles of Biochemistry. 3rd ed., Worth Publisher, New York Haskell R.2005. Nanotechnology for drugs delivery. Exploratory Formulation Pfizer, Inc. Kumar, V., A.K. Abbas, N. Fausto, S.L. Robbins and R.S. Cotran. 2005. Pathologic Basic of Disease. Ed. 7. Elsevier Saunders. Philadelphia. Mathur R, Shiel WC. 2003. Diabetes Melitus. http://www.medicine.com/diabet melitus/article.htm [28 Juli 2005]. Matsumoto K et al. 2002. A novel method for the assay of -glucosidase inhibitory activity using a multi-channel oxygen sensor. J Anal Sci 18:13511359. Meiyanto, E. , dan Sugiyanto, 1997, Uji Sitotoksik Beberapa Fraksi Etanol Daun Gynurra precumbens (Lour) terhadap Larva Udang, Majalah Farmasi Indonesia, hal 8, 42-49. Mishra, M., Kumar, H., Singh, R.K., dan Tripathi, K., 2008. Diabetes and nanomaterials. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, Vol. 3 No. 3, hal. 109-113. Mohanraj VJ and Y Chen. 2006. Nanoparticles- A review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 5 (1):561-573. Muchtadi. 1989. Evaluasi Nilai Gizi Pangan. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Murfida L. 2001. Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell, V.W., 2003, Biokimia Harper, Edisi 25, Penerbit EGC, Jakarta. Ohta T et al. 2002. -Glucasidase inhibitory activity of a 70% methanol extract from ezoishige (Palvetia Bibingtoniide Tonii) and its effect on the evaluation of blood glucose level in rats. J Biosci Biotechnol Biochem 66:1552-1554.

18

Purwakusumah ED. 2003. Tumbuhan sebagai sumber biofarmaka. Di dalam Pelatihan Tanaman Obat Tradisional, 3-4 Mei 2003. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian IPB. Safitri M. 2005. Uji fitokimia dan toksisitas ekstrak air daun sirih merah sebagai penurun glukosa darah pada tikus putih hiperglikemik [laporan penelitian]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sigma, 1999, Biohemicals And Reagents For Life Science Research, 723, 1873, Sigma Aldrich co., Singapore. Suchada, P., Trankler, J., Cholada, K., dan Scholl, W. 2003. The Role of Formal and Informal Sectors in Solid Waste Management of Developing Countries. Ninth International Waste Management and Landfill Symposium. Soegondo S. 2004. Diagnosis dan Klasifikasi Diabetes Mellitus Terkini. Di dalam: Penatalaksanaan Diabetes Mellitus Terpadu. Sebagai panduan penatalaksanaan diabetes mellitus bagi dokter maupun educator. Jakarta: Pusat Diabetes dan Lipid RSUP Nasional Dr. Cipto Mangunkusumo, Fakultas Kedokteran UI. Tuyet T, Chuyen NV. 2007. Antihyperglikemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry. Biosci Biotechnol Biochem 71: 69-76. Wijayakusuma H. 2004. Atasi Diabetes Melitus dengan Tanaman Obat. Jakarta: Puspa Sehat. Winarto. 2007. Pengaruh minyak buah merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap gambaran sel pankreas dan efek hipoglikemik glibenklamid pada tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur wistar diabetik [tesis]. Yogyakarta: Sekolah Pascasarjana, Universitas Gadjah Mada. Wukirsari, T. 2006. Enkapsulasi Ibuprofen dengan Penyalut Alginat-Chitosan. Skripsi. Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. WHO. 2010. Definition, diagnosis and classification of diabetes melitus and its complications. Geneva: WHO Publishing. Zhirnov, V.V. dan Cavin, R.K., 2011. Microsystems for Bioelectronics: The Nanomorphic Cell. Elsevier Inc., Oxford, UK

20

20

LAMPIRAN

21

Lampiran 1 Diagram Alir Percobaan In Vivo Aktivitas Antidiabetes pada Enkapsulasi Nano Chitosan-Metformin.

Lampiran 2. Formulasi Enkapsulasi Nano Chitosan-Metformin Formulasi Larutan 1 : Chitosan 2,25% (b/v), Karagenan 0,725% (b/v) tripoliposfat 4,5% (v/v) Larutan 2 : Metformin 1.00% (b/v) dalam air

Lampiran 3. Pembagian Konsentrasi Formula Nano Chitosan-Metformin Formula Konsentrasi Nano Khitosan-Metformin (b/v) 2.25 3.00 3.50

A B C

22

Lampiran 3 Proses pembentukan nanopartikel chitosan-enhanced

carageenan dextran sulphate


Metformin
Carageenan / dextran Sulphate blend

Calcium carbonate Dispersing in oil emulsifying agent

Emuslifying Agent

Matrix crosslinking by acidification of calcium carbonate

Crosslinked matrix

Addition of primary and secondary coats Primary coat (Chitosan, PEG, Calcium chloride)

Secondary coat (bovine serum albumin)

23

Lampiran 3 (lanjutan)
Nanosphere

Obat Terjebak

Obat Terjerap

Nanocapsule

24

Lampiran 5. Usulan Kebutuhan Dana

Tabel 1. Biaya pengadaan bahan habis pakai Harga satuan (Rp) 800.000 6000 15.000 200.000 120.000 100.000 100.000 100.000

No 1 2 3 4 5 6 7 8

Keterangan Kitosan Metformin Tikus putih Karagenan Alloxan Asam asetat 1% Tripoliphospat 4,5% Tween 80

Jumlah 1 kg 10 strip 30 ekor 1 kg 100 gr 1 liter 100 gr 1 liter

Satuan kg strip ekor kg gr liter gr liter

Total harga (Rp) 800.000 60.000 450.000 200.000 1.200.000 100.000 100.000 100.000 3.010.000

Total biaya bahan habis pakai

Tabel 2. Biaya peralatan Harga satuan (Rp) 250.000 100.000 5.000 5.000 200.000 60.000 Total harga (Rp) 250.000 100.000 30.000 25.000 600.000 300.000 1.305.000

No 1 2 3 4 5 6

Keterangan Gelas ukur (100 ml) Gelas ukur (10 ml) Suntikan Pipa tetes Gelas spray Beaker glass

Jumlah 1 1 6 5 3 5

Satuan buah buah buah buah buah buah

Total biaya peralatan dan pengujian

25

Tabel 3. Biaya penyewaan Harga satuan (Rp) 500.000 500.000 3 3 1 3 kali kali kali kali 150.000 80.000 100.000 Total harga (Rp) 500.000 500.000 450.000 240.000 100.000

No 1 2 3 4 5 6

Keterangan Laboratorium THP Laboratorium FKH Magnetic stirrer Spray dryer Destilator Pengujian SEM

Jumlah

Satuan

600.000 1.800.000 3.590.000

Total biaya peralatan dan pengujian

Tabel 5. Biaya penunjang No 1 2 3 Keterangan Pembuatan proposal Pembuatan laporan Dokumentasi Total harga (Rp) 300.000 380.000 200.000 880.000

Total biaya penunjang

26

Tabel 6. Biaya Perjalanan No 1 2 Keterangan Pembelian Chitosan Pembelian tikus putih Pembelian tripoliphospat, asetat, metformin dan twin Pembelian alat-alat Transport pengujian SEM asam 200.000 200.000 150.000 800.000 Total harga (Rp) 100.000 150.000

3 4 5

Total biaya perjalanan

Tabel 7. Rancangan Biaya. Total Program No. 1. 2. 3. 4. 5. Sasaran Biaya Biaya pengadaan bahan habis pakai Biaya peralatan Biaya penyewaan Biaya penunjang Biaya Perjalanan Jumlah (Rp.) 3.010.000 1.305.000 3.590.000 880.000 800.000 9.585.000

Total (Rp.)

27

Lampiran 4 Jadwal kegiatan selama penelitian Kegiatan Februari 2011 1 Studi Literatur Pelatihan Pembuatan Prototype Pengujian in vivo Penyusunan Laporan Kemajuan Penelitian Skripsi 2 3 4 1 Maret 2011 2 3 4 1 April 2011 2 3 4 1 Mei 2011 2 3 4 1 Juni 2011 2 3 4