Anda di halaman 1dari 8

DETEKSI white spot sindrome virus (WSSV) DAN monodon baculo virus (MBV) PADA PASCALARVA UDANG WINDU

(Penaeus monodon) DENGAN TEHNIK DUPLEKS POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)


Deteksi White spot syndrome virus (WSSV) Dan Monodon baculovirus (MBV) Secara Simultan Pada Pascalarva Udang Windu (Penaeus monodon) Dengan Tehnik Polymerase Chain Reaction (PCR)
Rahmi, Hilal Anshary dan Gunarto Latama

ABSTRAK

Kunci keberhasilan budidaya udang adalah ketersediaan benur yang bebas virus WSSV dan MBV. Untuk mendapatkan benur yang bebas virus telah dilakukan upaya menggunakan teknik Polimerase Chain Reaction dengan pengembangan PCR dupleks. Pascalarva udang windu (P. monodon) sebanyak 120 ekor dikoleksi dari panti pembenihan di kabupaen Takalar,Barru dan Pinrang, ekstraksi DNA menggunakan Promega. Konsentrasi PCR dibuat menjadi 20 L. Kondisi PCR : 95 oC 5, diikuti 35 siklus denaturasi 95 oC 30 , annealing 60 oC 1, 72 oC 1, dan ekstensi 72 oC 5 . Running Elektroforesis,selanjutnya divisualisasi pada UV Transiluminator. Dupleks PCR dapat mendeteksi virus WSSV dan MBV dengan tingkat sensitivitas lebih tinggi. Prevalensi WSSV ditemukan tertinggi di hatchery Kabupaten Pinrang (85%) serta MBV (60%) di hatchery Kabupaten Takalar dan Backyard di kabupaten Barru, sedangkan prevalensi untuk dua infeksi virus secara bersamaan pada pasca larva yang tertinggi di Hatchery Takalar (60%). Hasil uji Chi-Square ditemukan perbedaan yang nyata dari lokasi pembenihan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa kedua virus ini masih persistance di Sulawesi Selatan. Kata Kunci : Pasca Larva Udang Windu, WSSV,MBV, Dupleks PCR
ABSTRACT

The key to success is the availability of shrimp seeds are free of viruses WSSV and MBV. To obtain virus-free fry attempts have been made using polymerase chain reaction technique with the development of a duplex PCR. Pascalarva tiger shrimp (P. monodon) and more than 120 tails were collected from hatcheries in the nursing kabupaen Takalar, Barru and Pinrang, using a Promega DNA extraction. The concentration of PCR was made to 20 mL. PCR conditions: 95 C 5 ', followed by 35 cycles of

denaturation 95 C 30 ", annealing 60 C 1', 72 C 1 ', and extension 72 C 5'. Running electrophoresis, then visualized on a UV. Transiluminator. Duplex PCR can detect viruses WSSV and MBV with higher levels of sensitivity. The highest prevalence of WSSV was found in Pinrang hatcheries (85%) and MBV (60%) in the hatchery and the District Takalar in Backyard Barru, while the prevalence of viral infection during two concurrent post-larvae at the highest in Takalar Hatchery (60%). ChiSquare test results found a significant difference from the hatchery site. This indicates that both the virus is still persistence in South Sulawesi.

Key words : Post-larval shrimp, WSSV, MBV, Duplex PCR

METODE PENELITIAN Benur pasca larva dikumpulkan dari Hatchery dan Backyard di

panti-panti pembenihan di Sulawesi Selatan, selanjutnya setiap individu diekstraksi DNA nya dengan menggunakan Wizard DNA purification Kit (Pro-mega). PL udang dibersihkan beberapa kali dengan menggunakan larutan fisiologis 0,85%, kemudian diambil lagi secara acak 20 ekor dan memasukkan ke tabung eppendorf 1.5 mL untuk digerus setiap ekornya. Semua dikerjakan dalam keadaan dingin on ice. Hasil gerusan

ditambahkan lysis buffer sebanyak 600L ( 500L buffer yang ditambahkan 120L 0,5M EDTA) yang didinginkan pada es. Kemudian ditambahkan 12,5 L dari 20 mg/mL proteinase K, lalu diinkubasi semalam pada water bath shaker suhu 55oC.Menambahkan 3 L RNase pada lysate lalu campur dengan membolak balik tabung 2 - 5 kali. Inkubasi suhu 37 oC selama 15 - 30 menit. Biarkan sampel dingin pada suhu ruang selama 5 menit. Menambahkan 200 L larutan protein precipitation dan vortex keras pada kecepatan tinggi selama 20 detik. Dinginkan sampel pada es selama 5 menit. Sentrifuse selama 4 menit pada 14000 rpm. Protein yang mengendap akan membentuk pellet putih yang keras. Memindahkan supernatan yang mengandung DNA pada tabung eppendorf 1.5 mL yang mengandung 600 L isoprophanol pada suhu ruang. mencampur secara perlahan larutan sampai tampak adanya

warna putih seperti benang. Sentrifuse selama 1 menit 14000 rpm pada suhu ruang. DNA akan tampak seperti pellet putih yang mengendap. Buang supernatan dengan hati-hati. Tambahkan 600 L ethanol 70% suhu ruang dan bolak balik tabung beberapa kali secara perlahan untuk mencuci DNA. Sentrifus pada 14000 rpm 1 menit. Buang ethanol dengan pipet sequensing atau pipet Pasteur. Tabung disimpan pada kondisi terbalik di atas kertas pengisap, untuk mengisap sisa-sisa cairan yang masih ada pada tabung. Biarkan sampai kering selama 20 oC sebelum diproses lebih lanjut PCR dilakukan untuk mendeteksi keberadaan virus WSSV dan MBV secara simultan dengan menggunakan teknik duplex PCR menggunakan metode yang telah dikembangkan oleh Natividad et al., (2006) dengan tetap melakukan optimasi sesuai dengan kondisi. Optimasi dilakukan terhadap suhu annealing, konsentrasi MgCl2, dan konsentrasi templat DNA sampel. Primer yang akan digunakan adalah sebagai berikut: WSSV-F 5-GAA ACT ATT GAA AAG GCT TTC CCT C-3 WSSV-R 5-GTT CCT TAT TTA CTA CTA CGG CAA-3 MBV-F 5-TCC AAT CGC GTC TGC GAT ACT-3 MBV-R 5-CGC TAA TGG GGC ACA AGT CTC-3 Konsentrasi PCR yang diperlukan adalah 1 x buffer PCR yang mengandung MgCl2, 250 uM dNTPmix, 1.25 U ex Taq Polymerase, masing-masing 0,5 uM primer F dan R, dan 1 L template DNA. Reaksi PCR dilakukan pada tabung 0.2 mL dengan konsentrasi total dibuat menjadi 20 L dengan menambahkan distilled water. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: denaturasi awal 95 oC selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi 95 oC 30 detik, annealing 60 oC selama 1 menit, 72 oC 1 menit, dan ekstensi 72 oC 5 menit. 10 - 15 menit.

Tambahkan 100 L larutan DNA rehydrasi. Simpan DNA pada freezer

1. Proses Elektroforesis Persiapan gel agarose. Agarose ditimbang sesuai dengan

keperluan, kemudian dilarutkan dalam larutan 1 x TBE. Dalam penelitian ini konsentrasi agarose yang digunakan adalah 1,5%. Dengan

menggunakan pemanas (hotplate), agarose dilarutkan sampai mendidih dan setelah mendidih dibiarkan selama kurang lebih 20 menit sampai suhunya sekitar 50oC, kemudian dicetak dalam tray agarose yang telah dilengkapi dengan sisir untuk membentuk sumur-sumur gel. Setelah agarose dingin, dengan sangat hati-hati sisir tray diangkat kemudian gel dimasukkan kedalam elektroforesis apparatus yang telah diisi dengan 1 x TBE sebagai buffer elektroforesis. Running elektroforesis. Untuk mengetahui apakah suatu sampel terinfeksi dengan WSSV atau MBV, maka hasil PCR sebanyak 5 L dalam 2L loading dye di-running dalam gel elektroforesis mini bersama-sama dengan DNA marker 100bp. Setelah semua hasil PCR diinjeksikan kedalam sumur-sumur gel elektroforesis, selanjutnya elektroforesis dijalankan dengan kondisi 100 volt, selama 45 menit. 2. Visualisasi DNA Pewarnaan dan Dokumentasi. Gel hasil elektroforesis di rendam dalam larutan ethidium bromida (konsentrasi 1 mg/mL) selama 10 15 menit. Selanjutnya gel dicuci dengan akuadest selama 5 10 menit. Untuk mengetahui ada tidaknya infeksi WSSV dan MBV terhadap sampelsampel yang dideteksi maka gel hasil elektroforesis diamati menggunakan uv transilluminator yang sekaligus dilakukan pengambilan foto. Sampel terinfeksi oleh WSSV jika pada lajur DNA genom muncul pita DNA pada 211 bp dan MBV pada lajur DNA 316 bp (Natividad et al., 2006). Jika pewarnaan kurang sempurna, seperti terdapat pita-pita DNA tapi terlihat masih buram, maka perendaman dalam ethidium bromida dan pencucian dengan akuadest diulangi.

3. Sensitivitas Dupleks PCR M 10 1 102 103 10 4 10 5 10 6

361 bp 211 bp

Gambar 1.

Sensitivitas Dupleks PCR menggunakan Konsentrasi DNA yang Berbeda 1, terlihat bahwa konsentrasi template DNA yang

Dari Gambar

digunakan berdasarkan pengenceran template DNA yang terinfeksi WSSV dan MBV, konsentrasi DNA dari kedua jenis virus itu masih terdeteksi pada pengenceran 103. Hal ini menunjukkan bahwa sensitivitas Dupleks PCR dapat berguna dalam konfirmasi tahap awal dari infeksi WSSV dan MBV. Sesuai dengan Natividad, et al.,(2006) bahwa ketika konsentrasi virus relatif rendah atau sebelum manifestasi WSSV dan MBV pada tahap awal infeksi dapat dideteksi dengan Dupleks PCR.

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Dupleks PCR WSSV dan MBV

PCR ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan virus WSSV dan MBV secara simultan dengan menggunakan teknik duplex PCR menggunakan metode yang telah dikembangkan oleh Natividad et al., (2006). White Spot Syndrome Virus (WSSV) dan Monodon Baculovirus

(MBV) yang menginfeksi pasca larva udang windu (P. monodon) diidentifikasi dengan mengambil per individu hewan uji yang kemudian dilakukan ekstraksi DNA. Dari hasil pemeriksaan menggunakan metode dupleks PCR menunjukkan hasil yang positif (Gambar1) pada visualisasi DNA hasil elektroforesis. M 1 2 3 4 5 6 7

361 bp 211 bp

Gambar 2. Dupleks PCR pada Udang Windu (P. monodon) yang Positif Terinfeksi WSSV dan MBV Berdasarkan hasil visualisasi DNA diatas, terlihat bahwa pasca larva udang windu terinfeksi oleh WSSV dan MBV. Hal ini dapat dilihat dengan munculnya pita-pita DNA pada sampel 1,2,3,4 dan 6 yang

terinfeksi MBV berada pada 316 bp dan sampel 5 dan 7 yang terinfeksi WSSV dan MBV berada pada 211 bp dan 316 bp. Hal ini sesuai dengan pendapat Natividad et al., 2006 bahwa sampel terinfeksi oleh WSSV jika pada lajur DNA genom muncul pita DNA pada 211 bp dan MBV pada lajur DNA 316 bp. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan penelitian ini adalah pascalarva yang berasal dari panti pembenihan di Takalar, Barru dan Pinrang masih tergolong fluktuatif

dengan tingkat infeksi oleh WSSV masih tinggi. Dupleks PCR dapat

mendeteksi virus WSSV dan MBV dengan tingkat sensitivitas yang lebih tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa kedua jenis virus ini masih persistance di panti-panti pembenihan di Sulawesi Selatan. Perlu mempelajari lebih detail tentang epidemiologi virus MBV dan WSSV dan virus lainnya seperti HPV, IHHNV pada larva udang windu dengan teknik deteksi multipleks PCR.

DAFTAR PUSTAKA Atmomarsono, M., M.I. Madeali dan Nurhidayah. 2001. Tiger prawn

diseases in the acid sulphate soil affected ponds of South Sulawesi. Makalah disampaikan pada Remediation and management of degraded Earthen shrimp ponds Seminar and Progress Report. Balai Penelitian Perikanan Pantai bekerjasama dengan ACIAR. Maros. Chayaburakul,K., G. Nash, P. Pratanpipat, S. Sriurairatana, and B. Withyachumnarnkul. 2004.Multiple pathogens faound in growthretarted black tiger shrimp Pennaeus monodon cultivated in Thailand. Dis Aqua Org., 60: 89-96. Hsu YL, KH. Wang, Yang, CM. Tung,CH.Hu, CF. Lo, CH. Wang, and T. Hsu. 2000. Diagnosis of Pennaeus monodon-type baculovirus by PCR and by ELISA of occlusion body. Dist Aquat Org 40:93-99. Lightner DV. 2009. The Penaeid Shrimp Viral Pandemics due to IHHNV, WSSV, TSV and YHV: History in the Americas and Current Status Muliani, B.R. Tampangallo dan M. Atmomarsono. 2007. Penyebaran dan Prevalensi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada Budidaya Udang Windu (Penaeus monodon). Jurnal Riset Akuakulture Vol 2(2): 231- 241. Natividad, K. D. T., Maria Veron P. Migo, Juan D. Albaladejo, Jose Paolo V. Magbanua., Nakao Nomura., Masatoshi Matsumura. 2006. Simultaneous PCR detection of two shrimp viruses (WSSV and

MBV) in postlarvae of Penaeus monodon in the Philippines. Aquaculture 257, 142149. Uma, A., A. Koteeswaran. I. Karunasagar and I. Karunasagar. 2005. Prevalence of white spot syndrome virus and monodon baculovirus in Pennaeus monodon broodstock and postlarvae from hatcheries in southeast coast of India. Current Science, 89:1619-1622.