Mesures exprimentales de lactivit enzymatique

Enzymologie-6

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Essai direct : - mesure directe de [A] ou [P] en fonction de temps

substrat ferrocytochrome c Fe2+ enzyme Cytochrome c oxidase produit ferricytochrome c Fe3+

Cytochrome c :

Fig. 6-1

Essai indirect :

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DHODase

2 e- + 2 H+

Ubiquinone

Ubiquinol

Ubiquinone

DCPIP (ox)
610 nm

DCPIP (red)
Fig. 6-2

Essai coupl : couplage de 2 ractions enzymatiques

E1

P1

E2

P2

Raction enzymatique tudier

Raction facile tudier

Fig. 6-3

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glucose-6phosphate *

glucose-6phosphate dehydrogenase E1 NADP+

6-phospho gluconolactone

NADPH 340 nm
Fig. 6-4

Remarques : i) pour pouvoir tudier la vitesse v1

v1

v2

Fig. 6-5

Mesure de la vitesse initiale

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Fig. 6-6

ii)

Fig. 6-7

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Techniques pour initier la raction i)

Fig. 6-8

"rapid mixing" techniques

Fig. 6-9

techniques de relaxation Pertubation : o flash actinique actinique

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Idt dt Dtecteur t
Fig. 6-10

A E

A E

photo-libration (UV)
Fig. 6-11

ii)

Techniques de separation Ex. Stop : HPLC (dure 20-30 min) infos sur les concentrations

3 min
Fig. 6-12

Mthodes de dtection i) spectroscopie optique

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absorption (spectrophotomtre dabsorption) :

A @ log

I0

g I f f f f f f
Fig. 6-12

Fig. 6-13

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1)

Fig. 6-14

2)

Fig. 6-15

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fluorescence (spectrophotomtre de fluorescence)

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Fig. 6-16

utilisation des radioisotopes

Fig. 6-17

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10

CPM = counts per minute

Fig. 6-18

Mthodes polarographiques

2 H 2 O Q O 2 4 e@

Fig. 6-19

Anode (+) Ag :

4 Ag + 4 Cl2H+ + 2 e- + O2

4 AgCl + 4 e H2O2

Cathode (-) Pt :

H2O2 + 2 e- + 2 H+ 2H2O 4 Ag + 4 Cl- + 4 H+ + O2 4 AgCl + 2 H2O

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11

Fig. 6-20

Spectro- lectrochimie :

Electrochemically-induced FTIR difference spectroscopy

Fig. 6-21