LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

ANDRY NDULA RIMU 1209017043

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS NUSA CENDANA KUPANG 2013

BAB I PENDAHULUAN
1.1 DASAR TEORI ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label). Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigenenzim atau konjugat antibodienzim, dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA. Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi: 1. Well dilapisi atau ditempeli antigen. 2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan. 3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya. 4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi. 5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-

negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian juga sebaliknya. Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain. Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel,l. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA) Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di

antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif. Aplikasi ELISA ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat. Beberapa Tipe ELISA A. Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. 5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. 8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini. B. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: 1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap

2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate 4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat 5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen 6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer 7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang 8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia 9. Diukur absorbansinya untuk menentukan kehadiran dan kuantitas dari antigen Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

C. ELISA kompetitif Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu: 1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya 2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen 3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi 4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik untuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim 5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi. Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

REAGEN UNTUK ELISA : 1. Coating Buffer pH 9,6 (Carbonate-bicrbonate buffer) Sodium carbonate Sodium bicarbonate 1.59 g 2.93 g

Tambahkan aquades hingga 1 liter. Buatlah pH 9,6 dengan penambahan HCL atau NaOH. 2. Washing Buffer (PBS-Tween 0,05%) Sodium chloride Potassium chloride Potassium phosphate (KH2PO4) Sodium phosphate Tween 20 Aquades 3. Larutan Substrat ABTS Stok ABTS 52mM ABTS (sigma) 0,286 g ( Na2HPO4) 8.0 g 0,2 g 0,2 g 1.15 g 0,5 g 1000 ml.

Aquades Simpan pada suhu 40 di tempat gelap. Citrate buffer pH 4,2 Larutan A Sodium phosphate (Na2HPO4) Aquades Larutan B Citric acid Aquades Campurkan 50 ml larutan A dengan 55 ml larutan B Substrat siap pakai Stok ABTS Citrate buffer H2O2 (33%)

10 ml

14,2 g 500 ml 10.5 g 500 ml

200 l 10 ml 3 l

4. Pelarut serum dan konjugat (TEN-Tween Casein 0,2%) Tris base EDTA Nacl Casein Tween 20 6.055 g 0.370 g 8.77 g 2g 0.5 ml

DIAGNOSA ELISA HOG CHOLERA DENGAN METODE C-ELISA Hog cholera disebut juga Classical Swine Fever atau penyaki sampar babi merupakan penyakit menular septikaemia pada babi disebabkan oleh Pestivirus dari keluarga flaviviridae, adalah satu grup dengan virus bovine viral diarrhea (BD) pada sapid an virus Border Disease pada domba. Penyakit ini termasuk dalam daftar Badan Kesehatan Hewan Dunia ( Office International des Epizooties) karena tingkat kematian tinggi, penyebarannya cepat dan luas melintasi batas antar Negara dan berpengaruh terhadap perdagangan dunia terutama ternak babi dan produknya. Babi yang terular hog cholera memiliki gejala klinik dan perubahan patologik bervariasi, oleh karena itu diperlukan diagnose secara laboratorium. Pemeriksaan laboratorium dilakukan melalui isolasi agen penyebab secara in vitro pada biakan sel atau uji biologic pada hewan percobaan (Koch Pustulate) dan selanjutnya identifikasi dengan uji serologic. Uji serologic dapat juga mendeteksi antibody post vaksinasi dan pasca infeksi. Prinsip metoda ELISA Kit ini didesain untuk mendeteksi antibody spesifik Hog Cholera. Uji ini menggunakan mikroplate yang telah di coating antigen CSFV. Adanya antibody pada serum sample akan menghambat ikatan conjugate CSFV. Ikatan antibody monoclonal terdeteksi oleh penambahan substrat. Hasil dari uji ini terindikasi melalui warna yang muncul. Jika terdapat antibody dalam serum sample maka tidak muncul/lemah. Jika berwarna maka tidak ada antibody CSFV dalam serum sample (hasil negative).

BAB II METODE PRAKTIKUM

2.1 ALAT DAN BAHAN Alat-alat yang dibutuhkan :

Mikropipet multichannel 10-100ul Finntip 100 l, 1000 l Cup washer Gelas ukur Tabung ukur ELISA Reader Komputer dan Printer Printer ELISA :

Bahan-bahan yang dibutuhkan

ELISA Kit Hog Cholera yang terdiri dari larutan pengencer Larutan pencuci Larutan substrat TMB Larutan stop Control serum positif Control serum negatif Larutan conjugat (HRPO anti CSFV konjugat) Antigen Aquades

2.2 WAKTU PRAKTIKUM Hari / tanggal : Senin, 16 Desember 2013 Waktu 2.3 TEMPAT PRAKTIKUM : Pkl 10.00-15.00

Laboratorium UPT Veteriner 2.4 PROSEDUR KERJA a) Menyiapkan sampel serum. Serum yang ditampung dalam volume kecil pada tabung mikro eppendorf atau Nunc (1,5 ml) dan beku dekeluarkan dari freezer. Biarkan serum mencair. b) Pada mikrotiter plat yang sudah dilapis antigen (CSFV E2) diteteskan 50 l larutan pengencer sampel, setelah itu ditambahkan 50 l sampel serum (1:2) pada pada semua lubang plat mikro kecuali lubang G11-12 ditambahkan 50 l kontrol serum positif dan lubang H11-12 ditambahkan 50 l kontrol serum negatif (1:2) c) Plat ditutup dengan penutup plat dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. d) Plat dicuci sebanyak tiga kali dengan larutan pencuci buffer (300 l tiap lubang) dan sisa buffer dibuang bersih. e) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 l konjugat dan plat diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 30 menit. f) Plat dicuci tiga kali dengan larutan pencuci dengan menambahkan masing-masing lubang plat 300 ul. g) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 l larutan substrat TMB. h) Plat diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit setelah itu reaksi distop dengan menambahkan 50 ul larutan penyetop. i) Reaksi dibaca pada Elisa reader menggunakan filter 450 nm.

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 HASIL

29/BB/ST 28/BB/ST 30/BB/ST 38/BB/ST 33/BB/ST 37/BB/ST 41/BB/ST 17/BB/ST 98,91068 99,92738 99,78214 99,34614 95,86057 + + + -10,8932 + -16,703 + -18,1554 +

3.2

PEMBAHASAN

ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-6 dalam serum pasien. Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode ini menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi dengan substrat TMB. Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi enzimatis yang sehingga intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga lebih mudah. Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan logaritma. Pertama, absorbansi IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Kemudian dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari standart,lalu dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25.

BAB IV PENUTUP

KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: Jumlah anti bodi dan antigen lebih banyak dalam spesimen Hog Cholera tinggi sehingga konjugat ikatannya lebih sedikit. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa spesimen tersebut positif (+) anti bodi Hog Cholera, warnanya bening . Semakin sedikit anti bodi, maka semakin banyak ikatan konjugat dengan anti gen yang terbentuk sehingga warnanya kuning yang berarti negatif (-)

DAFTAR PUSTAKA
http://id.wikipedia.org/wiki/ELISA http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011/02/uji-elisa.html http://iasius.blogspot.com/2012/12/elisa.html