EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN SENYAWA ANTIOKSIDAN DARI LINTAH

LAUT (Discodoris sp.) ASAL PERAIRAN PAMEKASAN

Hafiluddin
Program Studi Ilmu Kelautan Universitas Trunojoyo Madura
email:abi_hafi@yahoo.com
ABSTRACT
Sea slug, Discodoris sp., is an important organism for Pamekasan people, as it is
used for nutraceutical and functional food. However there is lack comprehensive
scientific study regarding the efficacy of Discodoris sp. in improving people health. The
purpose of this study is to determine antioxidant activity from sea slug, and determine
the bioactive compounds of sea slug. The experiment was conducted with several
stages: sample preparation, extraction bioactive compound, fractionation by TLC and
identification of compounds by GC-MS. Discodoris sp. has a potential as nutraceutical
and functional food as it contained high protein. Fatty acid content of Discodoris sp.
was dominated by unsaturated fatty acids with linolenic acid (C18:3, n-3) as the highest
component. Body of Discodoris sp. contained high level of alkaloid, steroid and
phenolic compound. The bioactive compounds in the meat of sea slug with ethanol
solvent was galoxolide, dibuthyl phthalate, di-n-octhyl phthalate, oleic acid amide,
erucylamide, squalene and has an IC
50
best antioxidant activity in fraction 5 at 150.92
ppm.
Key words: antioksidan, extraction, purification, sea slug (Discodoris sp.)
PENDAHULUAN
Kondisi dunia yang semakin maju dengan berbagai teknologi telah mendorong
penghuninya menjadi manusia modern. Pola hidup manusia yang modern memiliki
kesadaran yang rendah terhadap pemeliharaan kesehatan dan lingkungannya.
Pencemaran udara di kota-kota besar Indonesia saat ini telah melebihi standar yang
ditetapkan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), yaitu 50 mikrogram per meter kubik
(g/m
3
) (PDPERSI 2009). Pencemaran udara yang telah melebihi standar WHO sangat
rawan dalam menimbulkan berbagai gangguan pada kesehatan.
Radikal bebas adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron
tidak berpasangan di kulit terluar sehingga sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan
protein, lipid, atau DNA. Reaksi antara radikal bebas dan molekul tersebut dapat
berujung pada timbulnya suatu penyakit.Radikal bebas pada awalnya diperlukan untuk
membunuh mikroorganisme penyebab infeksi dalam tubuh makhluk hidup. Paparan
radikal bebas yang berlebihan dan secara terus-menerus dapat menyebabkan kerusakan
sel, mengurangi kemampuan sel untuk beradaptasi terhadap lingkungannya, dan pada
akhirnya dapat menyebabkan kematian sel yang memicu terjadinya berbagai jenis
penyakit degeneratif seperti jantung koroner, tekanan darah tinggi, aterosklerosis,
kencing manis dan kanker (PDPERSI 2009). Reaktivitas radikal bebas ini dapat
diredam oleh senyawa antioksidan.
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul
lain. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektronnya kepada
radikal bebas sehingga dapat menghentikan kerusakan yang disebabkan oleh radikal
bebas. Di dalam tubuh terdapat mekanisme antioksidan atau antiradikal bebas secara
endogenik. Tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka dibutuhkan
antioksidan yang berasal dari luar tubuh (eksogenik) (Pratiwi et al., 2006).
Lintah laut merupakan anggota kelompok filum mollusca yang tidak memiliki
cangkang. Fungsi dari cangkang digantikan oleh sistem perlindungan kimia berupa
senyawa aktif dalam tubuhnya. Senyawa aktif ini digunakan lintah laut untuk
melindungi diri dari serangan predator maupun gangguan di lingkungannya.Lintah laut
banyak ditemukan di daerah pasang surut dengan pantai berlumpur dan tergolong
organisme epibentik (Hutomo dan Musa 2005). Lintah laut memiliki senyawa metabolit
sekunder yang digunakan sebagai pertahanan diri dari serangan predator (Miyamoto
2006). Lintah laut sudah sejak lama digunakan sebagai obat kuat dan obat penyakit
asma bagi masyarakat pesisir (Hafiluddinet al. 2011). Hasil penelitian menyebutkan
bahwa lintah laut merupakan sumber protein, lemak dan mineral. Banyak mengandung
asam lemak tidak jenuhyaitu 5,57% (Hafiluddin et al., 2011).
Lintah laut berpotensi sebagai antioksidan alami. Hasil penelitian Nurjanah et al.
(2010) menyebutkan bahwa hasil uji fitokimia dari ekstrak metanol lintah laut diperoleh
kelompok alkaloid, steroid, asam amino, saponin dan fenol berperan sebagai
antioksidan dengan rendemen yang terbesar, yaitu 5,12% serta aktivitas antioksidan
89,44% dibandingkan dengan pelarut yang lain.Lintah laut jenis Discodoris sp. telah
dimanfaatkan sebagai formulasi minuman fungsional dan mempunyai aktivitas
antioksidan (Naiu 2010). Hasil penelitian Hafiluddin et al. (2011) menyebutkan bahwa
rendemen terbesar ekstrak kasar lintah laut diperoleh dari ekstrak etanol dengan
kandungan kimia alkaloid,steroid, fenol, karbohidrat dan gula pereduksi. Ekstrak etanol
daging memiliki IC
50
antioksidan terbaik yaitu 441,12 ppm.
Aktivitas antioksidan pada lintah laut masih tergolong lemah dikarenakan
aktivitas tersebut masih diukur pada ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar tersebut
dimungkinkan masih tercampur dengan senyawa-senyawa lain sebagai pengotor dan
melemahkan aktivitas antioksidan di dalamnya.Penelitian tentang pemurnian senyawa
antioksidan sangat diperlukan untuk mendapatkan senyawa antioksidan yang lebih
murni dengan tingkat aktivitas yang lebih kuat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengekstraksi dan memurnikan senyawa antioksidan dalam lintah laut yang berasal dari
perairan Pamekasan.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa lintah laut. Bahan ekstraksi:
kloroform, etil asetat dan etanol. Bahan untuk analisis proksimat, asam amino, asam
lemak, mineral dan logam berat. Bahan untuk uji antioksidan: DPPH (1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil) dan BHT (Butylated Hydroxytoluena). Alat yang digunakan pada
penelitian ini adalah alat tulis, alat-alat gelas, alat ekstraksi dan uji kimia antara lain:
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
rotari evaporator Buchi Rotavapor R-205, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800,
AAS Shimazu-7000, HPLC Varian 940-LC.
Preparasi Sampel
Penelitian dilakukan dari pengambilan dan preparasi sampel. Lintah laut
diambil dari pantai di daerah Pamekasan Madura. Setelah bersih lintah laut dikeluarkan
isi perutnya dengan cara membelahnya secara melintang dari oral menuju aboral.
dikeringkan sekitar 3-4 hari dengan sinar matahari dan dihaluskan dengan mortal atau
blender.
Ekstraksi Lintah Laut
Ekstraksi dilakukan dengan metode ekstraksi bertingkat, menggunakan
perbedaan kepolaran pelarut yang mengacu pada metode Sherif et al. (2008). Sebanyak
50 gram bubuk lintah laut dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer dan ditambahkan
dengan 100 ml pelarut kloroform. Campuran dikocok dengan shaker dan dibiarkan
hingga terjadi pemisahan, fraksi terlarut dalam kloroform dipisahkan dan dimasukkan
ke dalam labu. Ekstraksi menggunakan pelarut kloroform ini dilakukan sampai larutan
berwarna jernih. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran rendah.
Kemudian dilanjutkan dengan pelarut yang lain yaitu etil asetat dan etanol. Larutan
hasil ekstraksi bertingkat dikeringkan dengan evaporator pada suhu kamar 40
0
C.
Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan freezdryer. Analisis yang
dilakukan pada ekstrak kasar yaitu uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI, 1995) dan
aktivitas antioksidan (Blois, 1958 dalam Hanani et al., 2005).
Fraksinasi Lanjutan
Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik kemudian dipisahkan dengan
kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254.
Pelaksanaan kromatografi preparatif dilakukan dengan mencari pelarut terbaik terlebih
dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Eluen yang digunakan yaitu heksan,
kloroform, etil asetat, metanol dan etanol. Pencarian eluen terbaik dimulai dengan
menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen campuran atau perbandingan.
Sebanyak 5 ml eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup, kemudian dibiarkan
beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar yang terpilih dilarutkan
dalam pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian bawah yang ditandai pada plat
kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler dan dikeringkan beberapa
menit. Kemudian dimasukkan ke dalam chamber dengan posisi agak tegak, sampel
yang ditotolkan berada pada bagian bawah dan diusahakan tidak terendam oleh eluen.
Kemudian chamber ditutup dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas.
Plat kromatografi lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya plat dilihat
hasilnya dengan menggunakan sinar UV 254 nm.
Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi preparatif.
Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan ukuran yang lebih
besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60 F 254 yang dipasang
pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik yang diperoleh disiapkan
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
sebanyak 20 ml dan dimasukkan ke dalam chamber. Larutan sampel ditotolkan pada
plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber, setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV
254 nm, kemudian setiap fraksi atau masing-masing Rf (Retardation factor) yang
dihasilkan dikerok dan dikumpulkan. Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang
sama dengan sampel terpilih. Pada fraksi atau Rf yang diperoleh dicek dengan
kromatografi lapis tipis (KLT). Jika pada lempeng KLT masing-masing fraksi hanya
terdapat 1 bercak, maka dimungkinkan pemisahan sudah hampir sempurna dan
diharapkan diperoleh senyawa tunggal.
Analisis yang dilakukan pada masing-masing fraksi (Rf) yang diperoleh yaitu
analisis antioksidan dengan metode DPPH menurut Blois (1958 dalam Hanani et al.,
2005).
Identifikasi Senyawa Aktif
Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan dengan
melihat komponen senyawa yang terdapat di dalamnya yaitu menggunakan GC-MS.
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul
dan pola fragmentasi dari senyawa murni tersebut.
Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu memilih
senyawa yang memiliki puncak tinggi dan dicocokkan dengan senyawa yang ada pada
library GC-MS dengan kemiripan >90%.
Analisis Aktivitas Antioksidan (DPPH)
Aktivitas antioksidan diukur dengan menggunakan metode DPPH (Blois 1958
dalam Hanani et al., 2005). Ekstrak lintah laut dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil
pemurnian dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm.
Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat
dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi yang sama dengan
sampel. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH
dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM.
Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 ml dan direaksikan
dengan 500 l larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi
label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit dan
diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VISpada panjang
gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan
perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml pelarut
metanol dengan 500 l larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Nilai persentase
aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus:
% % 100 x
blanko Absorbansi
sampel Absorbansi - blanko Absorbansi
Inhibisi

Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
487,23
1269,68
3463,55
2526,11
441,12
832,42
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Klorofom
daging
Klorofom
jeroan
Etil asetat
daging
Etil asetat
jeroan
Etanol
daging
Etanol
jeroan
I
C
5
0

(
p
p
m
)

Perlakuan
HASIL DAN PEMBAHASAN
RendemenEkstrak Kasar Lintah Laut
Hasil analisis rendemen dari sampel daging dan jeroan lintah laut dengan
perbedaan pelarut disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1.Rendemen ekstrak lintah laut
Keterangan
Berat ekstrak
Kloroform Etil asetat Etanol
Daging lintah laut
4,53% 1,14% 5,08%
Jeroan lintah laut
3,09% 0,86% 6,97%
Tabel 1 menunjukkan bahwa ekstrak etanol memiliki rendemen yang tertinggi
yaitu 5,08% (daging) dan 6,97% (jeroan). Tingginya rendemen pada bagian jeroan
disebabkan oleh perbedaan ukuran partikel dan kemudahan sel untuk pecah dimana
pada bagian jeroan lintah memiliki sifat mudah dihancurkan dibandingkan pada bagian
daging lintah laut.
Aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut
Keberadaan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui melalui uji
aktivitas antioksidan. Pengujian aktivitas antioksidan dalam lintah laut dilakukan
dengan metode DPPH. Hasil analisis IC
50
aktivitas antioksidan lintah laut (Discodoris
sp.) dapat dilihat pada Gambar 1.











Gambar 1.Hasil analisis IC
50
aktivitas antioksidan lintah laut (Discodoris sp.)

Nilai rata-rata antioksidan lintah laut terbesar didapat pada ekstrak kasar daging
lintah laut dengan pelarut etanol dengan IC
50
sebesar 441,12 ppm. Perbedaan nilai IC
50

antioksidan lintah laut ini disebabkan perbedaan pelarut yang digunakan.

Hasil fraksinasi dengan KLT
Eluen terbaik yang diperoleh yaitu etil asetat:metano:air (30:6:5) sesuai dengan
yang dilakukan oleh Sherif et al. (2008). Fraksinasi menggunakan KLT dan
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
271,34
243,73
211,77
168,32
150,92
172,21
0
50
100
150
200
250
300
F1 F2 F3 F4 F5 F6
I
C
5
0

(
p
p
m
)

Fraksi
pengamatan dengan sinar UV 254 nm menghasilkan 6 fraksi yang disajikan pada
Gambar 2.










Gambar 2. Hasil fraksinasi dengan KLT; (a) kromatografi KLT preparatif, (b) hasil
pengecekan dengan kromatografi lapis tipis
Aktivitas antioksidan hasil fraksinasi
Hasil fraksinasi dengan kromatgrafi lapis tipis preparatif diukur aktivitas
antioksidannya dan disajikan pada Gambar 4.








Gambar 4. Hasil analisis IC
50
aktivitas antioksidan pada masing-masing fraksi

Gambar 4 memperlihatkan bahwa nilai rata-rata aktivitas antioksidan masing-
masing fraksi tertinggi diperoleh pada fraksi 5 dengan IC
50
sebesar 150,92 ppm.
Adanya perbedan nilai aktivitas antioksidan ini disebabkan oleh perbedaan dan jumlah
senyawa murni yang terdapat dalam masing-masing fraksi.

Identifikasi senyawa hasil fraksinasi
Identifikasi senyawa kimia yang terdapat pada fraksi dengan aktivitas
antioksidan terbaik yaitu fraksi 5 dengan IC
50
sebesar 150,92 ppm dilakukan
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
menggunakan GC-MS. Hasil identifikasi senyawa pada lintah laut dengan GC-MS
dapat dilihat pada Gambar 5 dan Tabel2.











Gambar 5. Kromatogram Senyawa Pada Fraksi 5 (F5) Lintah Laut Dengan GC-
MS

Tabel 2. Pengelompokan senyawa pada fraksi 5 lintah laut dari hasil GC-MS
No Run time Nama senyawa Kemiripan (%) Kelimpahan (%) Rumus bangun
1 11,419 Galoksolida 93 0,42




2 12,141 Dibutil ftalat 95 4,29




3 14,902 Oleilamida 97 1,53




4 15,896 Dioktil ftalat 96 6,19




5 17,850 Erusilamid 95 55,26




6 18,240 Skualen 93 4,81





Hasil penelitian Costantino et al., (1999) menunjukkan bahwa galoksolid
memiliki sifat inhibitor yang lebih selektif dibandingkan dengan quersetin dan sorbinil
yang juga memiliki sifat antioksidan.Benzopiran telah digunakan sebagai antioksidan
pada mitokodria dan efektif meningkatkan fungsi vitamin E dalam mitokondria serta
melindungi dari kerusakan oksidatif (Smith et al., 1999). Hasil penelitian menyebutkan
bahwa dibutil ftalat dapat memberikan efek pencegahan terhadap stres oksidatif pada
embrio tikus (Kim et al. 2002). Skualen merupakan antioksidan alami yang berfungsi
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
sebagai anti radikal dan antioksidan (Amarowicz, 2009).Triterpen juga ditemukan
bersifat proaktif dalam mencegah terjadinya penyakit karsinogenik (Huang et al., 2009).
Berdasarkan hasil analisis fitokimia dalam lintah laut (Discodoris sp.) bahwa
dalam daging lintah laut dengan pelarut etanol dinyatakan positif kuat mengandung
senyawa steroid atau golongan triterpen. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka
karbonnya berasal dari enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari
hidrokarbon C
30
asiklik, yaitu skualena. Skualen terdeteksi terdapat pada fraksi 5 (F5)
dalam daging lintah laut dengan pelarut etanol.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Rendemen ekstrak kasar tertinggi pada ekstrak etanol 5,08% (daging) dan 6,97%
(jeroan) dengan senyawa kimia yang terdeteksi: alkaloid, steroid, saponin, molisch dan
ninhidrin. Aktivitas antioksidan (IC
50
) tertinggi pada daging yang diekstraksi dengan
etanol yaitu 150,92 ppm dan senyawa yang diduga sebagai antioksidan yaitu skualen.
Saran
Saran yang bisa diambil dari hasil penelitian ini adalah perlunya dilakukan
metode ekstraksi yang lain yaitu menggunakan suhu dingin untuk mencegah terjadinya
kerusakan senyawa bioaktif antioksidan dalam lintah laut. Melakukan pemurnian
dengan kromatografi kolom untuk memperoleh senyawa yang lebih selektif.Melakukan
pengujian aktivitas dan toksisitas terhadap senyawa yang ditemukan dalam lintah laut.
DAFTAR PUSTAKA
Amarowicz R. 2009. Squalene: a natural antioxidant?.European Journal Lipid Science
Technology.111:411412.
Costantino L, Giulio R, Maria CG, Joe AV, Pratima B, Anna I, Mariagrazia S, Luciano
A, Antonella DC, Umberto M, and Albano A. 1999. 1-Benzopyran-
4-one Antioxidants as Aldose Reductase Inhibitors.Journal of Medical
Chemestry.42(11):18811893.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.1995. Materia Medika Indonesia. Jakarta:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Hafiluddin, Nurjanah, Tati Nurhayati. 2011. Kandungan gizi dan karakterisasi senyawa
bioaktif lintah laut (discodoris sp.). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan 3(1):
1-6.
Hanani E, Munim A, Sekarini R. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons
Callyspongia sp.dari Kepulauan Seribu.Majalah Ilmu Kefarmasian, 2(3):127
133.
Huang ZR, Lin YK, Fang YJ. 2009. Biological and pharmacological activities of
squalene and related compounds: Potential uses in cosmetic dermatology.
Molecules.14:540554.
Hutomo M, and Moosa MK. 2005. Indonesian marine and coastal biodiversity: Present
status. Indian Journal of Marine Sciences 34(1): 88-97.
Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012
Kim SH, Kim SS, Kwon O, Sohn KH, Kwack SJ, Choi YW, Han SY, Lee MK, Park
KL. 2002. Effects of dibutyl phthalate and monobutyl phthalate on cytotoxicity
and differentiation in cultured rat embryonic limb bud cells; protection by
antioxidants.Jounal of Toxicology and Environmental Health A.65(6):461-72.
Miyamoto T. Selected Bioactive Compounds from Japanese Anaspideans and
Nudibranchs. Pp. 199-214. In: Climino G, and Gavagnin M. (eds). Molluscs:
From Chemo-ecological Study to Biotechnological Application. Springer.
Berlin.
Naiu AS. 2011. Formulasi minuman fungsional berbahan baku lintah laut. [Tesis].
Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.
Nurjanah, Hardjito L, Monintja DR, Bintang M, Agungpriyono DR. 2010.
Karakterisasi Lintah Laut (Discodoris sp.) sebagai antioksidan dan
antikolesterol.[Disertasi]. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.
Pratiwi, Dewi P, Harapini M. 2006. Nilai peroksida dan aktivitas anti radikal bebas
diphenyl picril hydrazil (DPPH) ekstrak metanol Knema laurina. Majalah
Farmasi Indonesia. 17(1):32-36.
PDPERSI (Pusat Data dan Informasi Rumah Sakit Seluruh Indonesia). 2009. Awas!
Kondisi Lingkungan Buruk Pemicu Radikal Bebas. Jakarta.
Sherif SE, Edrada RA, Lin W dan Procksch P. 2008. Methods for isolation, purification
and structural elucidation of bioactive secondary metabolites from marine
invertebrata.Nature Protocols.3(12):1820-1831.
Smith RA, Porteous CM, Coulter CV, Murphy MP. 1999. Selective targeting of an
antioxidant to mitochondria. European journal of biochemistry. 263(3):709-716.




















Artikel ini telah di presentasikan pada Seminar Nasional Kedaulatan Pangan dan Energi 2012
Fakultas Pertanian, Universitas Trunojoyo Madura, J uni 2012