Paparan Hasil Praktikum Teknik Amobilisasi Enzim dan Kinetika Enzim

Oleh kelompok 3 :
Artha Vinsentricia Ekajayanti Kining Fitriana Shofia Monisa Gema Wahyuni Livia Rhea Alvita Origenes Boy Kapitan Riki Sogandi Tirta setiawan Ukhradhia M Safira G851130381 G851130141 G851130331 G851130391 G851130131 G851130111 G851130301 G851130241 G851130101 G851130466

PENDAHULUAN
Invertase atau -fruktofuranosida fruktohidrolase menghidrolisis sukrosa menjadi molekul -D-glukosa dan -DFruktosa (Barlikova et al. 1991). Enzim ini juga menhidrolisis -fruktan seperti rafinosa menjaedi gula-gula sederhana (Nakano et al. 2004). Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomyces cerevisiae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4.5 dan temperature 30 C (Bergamasco et al. 2000). Penentuan aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan metode Assay Nelson dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry. Penetuan kinetika enzim dapat menggunakan persamaan Michailes Menten, Line Weaver Burk, Dixon, Hanes, dan Eddie Hofstee.

Amobilisasi Enzim
Setelah digunakan tidak dapat dipakai kembali
Enzim mudah larut dalam air sehingga harus dilakukan pemurnian untuk dipakai kembali.

Mahalnya harga enzim

Teknik Amobilisasi enzim

Amobilisasi Enzim
Definisi
enzim yang secara fisik dijerap/terlokalisasi dalam suatu bahan penyangga dan aktivitas katalitiknya tetap dipertahankan

Keuntungan
Untuk mengurangi pengeluaran biaya dalam proses enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri makanan dan minuman Bisa digunakan kembali beberapa kali dan tetap aktif Pemisahan dan pembentukan kembali enzim mudah dilakukan Dapat menurunkan biaya operasi (Bayramolu et al. 2003)

Jenis-jenis teknik amobilisasi

Adsorpsi

Covalent bonding

Cross linking

Entrapment

Alat dan Bahan

Hasil

Entrapment

Metode

Kesimpulan

Alat Dan Bahan

Alat
1. Seperangkat alat Gelas 2. Spektrofotometer 3. Shaker incubator
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Bahan
Akrilamid Bis Akrilamid TEMED Amonium Persulfat Enzim Invertase Fraksi I (ekstrak kasar Fraksi 2 (amonium sulfat) Buffer asetat Sukrosa

Metode Pembuatan Enzim Amobil

Buffer asetat pH 4,5 + Akrilamid + Bis Akrilamid + Enzim Invertase + TEMED + Amonium persulfat 10% >> Diaduk , reaksi berlangsung pada suhu dingin

Pencucian 1
Gel Poliakrilamid (2 mm)

Dicuci munggunakan buffer

Pencucian 2

Pencucian 3

Metode pengujian Aktivitas Invertase

Substrat sukrosa Potongan Gel enzim amobil Inkubasi

Fraksi I Amobil Fraksi II Amobil Fraksi III Amobil

Uji aktivitas : reagen folin ciocolteau 660 nm

HASIL
Tabel Data Uji Aktivitas Invertase Amobil dan Bebas
Sumber enzim Absorbansi [glukosa] (mM) 0 0.757 Unit enzim Unit aktivitas (unit/mL) (unit) 7.567 15.135 Rataan (unit) Blanko (sukrosa) Enzim amobil T1 (0.05 mL) 0 0.089

Enzim amobil T2 (0.05 mL)

Enzim amobil T3 (0.05 mL) Enzim amobil S1 (0.5 mL) Enzim amobil S2 (0.5 mL) Enzim amobil S3 (0.5 mL) Enzim bebas A1 (0.05 mL) Enzim bebas A2 (0.05 mL) Enzim bebas A3 (0.05 mL) Enzim bebas B1 (0.5 mL) Enzim bebas B2 (0.5 mL) Enzim bebas B3 (0.5 mL)

0.144
0.071 0.181 0.639 0.492 - 0.064 - 0.060 - 0.070 0.078 0.080 0.040

1.252
0.594 1.586 5.712 4.387 -0.622 -0.586 -0.676 0.658 0.676 0.315

12.522
5.946 1.586 5.712 4.387 -6.216 -5.856 -6.757 0.658 0.676 0.315

25.045
11.892 3.171 11.423 8.775 -12.432 -11.711 -13.513 1.315 1.351 0.631 12.573

-5.727

CONTOH PERHITUNGAN
Kurva standar aktivitas
0.16 0.14
0.12 Absorban (A) 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 [Glukosa] (mM) 1 1.2 1.4 y = 0.111x + 0.0055 R = 0.9524

PEMBAHASAN
Aktivitas enzim didefinisikan sebagai bertambahnya produk atau berkurangnya substrat per satuan waktu. Pengujian aktivitas invertase kali ini dilihat dari banyaknya produk yang terbentuk yaitu glukosa. Pengujian dilakukan dengan metode Nelson yang memanfaatkan prinsip pengujian gula pereduksi. Penambahan reagen Nelson berguna sebagai pewarna dan selanjutnya segera dipanaskan untuk memperjelas warna yang dihasilkan. Reagen Nelson berisi CuSO4, Ba(OH)2, dan pereaksi tembaga alkali (Bintang 2010). Hasil penambahan kemudian didinginkan sehingga diperoleh padatan berwarna biru hingga biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi maka warna hijau semakin dominan. Penambahan fosfomolibdat betujuan untuk melarutkan padatan yang terbentuk sehingga warna biru semakin pekat. Warna yang terlalu pekat dapat dikurangi dengan penambahan akuades.

PEMBAHASAN

Berdasarkan data pada tabel, dapat terlihat bahwa konsentrasi glukosa (produk) paling tinggi terdapat pada fraksi amobil S2 yakni sebesar 5.712 mM. Hal ini dikarenakan volume enzim yang digunakan juga besar dan cukup mempengaruhi yaitu sebanyak 0.5 mL. Namun, volume enzim yang besar ternyata mempengaruhi unit aktivitas enzim. Unit aktivitas enzim amobil S1-S3 lebih kecil dibandingkan enzim amobil T1-T3. Hal ini disebabkan peningkatan volume enzim menyebabkan enzim banyak berkumpul sehingga mengurangi kesempatan bagi molekul substrat menempel pada sisi aktif enzim (Meryandini et al 2009). Rataan unit aktivitas enzim amobil yaitu 12.573 unit lebih besar dibandingkan rataan unit aktivitas enzim bebas yaitu 5.727 unit. Unit aktivitas adalah jumlah substrat yang dihidrolisis per menit. Artinya, enzim amobil memiliki kemampuan menghidrolisis substrat lebih banyak dibandingkan enzim bebas. Hal ini dikarenakan enzim amobil bersifat lebih spesifik dan efektif dalam menghidrolisis substrat dibandingkan enzim bebas yang kemungkinan memiliki lebih banyak pengotor berupa protein atau senyawa lainnya .

PEMBAHASAN
Keuntungan enzim amobil antara lain dapat digunakan lebih dari satu kali dan mudah dalam proses pemisahan produk. Amobilisasi invertase dengan penyangga poliakrilamid termasuk jenis amobilisasi berdasarkan pembentukan ikatan kovalen (covalent binding) antara dua atom yang berasal dari poliakrilamid dan residu asam amino pada enzim (Gambar 1). Bagian sisi aktif enzim akan berada dalam kondisi terbuka dan siap menangkap substrat. Selain dengan poliakrilamid, bahan lain juga dapat digunakan untuk mengamobilisasi invertase diantaranya alginat (Tanriseven & Dogan 2001), Nylon-6 microbead (Amaya-Delgado et al 2006) dan Sepabeads (Torres et al 2002).

Gambar 1

Metode Kinetika Enzim

Bahan dan Alat 4mM glukosa; 4 mM sukrosa; aquades; reagen fosfomolibdat; 0,2 M buffer asetat pH 4,5; reagen A (2% Na2CO3 dalam 0,1 N NaOH); reagen B (0,5% CuSO4.5H2O dalam 1% Na atau K-tartrat); reagen C (campuran 50 mL reagen A dalam 1 mL reagen B); reagen D (reagen Folin Cioucalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1 N dalam asam); fraksi protein I dan II tabung reaksi bertutup, water incubator, vortex, spektrofotometer (UV/Vis), stopwatch, mikropipet

Pembuatan Kurva Standar Gula Reduksi

8 tabung reaksi uji

menambahkan Glukosa masingmasing 0 ; 0,02 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,15 ; 0,2 ; 0,25 ; dan 0,3 mM
campuran

Menambahkan aquades sebanyak: 1 ; 0,98 ; 0,95 ; 0,9 ; 0,85 ; 0,8 ; 0,75 ; dan 0,7 mL
campuran

Menambahkan reagen kurpitartat: 1 mL

campuran

8 tabung reaksi uji

Memanakan dalam waterbath selama 20 menit Mendinginkan dalam suhu ruangan Mengocok dengan vortex Mendiamkan tabung selama 5 menit
Campuran terhomogenkan

Menambahkan 7 mL aquades pada emua tabung

Mengocok dengan vortex Mengukur Absorbansi pada panjang gelombang 510 nM Menggunakan tabung 1 sebagai bkanko Membuat kurva standar gula reduksi
Kurva standar gula reduksi

Pengukuran Uji Aktivitas Enzim

9 tabung reaksi uji Menambahkan 0,2 M buffer asetat pH 4,5 Menambahkan aquades masing-masing 0,6 ; 0,55 ; 0,10 ; 0,55 ; 0,10 ; 0,55 ; dan dan 0,10 mL Menambahkan masing2 fraksi dgn volume 0; 0,05 ; 0,50 ; 0,05 ; 0,50 ; 0,05 ; dan 0,50 mL Menambahkan sukrosa 0,5M maing2 sebanyak 0,20 mL Menambahkan reagen kurpitartat campuran

Mendidihkan semua tabung dalam waterbath selama 10 menit Mengukur A pada panjang gelombang 510 nM

Absorbansi masing2 tabung

Penentuan Nilai Km dan Vm

8 tabung reaksi uji Menambahkan 0,2 M buffer asetat pH 4,5 Menambahkan sukrosa 0,5M maing2 sebanyak 0 ; 0,02 ; 0,03 ; 0,04 ; 0,05 ; 0,06 ; 0,07 ; dan 0,08 mL Menambahkan aquades sampai volume 0,9 mL Menambahkan enzim masing2 sebanyak 0,1 mL menginkubasi Menambahkan reagen kurpitartat masing2 sebanyak 1 mL Mendiihkan tabung selama 20 menit Mengukur absorbansi pada 510 nM Absorbansi masing2 tabung

Penentuan Kadar Protein

8 tabung reaksi uji

Menambahkan standar BSA masing-masing 0 ; 0,20 ; 0,40 ; 0,60 ; 0,80 ; dan 1 mL Menambahkan sampel protein Menambahkan aquades masing-masing 1 ; 0,80 ; 0,60 ; 0,40 ; 0,20 ; dan 0 mL sbg blanko Menambahkan reagen C sebanyak 5 mL masingmasing tabung Mengaduk dengan vortex, dan mendiamkan dlm suhu ruangan selama 10 menit

Campuran Homogen
Menambahkan reagen D masing2 sebanyak 0,5 mL Mengaduk dengan vortex, dan mendiamkan dalam suhu kamar selama 30 menit Mengukur absorbansi pada panjang gelombang 750 nm dan membuat kurva standar BSA

Kurva standar BSA

Kurva Standar Aktivitas Enzim

0.16 0.14 y = 0.111x + 0.0055 R = 0.9524

0.12

0.1 Absorban (A)

0.08

0.06

0.04

0.02

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 [Glukosa] (mM) 1 1.2 1.4

Kurva Standar BSA

0.35 0.3 y = 0.0028x + 0.0156 R = 0.9797

0.25

Absorban (A)

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 20 40 60
[BSA] (g/mL)

80

100

120

Kurva Michaelis Menten

0.140

0.120

0.100

Vo (mM/menit)

0.080

0.060

0.040

0.020

0.000 0 20 40 60 80 100 120 [Sukrosa] (mM) 140 160 180 200

Kurva Line Weaverburk

12

10

y = 24.933x + 8.206 R = 0.7866

1/Vo

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

1/[Sukrosa]

Perhitungan Km dan Vm
y = 24.93x + 8.206 R = 0.786 Keterangan: y = 1/Vo x = 1/[substrat] a = 1/Vmaks b = Km/Vmaks sehingga, nilai Vmaks = 1/8.206 = 0.122 mM/menit Km = Vmaks x b = 0.122 x 24.93 = 3.04 mM

Hasil Kadar Protein Metode Lowry

Tabel Aktivitas Enzim
Sampel Absorbansi Konsentrasi Glukosa Aktivitas Enzim (U/ml)
4,848

Aktivitas Total (U)

2,424

Blanko Ekstrak Kasar Fraksi Amonium Sulfat Encer Kental Kromatografi Encer Kental

0,000 2,696

24,243

0,192 1,948

1,684 17,504

3,369 3,501

0,168 1,750

0,120 0,278

1,036 2,459

2,072 0,491

0,104 0,246

Tabel Pemurnian Enzim

Tahapan Pemurnian Aktivit as Total (U) 2,424 0,959 Total Protein (mg) 2,955 2,955 Aktivitas Spesifik (U/mg) 0,820 0,324 Tingkat Kemurnian Recovery (%)

Ekstrak Kasar Fraksi Amonium Sulfat Kromatografi

1 0,395

100 39,563

0,175

0,479

0,365

0,445

7,219

Tabel Kadar Protein

Sampel Absorbansi terukur 0,03 Absorbansi terkoreksi Konsentrasi protein (mg/ml) Total Protein (mg)

Blanko Ekstrak kasar Fraksi Amonium Sulfat Kromatografi

>3 >3 0,524

2,97 2,97 0,494

1477,5 1477,5 239,5

2.955 2,955

0,479

SARAN Perlu dilakukan pengujian terhadap penggunaan berulang invertase amobil untuk melihat seberapa efektif invertase amobil jika digunakan lebih dari satu kali.

DAFTAR PUSTAKA
Amaya-Delgado L, Hidalgo-Lara ME, Montes-Horcasitas, MC. 2006. Hydrolysis of sucrose by invertase immobilized on nylon-6 microbeads. Food Chemistry 99 (2) : 299-304. Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga. Meryandini A, Sunarti TC, Mutia F, Gusmawati NF, Lestari Y. 2009. Penggunaan xilanase Streptomyces. Sp 45 I-3 amobil untuk hidrolisis xilan tongkol jagung. J.Teknol. dan Industri Pangan 20 (1) : 9-16. Tanriseven A, Dogan S. 2001. Immobilization of invertase within calcium alginate gel capsules. Process Biochemistry 36 (11) : 1081-1083. Torres R, Mateo C, Fuentes M, Palomo JM, Ortiz C, FernandezLafuente R, Guisan JM. 2006. Reversible Immobilization of Invertase on Sepabeads Coated with Polyethyleneimine: Optimization of the Biocatalyst's Stability. Biotechnol. Process 18 (6) : 1221-1226.