Analisis/Deteksi Asam Nukleat

Alif Nuzulul Hidayat (1206249832)

Abstrak
Identifikasi dan analisis asam nukleat merupakan hal yang sangat penting dalam bidang ilmu biologi (biokimia khususnya) yang masih sangat berkembang saat ini. Hal tersebut dapat dikatakan penting karena semua inovasi maupun penemuan dalam biologi mengenai gen atau DNA pastinya diawali dengan proses identifikasi dan analisis asam nukleat. Analisis dan proses identifikasi/deteksi asam nukleat sendiri terdiri dari analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif bericara mengenai metode untuk mengetahui keberadaan atau eksistensi dari DNA atau RNA yang sedang diuji dan juga mengenai cara dalam memanipulasi/menggunakan DNA atau RNA dalam proses pengujian.Metode yang digunakan dalam hal tersebut diantaranya adalah staining, elektroforesis gel, hibridisasi, dan blotting. Lebih jauh lagi, analisis kualitatif juag membiarakan mengenai bagaimana proses dan mekanisme pengurutan DNA (DNA sequencing). Analisis kuantitatif membahas mengenai bagaimana menghitung kemurnian dan konsentrasi dari DNA atau RNA yang sedang diuji. Metode atau teknik yang digunakan dalam hal tersebut salah satunya adalah spektrofotometri UV-Vis. Selain itu, dibahas pula teknik RT-PCR yang mendukung analisis kuantitatif dari DNA atau RNA. Kata kunci : Staining, Elektroforesis gel, hibridisasi, blotting, DNA sequencing, RT-PCR, spektrofotometri UV-Vis

1. Analisis Kualitatif 1.1 Staining

Staining adalah metode identifikasi DNA atau RNA dengan cara menysipkan zat yang dapat mengeluarkan warna kepada DNA atau RNA tersebut. Karena DNA atau RNA tidak dapat kita lihat dengan mata telanjang, maka sebenarnya tujuan dari pemberian warna (staining) tersebut berfungsi untuk mengetahui keberadaan(eksistensi) atau lebih spesifiknya letak DNA atu RNA yang sedang kita uji. Zat-zat yang biasa digunakan dalam staining adalah a) EtBr (Ethidium Bromide) : EtBr berikatan diantara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan memendarkan warna kuning atau jingga pada panjang gelombang 290 nm. EtBr merupakan senyawa mutagenik dan sangat berbahaya jika terpapar ke dalam tubuh manusia sehingga penggunaannya harus sangat hati-hati. b) Acridine Orange : Zat ini digunakan untuk analisis DNA dan memendarkan warna hijau (green fluorescence) dengan emisi maksimum pada panjang gelombang 525 nm ketika terikat pada DNA. Selain digunakan untuk DNA, acridine orange juga dapat digunakan untuk identifikasi RNA dan memendarkan warna merah (red fluorescence) pada sekitar panjang geombang 650 nm.

Acridine Orange

Ethidium Bromide

1.2 Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel adalah metode untuk memisahkan molekul asam nukleat dengan memanfaatkan sifat DNA yang memiliki muatan negatif (pada gugus fosfat). Akibat adanya muatan negatif tersebut, molekul asam nukleat akan bergerak menuju kutub positif pada alat yang digunakan pada elektroforesis ini. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

(a)

(b)

Gambar 1. (a) Proses elektroforesis gel (b) Contoh hasil analisis elektroforesis gel

Dari gambar di atas terlihat bahwa sampel DNA (asam nukleat) bergerak ke arah elektroda positif. Pergerakan/migrasi dari molekul-molekul asam nukleat tersebut bergantung pada berat molekul masing-masing molekul asam nukleat. Molekul yang memiliki berat lebih ringan (lebih panjang rantainya) akan bergerak lebih lambat daripada molekul yang memiliki berat molekul lebih besar. Dengan begitu, molekul asam nukleat dapat dibedakan atas berat molekulnya dengan cara membandingkannya dengan sampel standar (sudah diketahui berat molekulnya). Berat molekul asam nukleat sebanding dengan panjang rantainya sehingga asam nukleat juga dapat dibedakan berdasarkan banyaknya pasangan nukleotidnya. Semakin banyak pasangan nukleotid yang terkandung, maka akan semakin panjang pula rantainya. RNA atau DNA berukuran kecil atau memiliki nukleotida sebanyak 500 atau kurang umumnya dipisahkan oleh elektrofresis gel poliakrilamid, sedangkan molekul yang lebih besar biasanya dipisahkan dengan metode elektroforesis gel agarosa, yaitu polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (kemudian dilarutkan dalam cairan buffer panas, dituangkan dalam cetakan, dan menurunkan suhu hingga terbentuk menjadi gel), karena memiliki porositas yang lebih besar. Pemisahan DNA (asam nukleat) yang memiliki ukuran lebih dari 25 kb (kilo base) biasanya dapat dipenuhi dengan menggunakan teknik yang dinamakan pulsed-field electrophoresis, dimana teknik tersebut menyebabkan molekul DNA mengubah orientasi medannya selama migrasi berlangsung. Pita DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid tidak terihat, kecuali DNA tersebut diberi tanda atau diberi label. Tanda atau label yang dimaksud disini adalah warna. Salah satu metode yang cukup sensitif dalam pewarnaan DNA (DNA staining) adalah dengan merendamnya dalam EtBr(ethidium bromida) yang akan menghasilkan pancaran warna tertentu apabila disinari sinar UV. Deteksi lain yang lebih sensitif adalah dengan

memasukkan sebuah radioisotop ke dalam DNA sebelum elektroforesis. Radioisotop yang biasa digunakan adalah 32P yang dapat mengeluarkan partikel berenergi. Hal tersebut dapat dideteksi dengan mudah oleh tenik autoradiografi. Sensitivitas teknik elektroforesis gel sangatlah baik hingga dapat membedakan molekul DNA atau RNA dengan selisih hanya satu nuleotida antara molekul satu dengan yang lainnya sehingga metode ini sangat berharga dalam proses DNA sequencing. Karena laju migrasi molekul dalam gel juga dapat dipengaruhi oleh bentuk dari molekul tersebut, elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan bentuk yang berbeda, misalnya bentuk circular dan linear atau relaxed dan supercoiled.

1.3 Metode Hibridisasi

Metode hibridisasi asam nukleat dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA dari patogen dalam spesi klinis dan untuk mengetahui letak gen spesifik dalam sel. Hibridisasi DNA merupakan metode atau teknik yang memanfaatkan kemampuan asam nukleat untuk membentuk molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantai tunggal dengan basa yang komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai. Proses pertama yang terdapat dalam proses hibridisasi adalah denaturasi. Proses denaturasi dilakukan dengan cara memanaskan larutan yang berisi DNA pada suhu 100C atau degan mengubah larutan tersebut dengan pH yang sangat tinggi (pH 13). Apabila hal tersebut dilakukan, maka pasangan basa komplementer terdiri dari dua rantai/pita yang secara normal membentuk double helix akan terpisah satu sama lainnya dan struktur double helix tersebut akan terdisosiasi secara cepat membentuk dua rantai tunggal. Setelah proses denaturasi berlangsung, dua rantai tunggal DNA kemudian diletakkan/dilekatkan ke sebuah lembaran padatan seperti nitroselulosa atau membran nilon. Untuk mengidentifikasi DNA target, sebuah molekul DNA atau RNA rantai tunggal yang telah diketahui struktur basanya, biasa disebut dengan probe, ditambahkan ke membran dalam larutan buffer. Hal tersebut memungkinkan pembentukan ikatan hidrogen atara basa yang saling komplementer dari DNA target dan probe. Probe memiliki ukuran dengan panjang berkisar antara 15 hingga ribuan nukleotid. Probe (dikatakan seperti itu karena digunakan untuk mencari sekuens DNA) diikatkan dengan reporter group, yaitu penanda kimia atau radioaktif, untuk memungkinkan terjadinya pendeteksian. Hibridisasi menggunakan DNA probe sangatlah sensitif dan selektif hingga dapat mendeteksi satu DNA sequence komplementer diantara ribuan yang lainnya. Setelah probe berikatan dengan DNA target, kemudian dilakukan pemisahan/pembuangan probe yang tidak bereaksi dengan DNA target dengan cara mencuci atau membilasnya dalam larutan buffer. Setelah pembilasan dilakukan, hal yang tersisa di atas nitroselulosa adalah DNA target dan molekul probe yang telah melekat ke sekuens komplementer di DNA target membentuk hybrid yang stabil. Hibridisasi dari DNA target dan probe dideteksi oleh pengujian terhadap reporter group yang menempel pada probe. Jika reporter group terdeteksi, artinya hibridisasi telah terjadi. Jika tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka dapat diasumsikan bahwa molekul target tidak memiliki sequences yang komplementer terhadap yang ada pada probe, dan itu menandakan bahwa gen atau segmen DNA yang dicari tidak ada dalam sampel.

Gambar 2. Hibridisasi DNA

1.4 Metode Blotting/Gel-transfer Hybridization

Blotting pada dasarnya adalah istilah yang digunakan untuk menyatakan transfer DNA atau RNA target dari gel yang dihasilkan melalui proses elekteroforesis gel ke lembaran nitroselulosa sebelum terjadinya proses hibridisasi. Jika dalam proses blotting digunakan RNA, maka hal tersebut dinamakan dengan Northern Blotting. Sebaliknya, jikan yang digunakan adalah DNA, maka istilah yang digunakan adalah Southern Blotting. Secara umum, dalam proses blotting dilakukan hal-hal sebagai berikut : a. DNA atau RNA dipisahkan berdasarkan ukurannya melalui proses elektroforesis gel b. DNA atau RNA dalam gel (telah dipisahkan berdasarkan ukurannya) kemudian ditransfer (blotting) ke lembaran nitroselulosa atau nilon. c. Lembaran nitroselulosa atau nilon yang telah berisi DNA atau RNA kemudian diinkubasikan dalam larutan berisi probe DNA. d. Terjadi proses hibridisasi antara probe DNA dengan DNA atau RNA target. e. Dilakukan pendeteksian untuk memeriksa apakah sekuens DNA yang kita uji terdapat dalam DNA atay RNA target.

Gambar 3. Metode Blotting/gel-transfer Hybridization

1.5 DNA Sequencing

DNA sequencing adalah suatu metode yang digunakan untuk mentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, dan timin pada sepotong DNA. Dalam DNA sequencing terdapat dua metode yang paling dikenal, yaitu metode Maxam & Gilbert dan metode Sanger. Metode Maxam & Gilbert didasarkan pada pembelahan DNA pada lokasi tertentu dengan penggunaan zat-zat kimia daripada enzim. Namun, metode ini sudah jarang digunakan. Metode yang lebih sering digunakan saat ini adalah metode Sanger. Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus 5 fosfat yang bebas dari nukleotid yang masuk dan gugus 3 OH dari rantai yang tumbuh. Proses ini berlangsung di sepanjang DNA tersebut. Pada metode ini digunakan dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah atom H pada karbon-3 dari gula ribosa. Hal tersebut

sedikit berbeda dengan deoxynucleotide triphosphates(dNTPs) yang memiliki gugus OH pada karbon-3 dari gula ribosa. Adanya atom H pada ddNTPs membuat rantai yang sedang tumbuh tidak dapat melangsungkan lagi pertumbuhannya. Dengan kata lain, dideoxynucleotide triphosphates berperan sebagai penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis, jika dideoxynucleotide triphosphates ditambahkan, maka proses sintesis tersebut akan berhenti karena 3 OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.

Gambar 4. Struktur Deoxynukleosida dan Dideoxyukleosida

Berikut adalah beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses DNA sequencing dengan metode Sanger : DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template Sejumlah nukeotida normal Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent) Gambar 5 di bawah ini menjelaskan mekanisme dalam proses DNA sequencing menggunakan metode Sanger. Mekanisme yang terjadi dalam proses tersebut adalah A. Seperti yang telah dikatakan sebelumnya, DNA sequencing metode Sanger menggunakan deoxynucleotide triphosphates dan dideoxynucleotide triphosphates. B. DNA yang telah dimurnikan disintesis in vitro dalam sebuah campuran yang mengandung molekul DNA rantai tunggal yang akan diurutkan (sequenced), enzim polimerase DNA, DNA primer pendek yang memungkinkan polimerase untuk memulai sintesis DNA , dan empat dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Jika analog dari ddNTP muncul pada campuran nukleotid, maka ddNTP tersebut dapat masuk ke dalam rantai baru yang sedang tumbuh. Akibatnya, pertumbuhan rantai akan berhenti. Dalam ilustrasi di bawah ini, terlihat bahwa sejumlah kecil ddATP masuk ke dalam campuran nukleotida. ddATP tersebut bersaing dengan dATP yang jumlahnya berlebih sehingga ddATP sangat jarang muncul dibandingkan dATP dalam rantai yang sedang tumbuh tersebut. C. Untuk menentukan urutan lengkap dari sebuah fragmen DNA, rantai ganda DNA pertama-tama dipisahkan ke dalam bentuk rantai tunggalnya dan satu diantaranya digunakan sebagai template untuk proses sequencing. Empat ddNTP digunakan di empat reaksi sintesis DNA yang berbeda. Reaksi tersebut dilakukan terhadap sejumlah salinan dari DNA awal yang digunakan. Setiap reaksi akan menghasilkan sejumlah salinan DNA yang terhenti pada titik-titik berbeda dalam urutan. Hasil tersebut kemudaian dipisahkan oleh proses elektroforesis dalam empat jalur sejajar seperti yang terlihat dalam gambar. Setelah itu, urutan DNA dapat ditentukan dengan membaca hasil elektroforesis dari yang terbawah dan secara berturut-turut hingga yang teratas.

Gambar 5. Mekanisme DNA sequencing metode Sanger

2. Analisis Kuantitatif 1.1 Spektrofotometri UV-Vis

Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis sebenarnya memanfaatkan kemampuan DNA murni yang dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basabasa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. DNA memiliki nilai tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 makan ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit. Selain menentukan kemurniannya, kita juga dapat menentukan konsentrasi DNA atau RNA dalam suatu sampel. Rumus yang dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi dari DNA atau RNA tersebut adalah sebagai berikut : [DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran 260 = nilai absorbansi pada 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 g untai ganda DNA per ml [RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran 40 = 40 g untai ganda RNA per ml

1.2 Metode RT-PCR sebagai pendukung analisis kuantitatif asam nukleat

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction, yaitu reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.Teknik ini berguna untuk menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil. Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gengen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesi, sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR, yang utama adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain : a) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan b) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.

Daftar Pustaka
Alberts, Bruce, 2008, Molecular Biology of The Cell,5th, Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. D.Stainsfield, William, Jaime, S. Colome, Raul, J. Cano, 2003, Schaums Easy Outlines Molecular and Cell Biology, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA. Karp, Gerald, 2010, Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, 6th, John Wiley & Sons, USA. Primrose, S. B., R. M., Twyman, R. W. Old, 2001, Principle of Gene Manipulation, 6th, Blackwell Science, Ltd., UK