Anda di halaman 1dari 7

Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Diagnosa Penyakit Penyakit menghinggapi manusia disebabkan oleh berbagai hal.

Faktor turunan, lingkungan, bakteri serta virus. Faktor penyebab penyakit yang bersinggungan langsung dengan genetika manusia adalah faktor oleh turunan, bakteri, dan virus. Gen-gen yang dihasilkan oleh faktor-faktor tersebut manghasilkan ekspresi yang berbeda-beda. Semakin berkembangnya zaman, telah banyak diterapkan metode identifikasi penyakit. Salah satunya yang paling aplikatif dan akurat adalah metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR singkatan dari Polymerase Chain Reaction merupakan suatu teknik untuk membuat suatu salinan segmen spesifik suatu DNA. PCR juga dapat berperan sebagai alat uji terhadap adanya virus melalui reaksi berantai suatu primer dari sequence DNA dengan bantuan enzym polymerase, sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara in vitro. Sistem kerja mesin PCR dimaksudkan untuk memperjelas bagian dari DNA mikroorganisma patogen sehingga dapat mendiagnosa penyebab penyakit secara akurat sedini mungkin. Pengujian PCR mempunyai keunggulan dalam mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh virus, bakteri atau parasit sebanyak satu (1) organisma. Keunggulan yang paling utama adalah hasilnya bisa langsung dilihatpada hari itu juga. Untuk menjalankan tes ini penggunaan asam nukleus (DNA/RNA) sebagai symbol sangatlah kecil. PCR mempunyai keunggulan dibandingkan dengan tes-tes lain seperti tes serological (ELISA, CF, IFT dll) karena pada tes serologicalbisa terjadi reaksi silang, kurang sensitive dan berbasis pada antibodi. Padahal antibodi dapat diseleksi dalam darah mulai hari ke lima (5) setelah terjadi infeksi, sedangkan dengan PCR dapat digunakan mulai hari pertama terjadinya infeksi. Dengan menggunakan PCR, identifikasi infeksi/penyakit dapat dilakukan pada tahap yang paling dini/awal. PCR memungkinkan kita untuk mengetahui tingkat serangan penyakit apakah masih dalam tahap ringan, sedang, atau sudah termasuk tahap parah. Oleh karena keunggulan inilah, dapat segera diakukan tindakan antisipatif sehingga penyakit yang ada dapat dicegah atau disembuhkan.

Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Mekanismenya Sebelum membahas lebih jauh tentang bagaimana teknik PCR dapat mendeteksi suatu penyakit, akan dijelaskan terlebih dahulu mengenai definisi PCR dan mekanisme kerjanya.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase.

Komponen-komponen Proses PCR 1) Enzim DNA Polymerase 2) Primer Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. 3) Reagen lainnya

dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. Tahapan PCR 1) Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC 95
o

C. 2) Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 oC 60 oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC. 3) Reaksi polimerisasi (extension) Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.

Mekanisme Diagnosa Penyakit Influenza dengan Teknik PCR Seperti yang telah dijelaskan diawal, penyakit yang mengidap manusia secara genetika dapat disebabkan oleh faktor turunan, bakteri, serta serangan virus. Masing-masing faktor mempunyai karakteristik gen tersendiri sehingga ekspresi yang ditampilkan pun juga berbedabeda. Salah satu faktor yang penyebab penyakit yang paling terkenal tentu saja adalah penyakit akibat serangan virus. Masing-masing virus juga memiliki karakteristik tersendiri, mengingat begitu banyaknya jenis virus serta dampak luaran yang rupanya berbeda-beda.

Dalam influenza virion A, terdapat delapan segmen RNA virus. Molekul-molekul ini membawa semua informasi yang dibutuhkan untuk membuat partikel virus influenza baru. Kedelapan RNA ditunjukkan sebagai garis hijau di bagian atas. Ada dua aspek penting dari RNA virus yang harus dipertimbangkan. Pertama, dapat dilihat bahwa ujung RNA diberi label 3 'dan 5'. Asam nukleat memiliki polaritas, antar ujung satu dengan ujung lainnya memiliki sifat kimiawai yang berbeda. Polaritas tersebut diwakili oleh 5' dan 3'. Kedua, ketika asam nukleat yang disalin atau digandakan oleh enzim yang disebut polimerase, seuntai polaritas pelengkap diproduksi. RNA virus influenza berlabel (-), atau RNA untai negatif, karena mereka memiliki polaritas yang berlawanan dari RNA yang diterjemahkan untuk membuat protein. Molekulmolekul RNA template untuk sintesis protein didefinisikan sebagai (+), atau polaritas positif. Setelah memasuki sel, (-) RNA untai influenza virus harus disalin ke untai pelengkap (+), sehingga salinan tersebut dapat berfungsi sebagai template untuk protein. RNA virus yang telah

disalin oleh enzim (RNA Polimerase) akan dibawa ke dalam sel dengan virus. Pada titik inilah manusia telah terjangkiti oleh virus Influenza.

Setelah virus ke dalam tubuh manusia, anggaplah kita belum mengetahui penyakit apa yang sedang diderita. Namun, kita mempunyai dugaan bahwa penyakit tersebut disebabkan oleh virus influenza. Secara umum, diagnosa DNA virus akan mulai terlihat pada proses penempelan primer. DNA virus memilki sekuen yang sangat bermacam-macam, maka kita perlu membuat primer yang cocok dengan virus influenza. Primer yang cocok dengan DNA virus influenza dapat dibuat dengan mengacu data gene bank. Hal ini dilakukan agar proses PCR hanya akan memperbanyak DNA virus (target) sehingga dapat diidentifikasi dengan mudah. Apabila primer tidak menempel pada DNA virus (yang belum diketahui), tentu saja proses PCR tidak akan berjalan dan ini menunjukkan bahwa diagnosa kita salah dan harus mengganti primer tersebut dengan primer yang cocok dengan DNA virus tadi. Sebaliknya apabila primer cocok dan menempel dengan DNA virus, maka diagnosa kita benar bahwa penyakit tersebut memang influenza. Selanjutnya, DNA influenza jumlahnya akan menjadi berlipat ganda sehingga dapat dideteksi dengan menggunakan electroporesis, gel agarosa, setelah diberi pewarna Ethidium Bromida (ETBr). Hasil electroforesis yang berupa band DNA dan dapat dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator dan didokumentasikan dengan camera digital atau biasa/polaroid. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr) RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain

pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.

Sumber Buku Cambell


schoolworkhelper.net

http://diskanlut-jateng.go.id/index.php/read/news/detail/25 http://www.virology.ws/2009/05/01/influenza-virus-rna-genome/