SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

AKTIVITASSITOTOKSIKOcimumsanctumL PADASELKANKERKOLONWiDr

SariHaryantidanKatno
BalaiBesarPenelitiandanPengembanganTanamanObatdanObatTradisional BadanLitbangKesehatan,KementerianKesehatanRI sari.haryanti@gmail.com;HP.08122646342

ABSTRAK Ocimum sanctum L (kemangi) adalah salah satu tanaman dengan kandungan asam ursolat. Asam ursolat merupakan senyawa kimia golongan pentasiklik triterpenoid yang terdapat pada tanaman. Beberapa penelitiaan menunjukkan bahwa asam ursolat memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker karena kemampuannya dalam menghambat beberapa tahapan pada karsinogenesis dan didukung dengan keberadaannya yang tersebar luas pada banyak tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil KLT dan aktivitas sitotoksik in vitro ekstraketanolikdanfraksiherbakemangipadaselkankerkolonWiDr. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi menggunakan penyari etanol 96% selama 3x24 jam; maserat dikeringkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kering. Identifikasi asam ursolat dengan KLT menggunakan fase diam silika gel, fase gerak kloroformaseton (9:1) dan penampak bercak asam sulfat 10% dalam etanol. Pengamatan dilakukan pada sinar tampak. Aktivitas sitotoksik ekstrak dan fraksinya dengan metode MTT assay untuk mendapatkan nilai IC50. Ekstrak aktif difraksinasi berturutturutmenggunakanheksan,kloroform,etilasetatdanair. Profil KLT ekstrak etanol kemangi memperlihatkan adanya bercak dengan Rf dan warnayangsamadenganbercakstandarasamursolat(warnamerahmuda;Rf0.65). UjisitotoksikekstraketanolikmemberikannilaiIC5085ug/ml.BerdasarkanprofilKLT keempat fraksi, hanya fraksi kloroform yang mengandung asam ursolat. Fraksi kloroformmerupakansatusatunyafraksiyangaktifdengannilaiIC5025ug/ml. Penelitian ini menunjukkan bahwa kemangi memiliki aktivitas penghambatan pertumbuhan dan menginduksi induksi kematian sel WiDr sehingga cukup potensial dikembangkansebagaiagenkemopreventif. Katakunci:Ocimumsanctum,fraksi,aktivitassitotoksik,selWiDr,kemopreventif PENDAHULUAN Kanker merupakan sekumpulan penyakit yang disebabkan oleh perubahan sifat normal sel yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh dan membelah tanpa terkendali, karena dapat memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut selanjutnya memiliki kemampuan invasive (menyusup dan merusak jaringan di dekatnya) dan metastasis (menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan
1

SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

limpa). Kanker berada di urutan ke dua penyebab kematian terbanyak di dunia setelah penyakit jantung. Semua organ dan bagian tubuh dapat menjadi target sel kanker.Kolonsebagaisaluranterakhirpencernaanmakananjugaberpotensiterkena kanker. Jumlah penderita kanker kolon berada di urutan teratas dari seluruh jenis kankeryangdideritapriadanwanita(Jemaletal.,2007).Pengembanganterapiyang komprehensif untuk mengatasi kanker kolon sangat diperlukan untuk menekan jumlahkematianpenderita. Salah satu pengembangan terapi kanker diarahkan pada terapi kombinasi antara suatu agen kemoterapi dengan senyawa kemopreventif. Salah satu pendekatan untuk menemukan senyawa kemopreventif adalah melalui eksplorasi bahan alam terutama tumbuhtumbuhan. Beberapa penelitian mulai diarahkan pada pengujian kombinasi bahan alam dengan agen kemoterapi untuk mengurangi terjadinya resistensidanefeksampingobat. Bahan alam mengandung berbagai senyawa biologis yang beraksi pada sel kanker melalui mekanisme yang kompleks. Salah satu tumbuhan yang dapat dikembangkan sebagai agen kemopreventif adalah Ocimum sanctum L (kemangi). Kemangi bersifat sebagai adaptogen, di antaranya memiliki beberapa efek farmakologi seperti imunomodulator, antistress, hepatoprotektif, kemopreventif, dan antiinflamasi. Senyawa aktif yang diketahui terdapat pada O. Sanctum L adalah flavonoids, orientin, vicenin, eugenol (1hydroxy2methoxy4allylbenzene), dan asam ursolat (Nitureetal.,2006). Asam ursolat diketahui memiliki aktivitas antikanker dengan menghambat peristiwa karsinogenesis, promosi kanker, induksi differensiasi sel kanker, dan angiogenesis. Aktivitas tersebut di antaranya diperantarai oleh kemampuan asam ursolat menghambat aktivasi salah satu faktor transkripsi, nuclear factorkappaB (NFB). NFB adalah salah satu protein yang meregulasi ekspresi sejumlah gen yang berperan dalam proses pembentukan kanker; termasuk gen antiapoptosis, gen yang mengatur adhesi molekul, dan gen yang mengatur siklus sel. Senyawa yang dapat menghambat aktivasi NFB memiliki potensi terapetik sebagai senyawa antikanker (Shishodiaetal.,2003). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil KLT dan aktivitas sitotoksik in vitro ekstrak etanolik dan fraksi herba kemangi pada sel kanker kolon WiDr. Sel WiDr merupakan sel kanker kolon yang diambil dari jaringan epitelial seorang wanita, berupa sel adherent (melekat) dengan karakteristik antara lain resisten terhadap beberapa agen kemoterapi (JeanClaude et al., 1999), dan overekspresi COX2 (Kojimaetal.,2000). METODEPENELITIAN Tempat dan waktu penelitian. Penelitian dilakukan di Laboratorium Parasitologi FakultasKedokteranUGM. Ekstrak etanolik dan fraksi herba kemangi (EHK). Herba kemangi diperoleh dari daerah Karanganyar. Ekstrak diperoleh dengan mengekstraksi herba kering dengan

SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

etanol 96%. Selanjutnya ekstrak etanol cair yang didapat dikentalkan dengan rotary evaporator,dikeringkandiataswaterbathhinggadiperolehekstrakkering. Fraksinasi dilakukan dengan melarutkan 10 g ekstrak aktif dalam 50 mL akuades dan dibasakan sampai pH 8 dengan penambahan amoniak, kemudian difraksinasi menggunakan heksan, kloroform, dan etil asetat menggunakan corong pisah. Fraksinasi dilakukan sebanyak 3 kali replikasi, volume penyari yang digunakan tiap kali fraksinasi adalah 250 mL. Hasil fraksinasi kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh 4 fraksi kental, yang selanjutnya disebut fraksi heksan,fraksikloroform,fraksietilasetatdanfraksiair. Sel kanker kolon. Sel kanker kolon WiDr yang digunakan adalah koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Kultur sel ditumbuhkan dalam media penumbuh Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640(Gibco)yangmengandungFoetalBovineSerum(FBS)10%(v/v) (Gibco),penisillinstreptomisin1%(v/v)(Gibco). Deteksi asam ursolat. Sebanyak kurang lebih 1% EHK dan 0,1% standard asam ursolat dalam metanol ditotolkan pada lempeng KLT; kemudian dikembangkan dalam fase gerak kloroformaseton (9:1). Setelah batas elusi, lempeng dikeringkan dan disemprot dengan asam sulfat 10% dalam etanol hingga semua bagian lempeng terbasahi; ditunggu hingga lempeng kering. Lempeng dipanaskan dalam oven suhu 1100C selama 5 menit dan diamati pada sinar tampak. Lempeng kemudian dianalisa denganTLCdensitometer Ujisitotoksikinvitro.Sejumlah5000selWiDr/sumuranditanampadamicroplate96 sumuran dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu medium diganti yang baru dengan ditambahkan EHK maupun fraksi pada berbagai konsentrasi (50200 g/ml) dengan cosolvent DMSO (Sigma) dan diinkubasi pada 37C dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Pada masingmasing sumuran, ditambahkan 100l media kultur dan 10l MTT (Sigma) 5 mg/ml. Sel diinkubasi kembali selama 46 jam dalam inkubator CO2 5%, 37C. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen asam isopropanol (HCl 4N (Merck)isopropanol (Merck), (1:100), digoyang di atas shaker selama 10 menit. SerapandibacadenganELISAreaderpadapanjanggelombang595nm. Analisis Data. Data absorbansi pada uji sitotoksik diolah dengan regresi linier programExcellMSOffice2007.

HASIL Profil KLT EHK memperlihatkan adanya bercak warna merah muda pada sinar tampak dengan intensitas warna dan Rf (0,6) yang sama dengan standard asam ursolatyangdigunakan.

SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

Gambar 1. Profil KLT EHK (A1) dan standard asam ursolat (A2) pada pengamatan dengan sinar tampak;BadalahprofilEHKsaatdianalisadenganTLCdensitometer

Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa perlakuan EHK kadar 50200 g/mL pada sel WiDr menyebabkan terjadinya perubahan morfologi dibandingkan sel tanpa perlakuan (Gambar 1). Berdasarkan morfologi serta viabilitas sel terdapat hubungan linier antara konsentrasi dan efek sitotoksik yang dihasilkan. Perubahan morfologi tersebut dimungkinkan mengarah pada kematian sel. EHK mampu menghambat pertumbuhanselWiDrdenganIC50sebesar85g/ml.
100 80

% viabilitas

60 40 20

0 30 60 90 120 150 200 kadar EHK (ug/ml)

Gambar 1. Viabilitas sel WiDr akibat perlakuan EHK. Uji dilakukan dengan menginkubasi 5x103 sel dengan EHK (50200 g/mL) selama 48 jam. Terjadi perubahan morfologi pada perlakuan EHK 120 g/mL (B) dibandingkan sel kontrol (A). Grafik C memperlihatkan adanya hubungan konsentrasi EHK terhadappersentaseviabilitassel.

Uji sitotoksik fraksi EHK menunjukkan tidak semua fraksi memiliki aktivitas pada sel WiDr. Fraksi aktif adalah fraksi kloroform dengan IC50 25g/mL. Profil KLT memperlihatkanbahwahanyafraksikloroformyangmengandungasamursolat.

SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

120 100 % viabilitas 80 heksan 60 40 20 kloroform EtOAc air

0 5 10 30 60 90 120

Kadarfraksi (ug/ml)

Gambar 2. Viabilitassel WiDr akibat perlakuan fraksi EHK. Uji dilakukandengan menginkubasi 5x103 sel dengan fraksi EHK (5120 g/mL) selama 48 jam. Terjadi perubahan morfologi pada perlakuan fraksi kloroform 120 g/mL (B) dibandingkan sel kontrol (A). Grafik C memperlihatkan hubungan konsentrasitiapfraksiterhadappersentaseviabilitassel.

PEMBAHASAN EHK memberikan hambatan pertumbuhan sel kanker kolom WIDR dengan IC50 yang relatif kecil (85g/ml, kurang dari 100g/ml) sehingga cukup potensial untuk dikembangkan sebagai alternatif agen kemopreventif. Di antara keempat fraksi yang digunakan, hanya fraksi kloroform yang memiliki aktifitas penghambatan pertumbuhan sel. Berdasarkan profil KLT hanya fraksi kloroform yang memperlihatkan adanya asam ursolat. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa yangbertanggungjawabterhadapaktifitassitotoksikkemangiadalahasamursolat. Shishodia et al., 2003, menunjukkan bahwa asam ursolat mampu menurunkan aktivitas NFB melalui penghambatan IB kinase dan fosforilasi p65 yang berkorelasidenganpenurunanekspresicyclinD,COX2,danMMP9.NFBberperan dalam proses kemoresistensi dengan cara aktivasi protein Myc sebagai perantara aktivasi transkripsi cyclin A dan D. Hal ini menyebabkan apoptosis terabaikan dan siklus sel terus berlanjut. Stimulasi NFB dapat melalui death receptors kemudian berinteraksi dengan gen target seperti IAPs dan menghambat jalur caspase (Schimmer, 2004); atau melalui sinyal proliferasi melewati jalur Akt sehingga mengakibatkan peningkatan ekspresi protein antiapoptosis. Penelitian yang lebih mendalam perlu dilakukan untuk mengkaji peran EHK dan relevansinya dengan penghambatanaktivitasNFBsehinggamemberikanefeksitotoksik. KESIMPULAN Ekstraketanolikherbakemangi(OcimumsanctumL.)memilikiefeksitotoksikdengan nilaiIC5085g/mL.FraksiaktifadalahkloroformdengannilaiIC5025g/mL.Senyawa yangbertanggungjawabterhadapaktifitastersebutadalahasamursolat.
5

Si imposiumNasional N XVPERHIPBA, P Solo, S 910No ovember201 11

FTARPUSTA AKA DAF Agg garwal, B.B., Sethi, G., Nair, A. an nd Ichikawa a H. 2006. Nuclear FactorB: A Holy Grail in Cancer C Prev vention and d Therapy. Current Signal Transdu uction Ther rapy. 1:2552. Che en, Y.H., Chang, F.R., Wu, W C.C., Ye en, M.H., Liaw, C.C., Huang, H H.C., Kuo, Y.H. and ., 2005, New Cytotox xic 6Oxygenated 8,9 9Hedyotiscone AC, from f Wu, Y.C. Hedyotisbiflora.Pla antaMed.72:7578. Dau ucas, H., Garcea, G G., Neal, C. .P., Manso on, M.M., and Berry y, D.P., 2006, Chemopr revention of o Pancreatic Cancer: A Review of the Molecular Pathw ways Involved, and Eviden nce for the Potential for f Chemop prevention, Pancreatol logy; 6:42943 39. Dha armananda, , S. 2004. Oldenlandia O and Scutellaria Antito oxin and An nticancer He erbs. Institute for Traditio onal Medicine, Portland, Oregon.J Jemal, A., Siegel, R., Ward, W E., Murra ay, T., Jiaquan Xu and d Michael J.T. 2007. Cancer Sta atistic 2007, CA CancerJClin., C 57:43 366 Jean nClaude,B.J.,Mustafa a,A.,Watso on,A.J.,Dam mian,Z.,Vasilescu,D.,Chan,T.H.,and LeylandJones,B.,19 999,Tetraze epinonesar reEquallyCytotoxic C to oMer+andMer Huma an Tumor Cell C Lines, The T Journal l Of Pharma acology And Experime ental Therapeu utics,288(2 2):484489.
d King g,R.J.B.,200 00,CancerBiology B ,2nd edition,Pe earsonEduc cationLtd.,London.

Kojima, M., Morisaki, T., Izuhara, K. ., Uchiyama a, A., Matsunari, Y., K Katano, M., and Tanaka, M., M 2000, Lipopolysacc L charide Increases CycloOxygenas se2 Expres ssion InAColonCarcinom maCellLineThroughNu uclearFacto orBActiva ation,Onco ogen, 251231 19(9):122 Leig gh, M.J., 20 003, Health Benefits of o Grape Se eed Proanth hocyanidin Extract (GS SPE), NutritionNoteworth hy,6(1):article5. Nitu ure, SK., Rao, US., Srive enugopal K., K 2006, Chemopreven ntative strat tegies targe eting MT repair protein: Aug gmented ex xpression in n human lymphocytes and the MGM kanker ce ells by eth hanolic and aqueous extracts e of f several In ndian medic cinal plants.IN NTERNATION NALJOURNA NALOFONCO OLOGY29:12691278 Schimmer, A.D D. 2004 Inh hibitor of Apoptosis Pr roteins: Tra anslating Ba asic Knowle edge intoClinic calPractice.Review.Ca ancerResea arch64:718 837190. Shehata, M.F. 2005. Rel/Nuclear factor f kappa B apopt tosis pathw ways in human cervicalcancer c cells. .Review.Ca ancerCellIn nternational5:1023. shodia, S., Majumdar, , S., Baner rjee, S. and d Aggarwal, B.B. 200 03. Ursolic acid Shis Inhibits Nuclear N FactorB Kin nase and p6 65 Phospho orylation: C Correlation with DownRegulation of f Cyclooxyge enase 2, Matrix Metalloproteinas se 9, and Cy yclin D1.Cance erResearh.63,43754383.

SimposiumNasionalXVPERHIPBA,Solo,910November2011

Simstein, R., Burow, M., Parker, A., Weldon, C., and Beckman, B., 2003, Apoptosis, Chemoresistance, and Breast Cancer: Insights from the WIDR Cell Model System,ExpBiolMed,228:9951003. Srivastava, R.K., Sasaki, C.Y., Hardwick, J.M. and Longo, D.L. 1999. Bcl2mediated DrugResistance:InhibitionofApoptosisbyBlockingNuclearFactorofActivated T Lymphocytes (NFAT)induced fas Ligand Transcription. The Journal of ExperimentalMedicine190(2):253265. Wickenden, J.A., Clarke, M.C.H., Rossi, A.G., Rahman, I., Faux,, S.P., Donaldson, K, and MacNee, W., 2003, CigaretteSmoke Prevents Apoptosis through Inhibition of Caspase Activation and Induces Necrosis, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:562570. Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell DeathApoptosisandNecrosis,RoscheDiagnosticCorporation.