Anda di halaman 1dari 14

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mulamula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNAnya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang laindalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisilin.

1.2 Tujuan Praktikum 1.2.1 Mengetahui tahapan transformasi plasmid pLGO yang mengandung gen GFP pada transforman berupa bakteri E. Coli 1.2.2 Mengetahu prinsip kerja transformasi plasmid pGLO. 1.2.3 Mengasah keterampilan bekerja dalam bidang molekuler.

1.3 Rumusan Masalah Berdasarkan tujuan yang tercantum, rumusan masalah yang dapat dikemukakan meliputi : 1.3.1 Bagaimana tahapan transformasi plasmid pLGO yang mengandung gen GFP pada transforman berupa bakteri E. Coli? 1.3.2 Bagaimana prinsip kerja transformasi plasmid?

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Transformasi Transformasi DNA dapat terjadi secara alami maupun buatan.

Transformasi secara alami, biasanya terjadi pada sebagian siklus hidup setiap mikroorganisme khususnya bakteri. Terjadi trasnformasi secara alami berkaitan dengan konsisi kompeten sel selama sel tumbuh. Kondisi ini biasanya terjadi menjelang fase sel stasioner dimana sel mencapai densitas tertinggi sepanjang pertumbuhannya. Kompeten sel sangat memungkinkan DNA luar masuk kedalam sel bakteri. Transformasi DNA secara alami, frekuensinya sangat rendah dikarenakan adanya syarat tertentu seperti kontak antar sel, homologi dari DNA yang bersangkutan, adanya proses modifikasi dalam inang, kondisi morfologi dan perlunya gen khusus untuk proses konjugasi (Brown, 1986). Selain itu juga Brown memaparkan bahwa transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mulamula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNAnya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisilin.

2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik untuk keperluan amplifikasi DNA secara in vitro yang seringkali mempunyai sensitivitas dan spesifisitas tinggi. Amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR terdiri atas beberapa siklus yang setiap siklusnya terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi, pelekatan (annealing) dan pemanjangan (elongasi). Tahap denaturasi adalah pembentukan DNA utas tunggal dari DNA utas ganda (putusnya hidrogen dari kedua utas tunggal DNA yang komplementer) yang umumnya terjadi pada suhu _ 95oC. Tahap annealing yaitu pelekatan primer yang terjadi pada suhu 35-65oC, bergantung panjang pendeknya oligonukleotida primer yang digunakan. Sedangkan tahap pemanjangan primer terjadi sebagai hasil aktivitas polimerisasi oleh enzim Taq polimerase, yang pada umumnya dilakukan pada suhu 70oC (Griffin dan Griffin 1993; Madigan et al. 1997). Teknik ini banyak dilakukan untuk keperluan deteksi atau identifikasi cepat bakteri patogen (Madigan et al. 1997). Teknik PCR-RFLP gen 16S-rRNA dikembangkan untuk mengetahui keragaman bakteri dengan cara mengamplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan primer universal domain bakteria (Marchesi et al. 1998). Adanya keragaman genetik ini dapat dilihat dengan membandingkan profil DNA hasil amplifikasi (dalam hal ini gen 16S-rRNA) setelah didigesti dengan enzim restriksi tertentu (Suwanto 1995). Perbedaan profil DNA (jumlah dan ukuran pita DNA yang terbentuk pada gel elektroforesis) menunjukkan adanya keragaman genetik. Teknik PCR adalah suatu teknik biologi molekuler untuk memperbanyak sekuen DNA tertentu (lebih dari 100 juta kopi) dengan waktu relatif singkat (beberapa jam), oleh karena itu teknik ini bisa disebut amplifikasi DNA. Dengan PCR, molekul DNA dapat diperbanyak sampai jutaan kopi dalam tabung reaksi. Beberapa primer yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen 16SrRNA (Marchesi et al. 1998), diantaranya adalah 27f dan 149r. Namun kedua primer tersebut belum dapat mengamplifikasi sampel bakteri yang berasal dari beragam sumber seperti sedimen laut dalam, bakteri rongga mulut, dan bakteri yang diisolasi dari ephiliton (bakteri yang berasosiasi dengan batu pada habitat air

mengalir). Selain itu ada pula primer 63f dan 1387r yang telah diuji coba berhasil mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari berbagai sumber diantaranya sedimen laut dalam. Karakterisasi bakteri patogen pada tingkat subspesies menjadi suatu studi yang sangat penting untuk mempelajari segala sesuatu yang berhubungan dengan epidemologi penyakit. Metode karakterisasi bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan analisis fenotip yaitu dengan mempelajari sifat fisiologis atau biokimianya maupun analisis genotipik secara molekuler. Seringkali hasil uji biokimia atau fisiologis tersebut sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan ataupun kondisi sel itu sendiri karena perbedaan ekspresi gen. Untuk karakterisasi galur-galur dalam suatu spesies perlu dilihat sifat yang paling mendasar dan relatif stabil yaitu dengan analisis genotipik (Suwanto 1995). Para ahli taksonomi mikroba dewasa ini telah mengakui bahwa analisis DNA merupakan cara terbaik untuk karakterisasi spesies dan menentukan hubungan antara organisme yang berbeda-beda. Secara ideal, perbandingan antara galur dalam spesies dapat dilakukan dengan menganalisis sekuen DNA seluruh genom organisme tersebut dan kemudian membandingkannya dengan sekuen DNA dari genom organisme lain. Namun saat ini, cara ini kurang praktis untuk analisa secara rutin (Suwanto 1995). Secara umum metode molekuler untuk keperluan pencirian dan identifikasi bakteri dapat digolongkan menjadi metode yang berdasar pada analisis asam nukleat atau analisis protein. Analisis profil asam nukleat mencakup analisis profil plasmid (plasmid profilling).

2.3 Elektroforesis Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga

pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.4 Spektrofotometer Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan

spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.5 Escherichia coli Berikut tasonomi bakteri E. coli : Divisio Classis Ordo Family Genus Spesies : Protophyta : Schizomycetes : Eubacteriales : Eubacteriaceae : Escherichia : Escherichia coli Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek, sebagian besar gerak positif dan beberapa strain mempunyai kapsul, merupakan jasad indikator adanya jasad yang berbahaya di dalam substrat air dan bahan makanan. Bakteri ini dapat tumbuh dengan medium nutrien sederhana dan umumnya meragikan laktosa dengan membentuk asan dan gas (Hanahan, 1989)

2.6 pGLO pGLO plasmid memiliki tiga gen khusus yaitu satu untuk GFP, gen untuk resistensi antibiotik, dan regulasi gen sistem. Sistem ini dapat digunakan untuk mengontrol ketika bakteri memproduksi protein fluorescent. Gen untuk GFP dapat diaktifkan dalam sel dan dapat berubah dengan menambahkan arabinosa gula. Sel yang mengalami perubahan akan muncul berwarna putih di cawan petri yang tidak mengandung arabinosa dan berwarna hijau bila arabinosa termasuk dalam agar nutrient media. Selain itu kita dapat menguji bahwa sel-sel telah diubah dengan pGLO DNA dengan menumbuhkan bakteri tersebut di piring antibiotik.

Transformasi genetik melibatkan penyisipan beberapa DNA baru ke dalam sel E. coli.Bakteri memiliki satu kromosom besar dan satu atau lebih plasmid. Plasmid biasanya mengandung gen dengan sifat yang dapat membantu bakteri bertahan hidup. Para ilmuwan dapat menggunakan proses yang disebut rekayasa genetika untuk menyisipkan gen coding untuk sifat baru ke dalam plasmid. pGLO plasmid memiliki gen GFP yang berfungsi sebagai protein fluorescent hijau dan gen yang dapat memberikan efek resistensi bakteri terhadap antibiotik. pGlo plasmid dapat digunakan untuk mengubah bakteri sehingga memiliki sifat baru. Gen untuk GFP awalnya diisolasi dari ubur-ubur bercahaya Aequorea victoria. Struktur 3-D dari GFP menyebabkannya beresonansi ketika itu terkena radiasi ultraviolet dan mengeluarkan energi dalam bentuk cahaya tampak setelah GFP dimasukkan ke pGlo plasmid. pGlo plasmid mengkodekan gen untuk GFP dan laktamasebeta, yang memberikan resistensi terhadap antibiotik ampicillin. pGlo juga menggabungkan sistem regulasi gen khusus yang dapat digunakan untuk mengontrol ekspresi protein fluorescent dalam sel. Gen dengan mudah dapat diaktifkan dalam sel dengan menambahkan gula arabinosa ke media nutrisi (kontrol positif transkripsi). Seleksi untuk sel-sel yang telah diubah dengan pGlo DNA terlihat pertumbuhan pada media selektif yang mengandung antibiotik ampicillin (Bernhard, 2010).

BAB III METODE PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. l. Cawan petri diameter 5 cm, 5 buah loop, 1 buah pembakar spirtus, 1 buah Alkohol 70% dalam botol semprot batang pengaduk bentuk L tip kuning (steril dengan autoklav) tip biru steril (steril dengan autoklav) tip putih steril (steril dengan autoklav) es batu dan wadah rak tabung 1.5 ml berlubang 6 tabung reaksi 1.5 ml steril, 6 buah (steril dengan autoklav) plastik tahan panas 2 buah

m. alkohol 70% dalam wadah botol selai n. o. p. q. Spidol Marker Selotip Lap karet bulp untuk pipet pasteur steril dengan UV 4 buah

3.2 Cara Kerja a. Memberi label pada tabung reaksi 1.5 ml dengan kode (P) dan (+P) & nama kelompok. b. Membuka tutup tabung dan menggunakan pipet atau tips steril untuk memasukkan larutan transformasi (CaCl2) yang telah disimpan dilam 20C selama minimal 24 jam ke dalam tabung masing-masing sebanyak 250 ul. c. Menyimpan tabung kedalam wadah es.

d. Mensterilkan loop dengan api,

dan mendinginkan dengan cara

mencelupkan loop pada pinggir agar, kemudian ambil 1 koloni bakteri yang besar (atau 2-3 koloni) dan memasukkan loop kedalam tabung (+P), tabung dijentik-jentikkan dan diputar agar koloni bakteri tersebar merata. Melakukan hal yang sama pada tabung (-P). Menyimpan tabung dalam es selama 20 menit. e. Memasukkan 5ul (10ng/ul) larutan vektor plasmid pGLO/pGemT ke dalam tabung (+P) saja. Menjentik-jentikkan perlahan agar plasmid dan bakteri bercampur. Menutup rapat tabung. f. Menyimpan kedua tabung dalam es selama 10 menit. g. Selama menunggu tabung dalam es. Memberi label agar plat LB+amp: (+P); agar plat LB+amp+ara: (+P); agar plat LB+amp: (-P); agar plat LB: (P). h. Heat shock. Memasukkan kedua tabung ke dalam waterbath 42C selama tepat 50 detik. Setelah itu bersegera masukkan tabung ke dalam es, dan mendiamkan dalam es selama 2 menit i. Secara aseptik memasukan medium LB cair kedalam tabung (+P) dan (-P) masing-masing sebanyak 250 l. Meginkubasi tabung pada suhu 37C selama 15 menit. j. Menjentik-jentikan tabung dengan jari. Secara aseptik, dengan

menggunakan tips steril, pipet 100 ul memindahkan larutan transformation dan kontrol ke dalam medium agar plat. k. Secara aseptik, dengan menggunakan loop steril atau batang pengaduk kaca steril, spresd atau meratakan larutan di atas agar. l. Mengabungkan semua cawan petri dalam satu kelompok. Meletakkan posisi tutup cawan petri di bawah. Simpan pada suhu 37C selama 16-18 jam. m. Menyimpan cawan ke dalam lemari es pada suhu 4C selama sedikitnya 24 jam agar warna hijau pada koloni jelas terlihat dibawah pendaran UV.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil Transformasi pada praktikum ini dilakukan dengan tujuan menyisipkan

plasmid ke dalam sel. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel E. coli tersebut kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman. Hasil yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni E. coli dalam cawan.

Gambar 1. Koloni E. coli hasil dalam cawan LB + AMP + Ara Sumber: Dokumentasi pribadi

Gambar 2. Koloni E.coli, tidak berpendar pada lampu UV (dark reader) Sumber: Dokumentasi pribadi

Tabel 1. Jumlah Koloni Sel E.coli pada Media Kultur Jumlah koloni pada media Jenis sel Media LB Media LB (1) Sel E.coli (2) Media LB + ara (1) Media LB + ara (2) Media LB + amp + ara 1

4.2

Pembahasan Proses transformasi yaitu memasukkan plasmid (yang merupakan vektor

yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang. Dalam praktikum ini, plasmid yang disisipkan ke dalam sel bakteri E. coli adalah plasmid pGLO. Plasmid pGLO merupakan plasmid modifikasi yang telah disisipkan gen GFP yang berasal dari ubur-ubur Aequorea victoria (Karsi, 2007). Plasmid ini memiliki ukuran 5400 pasangan basa dan membawa informasi titik ori (awal replikasi),

gen GFP, regulator araC, dan gen resistensi terhadap antibiotika ampicillin (Clontech, 2008). Gen GFP mengode protein berpendar hijau yang dapat berpendar jika diekspresikan oleh prokariota seperti E. coli atau eukariota seperti Caenorhabditis elegans. Regulator AraC merupakan pengatur ekspresi dari gen GFP. Hal ini menyebabkan operon ini baru aktif mengekpresikan protein bila ada kehadiran L-arabinosa. Arabinosa akan membantu RNA polimerase berikatan dengan promotor sehingga transkripsi gen terjadi (Karsi, 2007). Jika sel bakteri menghasilkan protein GFP dalam jumlah yang banyak maka pendaran hijau terang di sinar UV juga akan menjadi semakin terang. Selain gen itu pGLO juga mempunyai gen lain yaitu bla yang mengode enzim beta-laktamase yang menghasilkan resistensi terhadap ampicillin pada E.coli sehingga dapat digunakan sebagai penanda selektif (Mosher, 2002). Setelah melakukan proses transformasi pada bakteri E. coli, dari hasil pengamatan didapatkan satu koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada cawan LB + Amp + Ara. Akan tetapi, setelah cawan LB + Amp + Ara tersebut dilihat di bawah sinar UV, koloni bakteri E. coli tersebut tidak berpendar hijau. Hal ini dikarenakan larutan vektor plasmid pGLO yang

dimasukkan terlalu sedikit yaitu sebanyak 5 L, seharusnya vektor plasmid pGLO yang dimasukkan lebih dari 5 L agar plasmid tersebut berhasil disisipkan pada sel bakteri E. coli sehingga ketika dilihat di bawah sinar UV akan menghasilkan warna hijau yang berpendar.

BAB V KESIMPULAN

Setelah dilakukan praktikum, mahasiswa mendapat pengetahuan baru mengenai jalannya transformasi walau hasil yang didapat belum optimum. Setelah melakukan proses transformasi pada bakteri E. coli, dari hasil pengamatan didapatkan satu koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada cawan LB + Amp + Ara. Akan tetapi, setelah cawan LB + Amp + Ara tersebut dilihat di bawah sinar UV, koloni bakteri E. coli tersebut tidak berpendar hijau. Hal ini dikarenakan larutan vektor plasmid pGLO yang dimasukkan terlalu sedikit yaitu sebanyak 5 L. Prinsip transformasi adalah penyisipan gen asing ke dalam gen mahluk hidup melalui suatu proses khusus, salah satunya adalah heat shock yaitu perubahan permeabilitas dinding sel secara cepat untuk memaksa plasmid masuk ke dalam sel baru dan terekspresikan. Pengeskpresian plasmid pGLO ditandai dengan resistensi terhadap antibiotic ampisilin karena adanya gen aLB dan koloni yang berpendar di bawah UV karena gen GFP.

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A. 1986. Gene Cloning : an introduction. P. 74-99. Chapman & Hall. Clontech. 2008. GFP Variant Vectors. [Online] Tersedia: http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&catalog_ id=632312&page=all [12 Januari 2013]. Griffin, HG and Griffin, AM. 1993. DNA sequencing : Recent innovations and future trends. J. Appl. Biochem and Biotech 38: 147-159. Hanahan, Douglas. 1983 .Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 166, 557 Karsi A, Lawrence ML. 2007. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for gram-negative bacteria. J Plasmid 57(3):286-295. Marchesi J.R., Sato T, Weightman A.J., Martin T.A.,Fry J.C., Hiom S.J., Wade W.G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl Environ. Microbiol 64:795-9. Mosher RH. 2002. Using pGLO to Demonstrate the Effects of Catabolite Repression on Gene Expression in Escherichia coli. Bioscene 28:17-23. Muller, Bernhard. 2010. Transformation of pGlo into Escherichia coli. Biologie III: Diversity of Microorganisms Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB Suwanto A 2002. Complication of Practical Manual. Biotrop Training Course in Microbial Biodiversity.

Anda mungkin juga menyukai