Anda di halaman 1dari 39

Isolasi Senyawa Kamfen dari Rimpang Kencur (Kaempferia Galanga)

I. Tujuan Melakukan isolasi metabolit sekunder kamfen dari simplisia rimpang kencur (Kaempferia galanga).

II. Prinsip 1. Ekstraksi (maserasi) Like dissolve like Suatu senyawa cenderung larut pada pelarut dengan kepolaran yang relatif sama. 2. Kromatografi lapis tipis Adsorpsi suatu proses yang terjadi ketika suatu fluida, cairan maupun gas , terikat kepada suatu padatan atau cairan (zat penjerap, adsorben) dan akhirnya membentuk suatu lapisan tipis atau film (zat terjerap, adsorbat) pada permukaannya. Partisi Suatu senyawa cenderung terbagi (terpartisi) pada fase polar atau fase non polar bergantung pada koefisien partisinya. 3. Ekstraksi cair-cair Like dissolve like Suatu senyawa cenderung larut pada pelarut dengan kepolaran yang relatif sama. Partisi Suatu senyawa cenderung terbagi (terpartisi) pada fase polar atau fase non polar bergantung pada koefisien partisinya.

Hukum distribusi nerst Suatu senyawa jika dimasukkan kedalam sistem dengan dua pelarut yang berbeda, maka senyawa tersebut akan terdistribusi ke kedua pelarut dengan perbandingan tertentu.

4. Kromatografi kolom Adsorpsi suatu proses yang terjadi ketika suatu fluida, cairan maupun gas , terikat kepada suatu padatan atau cairan (zat penjerap, adsorben) dan akhirnya membentuk suatu lapisan tipis atau film (zat terjerap, adsorbat) pada permukaannya. Partisi Suatu senyawa cenderung terbagi (terpartisi) pada fase polar atau fase non polar bergantung pada koefisien partisinya. Perbedaan kecepatan migrasi Perbedaan kecepatan migrasi antara fraksi-fraksi pada kolom silika gel disebabkan oleh perbedaan kepolaran.

III. Teori Dasar RIMPANG KENCUR (Kaempferia rhizoma) Tumbuhan herba/terna perenial dengan kumpulan daun berbentuk roset dekat permukaan tanah. Batang semu, pangkalnya membentuk rimpang. Rimpang bercabang-cabang sangat kuat, pada bagian akarnya di beberapa tempat menjadi umbi warna putih, kekuningan, membulat atau memanjang, aromatis, berair dan rapuh. Daun umumnya 2, jarang 1 atau 3, bentuk helai daun bulat panjang (elips) tumbuh mendatar di permukaan tanah.. Bunga majemuk, panjang sampai 4 cm, terdiri atas 4-12 bunga berwarna putih dengan garis violet, daun pelindung 2, sempit. Tandan bunganya tumbuh di pucuk di antara helai daun, daun mahkota putih, harum, bentuk tabung, benang sari steril bentuk lembaran, berlekatan warna ungu, kepala sari besar (Tjitrosoepomo. 1994). Rimpang digunakan untuk bumbu masak, obat batuk dan nyeri dada. Minyak atsiri dipakai untuk aromaticum, corrigen odoris ataupun sebagai odoransia. Rimpangnya bersifat analgeticum, yakni bisa meredakan rasa sakit pada gigi, sakit kepala ataupun rematik. Juga merangsang keluarnya angin perut (carminativum), penghangat badan serta stimulansia. Rimpang yang dimaserasi dengan alkohol digunakan untuk mengurut kaki keseleo, otot kaki yang layu ataupun untuk mengencangkan urat-urat / otot-otot (Ika dan Soemarno, 1991). Rimpang mengandung minyak atsiri yang tersusun dari monoterpenoid, sesquiterpenoid (komponen utama adalah ethylesthercinnamic acid dan ethylesther p-methoxycinnamic acid), borneol, Camphene, p-methoxystirene, l-D3-carene, npentadekane, p-methoxystyrene. Di samping itu terdapat pula golongan senyawa flavonoid (Gunawan dkk, 1989).

Camphene (C10H16) juga menjadi bahan penyusun minyak atsiri jahe, dan minyak sereh, dan juga ditemui dalam familia Lauraceae. Borneol (C10H18O) banyak tersebar di alam sebagai komponen minyak atsiri. Di bidang industri borneol murni bersama

juga isoborneol digunakan sebagai bahan baku penyusun parfum dan bahan pengester. Borneol murni bersifat racun, mengakibatkan kekacauan mental dan bingung (Stecher, 1968). Sifat-sifat fisika minyak kencur (Gunawan dkk, 1989): Bentuk cairan, aromatis, rasa pedas, berwarna kuning jernih sampai kuning kotor. Berat jenis pada 30o : 0,8792 0,8914 Rotasi optik spesifik pada 30o : -2o 36 sampai -4o 30 Indeks bias pada 30o : 1,4773 1,4855 Bilangan asam : 0,5 1,3 Bilangan penyabunan : 99,7 109,0 Bilangan penyabunan setelah asetilasi : 110,1 116,3 Efek Biologik Cinnamic acid ethylesther dan p-methoxy-cinnamate bersifat toksis terhadap larva Spodophtera littoralis (Gunawan dkk, 1989). Toksisitas Memiliki sifat halusinogenik (Pandji et,al., 1993). Dosis Untuk obat batuk 5 gram rimpang segar dikunyah mentah sampai halus dan lalu ditelan (Tjitrosoepomo, 1994). EKSTRAKSI Ekstraksi adalah jenis pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan. Proses ekstraksi bermula dari penggumpalan ekstrak dengan pelarut kemudian terjadi kontak antara bahan dan pelarut sehingga pada bidang datar antarmuka bahan ekstraksi dan pelarut terjadi pengendapan massa dengan cara difusi. Bahan ekstraksi yang telah tercampur dengan pelarut yang telah menembus

kapiler-kapiler dalam suatu bahan padat dan melarutkan ekstrak larutan dengan konsentrasi lebih tinggi di bagian dalam bahan ekstraksi dan terjadi difusi yang memacu keseimbangan konsentrasi larutan dengan larutan di luar bahan (Sudjadi, 1988). Ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan dengan cara dingin dan cara panas. Jenisjenis ekstraksi tersebut sebagai berikut : 1. Ekstraksi cara dingin Maserasi Merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindunng dari cahaya. Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, tiraks, dan lilin (Sudjadi, 1988). Keuntungan dari metode maserasi adalah peralatannya yang sederhna. Sedangkan kerugiannya antara lain, waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi sampel atau simplisia cukup lama, cairan penyari yang dibutuhkan lebih banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-bahan yang mempunyai tekstur keras seperti benzoin, tiraks dan lilin (Sudjadi, 1988). Soxhletasi Merupakan penyarian simplisia secara berkesinambungan, cairan penyari dipanaskan sehingga menguap, uap cairan penyari terkondensasi menjadi molekul-molekul air oleh pendingin, balik dan turun menyari simplisia dalam klongsong dan selanjutnya masuk kembali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa sifon (Sudjadi, 1988). Keuntungan metode ini (Sudjadi, 1988) : - Dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan terhadap pemanasan langsung. - Menggunakan pelarut yang lebih sedikit. - Pemanasannya dapat diatur. Kerugian dari metode ini (Sudjadi, 1988) :

Karena pelarut didaur ulang, ekstrak yang terkumpul pada wadah disebelah bawah terus menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi penguraian oleh panas. Jumlah total senyawa-senyawa yang diekstraksi akan melampaui kelarutannya dalam pelarut tertentu sehingga dapat mengendap dalam wadah dan membutuhkan volume pelarut yang lebih banyak untuk melarutkannya. Bila dilakukan dalam skala besar, mungkin tidak cocok untuk menggunakan pelarut dengan titik didih yang terlalu tinggi, seperti metanol atau air, karena seluruh alat yang berada di bawah kondensor perlu berada pada temperatur kamar untuk pergerakan uap pelarut yang efektif.

Metode ini terbatas pada ekstraksi dengan pelarut murni atau campuran azeotropik dan tidak dapat digunakan untuk ekstraksi dengan campuran pelarut, misalnya n-heksan : diklorometana = 1:1, atau pelarut yang diasamkan atau dibasakan, karena uapnya akan mempunyai komposisi yang berbeda dalam pelarut cair di dalam wadah (Sudjadi, 1988). Perkolasi Adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari melalui simplisia yang telah dibasahi. Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan langkah tambahan, yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari ekstrak. Kerugiannya adalah kontak antara sampel padat tidak merata atau terbatas dibandingkan dengan metode refluks dan pelarut menjadi dingin selama proses perkolasi sehingga tidak melarutkan komponen secara efisien (Sutriani, 2008). 2. Ekstraksi cara panas Refluks Keuntungan dari metode ini aadalah digunakan untuk mengekstraksi sampel-sampel yang mempunyai tekstur kasar dan tahan terhadap pemanasan langsung. Kerugiannya adalah membutuuhkan volume total pelarut yang besar dan sejumlah manipulasi dari operator (Sutriani, 2008). Destilasi uap Adalah metode yang popular untuk ekstraksi minyak-minyak menguap (essensial) dari sampel tanaman. Metode destilasi uap air diperuntukkan

untuk menyari simplisia yang mengandung minyak menguap atau mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi pada tekanan udara yang normal (Sutriani, 2008). Pelarut yang baik untuk ekstraksi adalah pelarut yang mempunyai daya melarutkan yang tinggi terhadap zat yang diekstraksi. Daya melarutkan yang tinggi ini berhubungan dengan kepolaran pelarut dan kepolaran senyawa yang diekstraksi. Terdapat kecenderungan kuat bagi senyawa polar larut dalam pelarut polar dan begitu juga sebaliknya (Sutriani, 2008). Pemilihan pelarut pada umumnya dipengaruhi oleh (sutriani 2008) : Selektivitas, pelarut hanya dapat melarutkan ekstrak yang diinginkan. Kelarutan, pelart sedapat mungkin memiliki kemampuan melarutkan ekstrak yang besar. Kemampuan tidak saling bercampur, pada ekstraksi cair, pelarut tidak boleh larut dalam bahan ekstraksi. Kerapatan, sedapat mungkin terdapat perbedaan kerapatan yang besar antara pelarut dengan bahan ekstraksi. Reaktivitas, pelarut tidak boleh menyebabkan perubahan secara kimia pada komponen bahan ekstraksi. Titik didih, titik didih kedua bahan tidak boleh terlalu dekat karena ekstrak dan pelarut dipisahkan dengan cara penguapan, destilasi dan reaktifikasi. Criteria lain, sedapat mungkin murah, tersedia dalam jumlah besar, tidak beracun, tidak mudah terbakar, tidak eksplosif bila bercampur udara, tidak korosif, bukan emulsifier, viskositas rendah dan stabil secara kimia dan fisik.

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi adalah Suatu metoda untuk separasi yang menyangkut komponen suatu contoh di mana komponen dibagi-bagikan antara dua tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi gerak yang lain . Di dalam gas kromatografi adalah gas mengangsur suatu cairan atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan kromatografi adalah campuran cairan pindah gerakkan melalui cairan yang lain , suatu padat, atau suatu 'gel' agar. Mekanisme separasi komponen mungkin adalah adsorpsi, daya larut diferensial, ion-exchange, penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David. 2001).

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup (Chamber) (Rudi, 2010). Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan

menggunakan kolom kromatografi dan sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT (Lenny, 2006). Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007).

Prinsip Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya

menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut (Skoog, 1996). Keunggulan Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Rohman & Gandjar, 2007). Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini :

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Rohman & Gandjar, 2007).

Kekurangan Satu kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputan pelat kaca dengan penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan ada-nya penyaput otomatis. Meski pun begitu, dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pcncegahan tertentu. Pelat kaca harus dibersihkan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan le-mak. Kemudian bubur silika gel (atau penjerap lain) dalam air harus dikocok kuatkuat selama jangka waktu tertentu (misalnya 90 detik) sebelum penyaputan.

Tergantung pada ukuran partikel penjerap, mungkin harus ditambahkan kalsium sulfat hemihidrat (15%) untuk membantu melekatkan penjerap pada pelat kaca. Akhirnya, setelah penyaputan, pelat harus dikeringkan pada suhu kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan dalam tanur pada 100 110C selama 30 menit (Harbone, 2006).

Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair menggunakan prinsip kesetimbangan dengan perpindahan massa zat terlarut (fasa dispersi) dari larutan yang diekstraksi ke larutan yang digunakan sebagai pelarut (fasa kontinyu). Berbagai perancangan kolom ekstraksi menggunakan korelasi hidrodinamika dengan distribusi fasa dispersi yang seragam di sepanjang kolom dengan perilaku gelembung tunggal ( Japri,2008). Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Proses ini digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika, bahan-bahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam. logam. Proses inipun digunakan untuk membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair (Rahayu,2009).

Ekstraksi cair-cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara destilasi tidak mungkin dilakukan (misalnya karena pembentukan aseotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau tidak ekonomis. Seperti ekstraksi padatcair, ekstraksi cair-cair selalu terdiri atas sedikitnya dua tahap, yaltu pencampuran secara intensif bahan ekstraksi dengan pelarut, dan pemisahan kedua fasa cair itu sesempurna mungkin ( Rahayu,2009). Pada saat pencampuran terjadi perpindahan massa, yaitu ekstrak meninggalkan pelarut yang pertarna (media pembawa) dan masuk ke dalam pelarut kedua (media ekstraksi). Sebagai syarat ekstraksi ini, bahan ekstraksi dan pelarut

tidak. saling melarut (atau hanya dalam daerah yang sempit). Agar terjadi perpindahan masa yang baik yang berarti performansi ekstraksi yang besar haruslah diusahakan agar terjadi bidang kontak yang seluas mungkin di antara kedua cairan tersebut. Untuk itu salah satu cairan distribusikan menjadi tetes-tetes kecil (misalnya dengan bantuan perkakas pengaduk) ( Rahayu,2009). Tentu saja pendistribusian ini tidak boleh terlalu jauh, karena akan menyebabkan terbentuknya emulsi yang tidak dapat lagi atau sukar sekali dipisah. Turbulensi pada saat mencampur tidak perlu terlalu besar. Yang penting perbedaan konsentrasi sebagai gaya penggerak pada bidang batas tetap ada. Hal ini berarti bahwa bahan yang telah terlarutkan sedapat mungkin segera disingkirkan dari bidang batas. Pada saat pemisahan, cairan yang telah terdistribusi menjadi tetestetes hanis menyatu kembali menjadi sebuah fasa homogen dan berdasarkan perbedaan kerapatan yang cukup besar dapat dipisahkan dari cairan yang lain ( Rahayu,2009). Kecepatan Pembentukan fasa homogen ikut menentukan output sebuah ekstraktor cair-cair. Kuantitas pemisahan persatuan waktu dalam hal ini semakin besar jika permukaan lapisan antar fasa di dalam alat semakin luas. Sama haInya seperti pada ekstraksi padat-cair, alat ekstraksi tak kontinu dan kontinu yang akan dibahas berikut ini seringkali merupakan bagian dari suatu instalasi lengkap ( Rahayu,2009). Keuntungan dan kelemahan Jenis Ekstraksi Cair-cair Keuntungan Tak Kontinyu Alat mudah dan relatif murah Kelemahan Pengocokan yang berulangulang. Terjadinya kenaikan tekanan internal dan emulsi dalam corong

pemisah. Kehilangan pelarut relative besar.Waktu total ekstraksi lama Kontinyu Tanpa pengocokan yang Alat relatif mahal berulang-ulang.Tidak terjadi kenaikan internal dan emulsi dalam ekstraktor.Kehilangan pelarut relatif kecilWaktu total ekstraksi singkat (Rusli, 1980 ). Koefisien distribusi (KD) dinyatakan dengan rumus sebagai berikut: KD = C2/C3 atau KD = Co/Ca C1 atau Ca adalah kosentrasi solute dalam pelarut pertama atau pelarut air C2 atau Co adalah kosentrasi solute dalam pelarut dua atau pelarut organic ( Mimir,2011)

KROMATOGRAFI KOLOM Kromatografi kolom adalah kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerapyang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan (Miller et al.,1992).

Berikut macam-macam kromatografi kolom : 1. Kromatografi adsorpsi 2. Kromatografi partisi cair-cair Suatu pemisahan yang dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak. Cairan yang tertahan di dalam kolom adalah fasa diam sedangkan cairan yang bergerak sepanjang kolom adalah fase bergerak. 3. Kromatografi kolom flash Pada kromatografi ini, pelarut dimasukkan ke dalam kolom dengan penambahan tekanan. Kromatografi ini berguna untuk memurnikan senyawa organik. Penambahan tekanan udara atau biasanya nitrogen berasal dari tangki silinder yang diletakkan di atas kolom (Hostettman & Hostettman,1995). 4. Kromatografi kolom vakum Kromatografi ini menggunakan tekanan jumlah yang kecil atau tekanannya rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak. Selain itu, kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Dalam prosedurnya, digunakan penghisap pada bagian bawah kolom yang kemudian dialirkan ke pompa vakum (Hostettman & Hostettman,1995).

Komponen-komponen dalam kromatografi kolom terdistribusi dalam 2 fasa, yaitu : 1. Fasa diam atau fasa stasioner Yaitu fasa yang tertahan dalam komponen sampel. Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan. Fasa diam berfungsi sebagai penyerap atau adsorban. Fasa diam akan menyerap komponen-komponen dalam campuran yang dibawa oleh pelarut yang memiliki kepolaran yang sama. Fasa diam tidak boleh larut dalam fasa gerak (pelarut) (Underwood,1999). Berikut adalah fasa diam yang digunakan dari kepolaran paling tinggi hingga kepolaran yang rendah :

a. Polar Alumina Magnesium oksida Arang Silika gel Kalsium oksida - Magnesium karbonat - Kalsium karbonat - Sodium karbonat - Amilum baik - Selulosa Adsorpsi yang kurang baik Adsorpsi yang paling

b. Non polar (Braun,1987).

2. Fasa gerak atau fasa mobile Yaitu fasa yang berpindah melalui fasa diam dengan membawa komponenkomponen sampel. Fasa gerak dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut yang berbeda. Fasa gerak adalah cairan yang dipilih untuk mengefektifkan pemisahan sampel. Fase gerak yang paling sering digunakan adalah air atau pelarut organik yang lainnya. Pelarut yang paling cocok untuk memisahkan harus ditentukan melalui percobaan, biasanya dengan cara kromatografi lais tipis. Kolom harus diberi pelarut dimulai dari yangkurang polar, lalu meningkat sampai yang polar (Markham, 1988). Fasa gerak harus selektif terhadap komponen dan tidak kental agar dapat memeprkecil penurunan tekanan dan meningkatkan laju alir zat (Johnson,1991). Berikut fasa gerak yang digunakan dari kepolaran yang rendah hingga kepolaran yang tinggi, yaitu : Non polar Petroleum eter Karbon tetraklorida Sikloheksana Toluene Benzen Eter Kloroform Etil eter Alkohol Alkohol (etanol dan metanol)

Air

Long retention time

Polar Asam organik Short retention time (Braun,1987). Kromatografi kolom adalah salah satu teknik kromatografi dimana fasa diam ditepatkan dalam sebuah wadah berupa kolom. Pemisahan senyawa kimia pada kromatografi kolom didasarkan pada kepolarannya sampel terhadap fasa diam ataupun berdasarkan ukuran molekul. Pada kromatografi kolom, kolom gelas vertikal diisi dengan fasa diam dalam kolom yang dapat menunjang pemisahan sampel pada bagian atas kolom. Sebagian kolom juga diisi dengan pelarut, dimana dengan pengaruh gravitasi dapat menggerakkan sampel melalui kolom. Hampir sama dengan bentuk kromatografi lainnya, perbedaan kecepatan gerak melalui fasa diam ditunjukkan pada perbedaan waktu keluar dari bagian bawah kolom untuk berbagai elemen dari sampel yang asli (Gritter et al., 1991). Kromatografi kolom biasanya untuk skala besar (gram). Mengemas kolom harus dilakukan dengan hati-hati, agar dihasilkan kolom kemas yang serba sama. Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca masir, maka kita harus menyumbat koom dengan segumpak kaca wool atau kapas. Sumbat ini harus terendam dengan pelarut pengelusi setinggi 10 cm. Selanjutnya kemasan kolom dijadikan bubur dalam gelas piala memakai pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam kolom dan tidak terputus-putus, untuk mencegah terbentuknya lapisan. Setelah itu kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dikeluarkan melalui keran. Pada poliamid dianjurkan kemasan direndam dulu selama satu jam, supaya menggembung. Langkah pertama pada kromatografi kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap untuk dielusi. Untuk mencapai itu, cuplikan harus dilarutkan dalam pelarut yang volumenya sesedikit mungkin. Pelarut yang dipakai harus sama dengan pelarut pengelusi, dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah, walaupun hal ini tidak selalu dapat dilaksanakan berhubung dengan kelarutannya. Menempatkan

larutan pekat pada kolom harus hati-hati supaya kemasan kolom tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan menggunakan pipet. Dibiarkan meresap ke dalam kolom, baru proses kromatografi di mulai. Jika masalah kelarutan tidak memungkinkan, kita menggunakan cara penjerapan. Cupikan dilarutkan ke dalam sedikit pelarut sembarang yang cocok, dan dicampur dengan sedikit penjerap. Lalu penjerap dikeringkan dan ditaburkan di atas kolom semerata mungkin sebagai serbuk. Pada kromatografi kolom dapat digunakan penjerap (fase diam) bermacam-macam seperti selulosa, silika, poliamid, gel sephadex. Pengelusi dapat digunakan dengan macam-macam pelarut, bisa isokratik atau gradient. Hasil kromatografi kolom yang berupa fraksi-fraksi dan dipantau dengan KLT menggunakan pendeteksian dengan UV 254 nm ataupun 366 nm atau dengan pereaksi semprot (Gritter et al., 1991). Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang kurangnya 10 kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan. Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon.

Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi.

DAFTAR PUSTAKA Gunawan, Didik, Sri Mulyani, CJ. Sugihardjo., Kunsumardiyah. 1989. Empon-empon dan Tanaman Lain dalam Zingiberaceae. Perhimpunan Peneliti Bahan Obat Alami (PERHIPBA) Kom. Yogyakarta. IKIP Semarang Press. Semarang. R. Soemarno D.S, Ika Sastrahidayat. 1991. Budidaya Tanaman Tropika. Penerbit Usaha Nasional. Surabaya. Pandji. C, Grimm C, Wray V, Witte L, Proksch P. 1993. Insecticidal constituents from four species of the Zingiberaceae. Phytochemistry. Stecher P.G. (Editor). 1968. The Merck Index : an Encyclopedia of Chemicals and Drugs. Merck & Co, Inc. USA. Tjitrosoepomo, G. 1994. Taksonomi Tumbuhan Obat-obatan, Gadjah Mada University Press.

IV. Alat dan Bahan a. Alat yang digunakan adalah 1. Batang Lidi 2. Bejana Kromatografi 3. Botol fial 4. Botol gelas 5. Cawan uap 6. Cawan petri 7. Corong pisah 8. Destilator 9. Erlenmeyer 10. Gelas ukur 11. Gelas kimia 12. Heating mantle b. Bahan yang digunakan adalah 1. Aquades 2. Bubuk silica gel 3. Etanol 4. Etil asetat 5. Kapas 6. Kertas saring Whatman c. Gambar Alat 7. N-heksan 8. Pelat Silica gel GF 254 9. Simplisia rimpang kencur 10. Toluene 11. Vanilin Sulfa 13. Kolom gelas 14. Labu bulat 15. Labu destilasi 16. Lampu UV 256 nm 17. Lampu UV 366 nm 18. Penangas air 19. Pipa kapiler 20. Pipet tetes 21. Piknometer 22. Rotavapor 23. Soxhlet 24. Spatula

Alat Soxhlet

Corong Pisah untuk ECC

Rotavapor

V. Prosedur Persiapan Rimpang kencur (Kaempferia galanga) dikeringkan, kemudian dipisahkan dari batang atau tangkainya. Setelah itu rimpang kencur ditimbang pada timbangan digital, dan dicatat hasilnya. Soxhletasi Simplisia rimpang kencur (Kaempferia galanga) dimasukkan ke dalam kertas saring whatman lalu dibungkus. Etanol dimasukkan ke dalanm labu alas bulat sampai setengah volume labu lalu ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia dalam kertas saring whatman dimasukkan ke dalam tabung soxhlet. Alat soxhlet dipasang sesuai tempatnya dan ditambahkan pelarut pada bagian atas tabung soxhlet untuk pembasahan simplisia dan heating mantle dinyalakan sampai mencapai suhu titik didih pelarut. Lalu simplisia diekstraksi sampai tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Selanjutnya ekstrak cair dipekatkan menggunakan alat rotary evaporator. Kemudian ekstrak dikeringkan dengan cara diuapkan di atas penangas air, lalu rendemennya dihitung.

Kromatografi Lapis Tipis untuk Konfirmasi keberadaan kamfen dalam ekstrak Pelat kromatografi, yaitu silica gel GF 254 disiapkan dengan ukuran 1x10 cm. Setelah itu sebagian rendemen dilarutkan kembali dalam etanol 70% secukupnya. Ekstrak diambil secukupnya dengan menggunakan pipa kapiler, kemudian ditotolkan pada batas bawah pelat (1 cm dari tepi). Pelat dimasukkan dalam chamber yang telah berisi pengembang, yaitu n-heksan : etil asetat = 8 : 2 yang telah dijenuhkan selama + 30 menit. KLT berakhir dengan munculnya bercak hingga hampir sampai batas atas (1 cm dari tepi). Sebelum disemprot, pelat dilihat pada UV 254 dan UV 366. Kemudian pelat disemprot dengan penampak bercak, yaitu asam sulfat dalam methanol. Bercak diamati dan dicatat.

Ekstraksi cair-cair. Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam air, kemudian dimasukkan dalam corong pisah dan ditambahkan n-heksan 1 : 1 terhadap air. Dikocok, sambil sesekali dikeluarkan gas yang terbentuk, dan didiamkan samapi kedua pelarut terpisah sempurna. Kemudian masing-masing bagian pelarut dipisahkan, lalu bagian air (fraksi air) dimasukkan kembali dalam corong pisah dan ditambahkan n-heksan kembali dengan perbandingan yang sama (1:1) dan diperlakukan seperti sebelumnya, hingga didapat 3:1 fraksi n-heksan terhadap fraksi air pada tempat yang terpisah. Kemudian fraksi air dimasukkan kembali dalam corong pisah, lalu ditambahkan etil asetat 1:1 terhadap air dan diperlakukan sama dengan fraksi nheksan hingga didapat 3:1 fraksi etil asetat terhadap fraksi air di tempat yang terpisah. Masing-masing fraksi diuapkan dan dihitung rendemennya.

Kromatografi Lapis Tipis Untuk Mengetahui Pelarut yang Paling Kaya Kamfen Pelat kromatografi yang digunakan masih sama dengan yang sebelumnya, yaitu silica gel GF 254. Ekstrak dan ketiga jenis fraksi dilarutkan dalam pelarut

yang sesuai secukupnya di tempat yang terpisah. Masing-masing diambil dengan pipa kapiler yang berbeda dan ditotolkan pada batas bawah (1 cm dari tepi) pelat kromatografi. Masing-masing totolan diberi jarak. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah berisi pengembang (n-heksan : etil asetat = 8 : 2) yang telah dijenuhkan. Kromatografi berakhir ketika bercak yang timbul mendekati batas atas pelat kromatografi (1 cm dari tepi). Sebelum disemprot, pelat dilihat pada UV 254 dan UV 366. Kemudian pelat disemprot dengan penampak bercak, yaitu vanilin sulfat. Bercak diamati dan dicatat.

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLT Preparatif digunakan untuk memisahkan senyawa kamfen dalam jumlah gram. Pertama-tama dibuat pelat silika gel dengan penyangga kaca. Lalu sampel diteteskan ke pelat dengan alat syringe membentuk suatu pita. Lalu ditunggu hingga pelarut mencapai garis batas 1cm pada pelat. Lalu pelat dikeringkan, dan hasilnya dilihat menggunakan UV. Pita yang terbentuk ditandai menggunakan pensil lalu dikerok hingga didapat sejumlah senyawa kamfen.

Kromatografi Lapis Tipis 2 Arah KLT 2 Arah digunakan dalam rangka mengetahui kemurnia dari senyawa kamfen yang telah dipisahkan. Sampel kamfen dari hasil pengerokan KLT Preparatif dilarutkan dengan pelarut n-heksan. Lalu pelat KLT ditetesi sampel tersebut sebanyak 1 spot. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah berisi pengembang (n-heksan : etil asetat = 8 : 2) yang telah dijenuhkan. Kromatografi berakhir ketika bercak yang timbul mendekati batas atas pelat kromatografi (1 cm dari tepi). Lalu setelah itu, pelat diputar 90 derajat dan dimasukkan dalam chamber berisi Butanol, Asam Asetat dan Air sebanyak 7 ml. Kromatografi berakhir ketika bercak yang timbul mendekati batas atas pelat kromatografi (1 cm dari tepi).Sebelum disemprot, pelat dilihat pada UV 254 dan

UV 366. Kemudian pelat disemprot dengan penampak bercak, yaitu vanilin sulfat. Bercak diamati dan dicatat.

VI. Data pengamatan

Metode ekstraksi : Soxhlet Hasil percobaan : 1. Organoleptik Ekstrak Bentuk Warna Bau Rasa : Cairan : Cokelat Muda Kekuningan : Bau khas Jamu Kencur : Pahit

2. Rendemen Ekstrak Volume ekstrak kental Berat cawan kosong Berat cawan + ekstrak Berat simplisia awal Rendemen ekstrak ( : 700 : 157 : 164,86 : 150 : 10,07 ml g g g % b/b )

3. Bobot Jenis Ekstrak Berat piknometer kosong : 17,21 Berat piknometer + air Berat air Volume piknometer : 27,27 : 10,06 : 10 g g g ml

Kerapatan air

: 1,006

g/ml g ml g g/ml

Berat pinometer + ekstrak : 26,00 Volume piknometer Berat ekstrak Kerapatan ekstrak Bobot jenis ekstrak : 10 : 8,79 : 0,879 : 0,873

4. Pola Kromatogram Lapis Tipis Pengamatan No. Bercak 1 2 3 4 Rf Sinar Tampak 0,375 0,568 0,8125 0,875 Hijau tua Kuning Kuning Biru Muda Ungu Ungu Biru muda UV 254 nm UV 366 nm H2SO4 10 %

Hijau muda -

Gambar KLT ekstrak setelah penambahan vanilin sulfat.

6. Pola Dinamolisis

Keterangan: Diameter 1 Diameter 2 Diameter 3 :6 : 5,5 :3 cm cm cm ; warna kuning kebeningan ; warna kuning pucat ; warna kuning

7. Metode Pemisahan Ekstrak

Hasil KLT Fraksi setelah diberi penampak bercak vanilin sulfat:

1) KLT Fraksi Air Tidak dapat dideteksi spot dan Rf-nya karena bercak kurang jelas terlihat 2) KLT Fraksi Etil Asetat Tidak dapat dideteksi spot dan Rf-nya karena bercak kurang jelas telihat 3) KLT Fraksi N-Heksan

Pengamatan No. Bercak Rf Sinar Tampak UV 254 nm UV 366 nm H2SO4 10 %

1 No. Bercak

0,375 Rf

Biru

Pengamatan

Biru

0,0,625

Ungu kebiruan

Ungu kebiruan

8.) Metode Pemisahan Senyawa Kamfen Analilis Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Data analisis kromatografi lappis tipis preparatif: Penjerap Pengembang Penampak bercak : silika gel : n-heksan : etil asetat (8:2) : vanilin sulfat

Jumlah pita terbentuk : 2 No. Pita yang dikerok : Pita no. 2 yang memiliki Rf 0,8

9.) Metode Pemurnian Senyawa Kamfen Analisis KLT 2 Arah Penjerap: silika gel Eluen 1: n-heksan : etil asetat (8:2) Eluen 1: butanol : asetat : air Sampel : hasil pengerokan pita dari hasil KLT Preparatif

Sinar Tampak 1. 0,8 -

UV 254 nm Biru ber-ekor

UV 366 nm -

H2SO4 10% Biru Keunguan ber-ekor

Kromatogram KLT 2 Arah 10.) Rendemen Ekstrak Murni Berat cawan : 39,44 g

Berat cawan+ekstrak (awal): 38,44 g Berat cawan+ekstrak (akhir): 0,5 gram Rendemen ekstrak
( ( ) )

VII. Pembahasan Percobaan ini dilakukan untuk mengisolasi suatu senyawa dari simplisia tumbuhan obat. Tahap pertama yang dilakukan yaitu ekstraksi metabolit sekunder

dari simplisia Kaempferiae rhizoma (rimpang kencur). Simplisia yang digunakan untuk analisis fitokimia idealnya menggunakan bahan baku segar yang dididihkan dengan alkohol selama beberapa menit segera setelah dikumpulkan. Hal tersebut dimaksudkan untuk menonaktifkan enzim, supaya tidak terjadi reaksi enzimatis selama percobaan dilakukan. Namun pada praktikum ini, digunakan opsi lain yaitu tumbuhan dikeringkan terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi. Pengeringan yang dilakukan diusahakan hati-hati jangan sampai terjadi perubahan kimia, sehingga tidak mempengaruhi hasil isolasi senyawa tersebut. Ekstraksi adalah metode penarikan metabolit sekunder dari tumbuhan atau bagian tumbuhan dengan pelarut yang sesuai. Ekstraksi merupakan tahap awal pada jalur isolasi metabolit sekunder dari tumbuhan obat. Ekstraksi terbagi menjadi beberapa golongan metode sesuai dengan beberapa keadaan yang menyertainya. Penentuan metode ekstraksi disesuaikan dengan jaringan tumbuhan, kadar air dan golongan senyawa yang akan diisolasi. Pada percobaan ini, metode yang digunakan yaitu ekstraksi panas dengan cara soxhlet, karena senyawa yang akan diisolasi bersifat tahan pada suhu panas. Selain itu juga ekstraksi panas dengan cara soxhlet lebih mengefektifkan waktu karena hasil ekstraksi tidak perlu disaring lagi. Prinsip ekstraksi panas dengan cara soxhlet ini yaitu pelarut akan terkondensasi menjadi dingin lalu berbentuk molekul-molekul cair yang akan melewati simplisia dan mengikat senyawa yang sifat kepolarannya sama dengan pelarut. Sebelum percobaan dimulai, simplisia yang ada digerus hingga didapat partikel simplisia agak kecil (tidak terlalu halus) untuk memperluas permukaan, sehingga interaksi antara cairan penyari dengan permukaan simplisia lebih banyak, disamping itu juga berfungsi untuk memecah dinding sel, sehingga cairan penyari dapat masuk ke dalam sel dan mengekstraksi lebih banyak metabolit sekunder. Cairan penyari akan masuk ke dalam dinding sel dan rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di

dalam sel dan di luar sel, maka larutan yang terpekat akan didesak keluar. Penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk yang bersentuhan dengan cairan penyari semakin luas. Dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip polar loves polar, nonpolar loves nonpolar, maksudnya pelarut hanya boleh melarutkan senyawa yang diinginkan, bukan komponen-komponen lain dari bahan ekstraksi. Jika senyawa yang akan diekstraksi bersifat polar maka pelarut yang digunakan bersifat polar, begitupun jika akan mengekstraksi senyawa nonpolar, pelarut yang digunakan harus bersifat nonpolar. Pada percobaan ini, pelarut yang digunakan yaitu etanol karena merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi tahap awal dan dapat digunakan untuk menghilangkan klorofil yang terdapat pada simplisia. Pada ekstraksi pertama klorofil akan tertarik dan pada ekstraksi selanjutnya diharapkan simplisia telah bebas dai klorofil. Selain itu juga etanol merupakan pelarut universal karena dapat menarik hampir semua senyawa di simplisia sehingga diperoleh ekstrak total. Keuntungan lain etanol sebagai pelarut karena bersifat polar dan tidak bersifat toksik, lebih selektif, dan memiliki daya absorpsi yang baik. Etanol sebagai pelarut organik polar akan menarik komponen utama metabolit sekunder dalam simplisia yang bersifat polar. Hal ini sesuai dengan prinsip like dissolve like. Pelarut yang bersifat polar akan melarutkan komponen- komponen metabolit sekunder yang bersifat polar pula, sedangkan pelarut yang bersifat nonpolar akan cenderung melarutkan komponen metabolit sekunder yang bersifat nonpolar. Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakuinon, flavonoid, steroid, damar, dan klorofil. Lemak, malam, tanin, dan saponin hanya akan larut sedikit. Dengan demikian, zat pengganggu yang larut hanya terbatas. Di samping itu, etanol merupakan senyawa yang mudah menguap, sehingga pada proses pemekatan (evaporasi) waktu yang dibutuhkan lebih sedikit dibandingkan dengan menggunakan pelarut air.

Pertama-tama, serbuk simplisia ditimbang sebanyak 150 gram lalu disiapkan dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung soxhlet. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam kertas saring whatman bertujuan untuk menahan simplisia agar tidak jatuh ke labu alas bulat yang dibawah dan hanya senyawa yang diinginkan yang akan terikat pelarut, bukan komponen lain dari simplisia. Isi labu alas bulat dengan etanol 70% sampai kurang lebih bagian volume labu dan tambahkan batu didih agar tidak meletup saat ekstraksi dilakukan. Pasang kondensor dibagian atas tabung soxhlet dan labu alas bulat dibagian bawah. Nyalakan heating mantle sampai suhu mencapai C agar tidak merusak

simplisianya. Pemanasan yang dilakukan pada simplisia dilakukan tidak lebih dari C. Ekstraksi ini dilakukan sampai tetesan pelarut hampir tidak berwarna, yang menunjukkan bahwa ekstrak pada simplisia sudah terbawa ke bawah. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan sampai kental dengan penguap vakum putar pada tekanan rendah (rotavapor). Pelarut akan dipisahkan dari ekstrak dan ditampung pada tempat khusus. Ekstrak kental yang diperoleh dilakukan pemeriksaan kualitas ekstrak yang meliputi parameter kimia dan fisika seperti organoleptik, pola kromatogram (lapis tipis dan dinamolisis), kadar air dan bobot jenis ekstrak. Pengamatan organoleptik ekstrak bertujuan untuk mengetahui bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak. Dapat dilihat ekstrak berupa larutan berwarna cokelat muda kekuningan, memiliki bau khas kencur dan rasa pahit. Rendemen ekstrak dapat ditentukan dengan menempatkan sejumlah tertentu ekstrak kental ke cawan penguap, ditimbang, lalu diuapkan di atas penangas air dengan temperatur C sampai bobot tetap. Temperatur diatur

C agar tidak merusak ekstrak. Berat ekstrak ditentukan setelah penguapan dengan mengurangkan dengan bobot cawan kosong kemudian rendemen dihitung. Didapatkan rendemen ekstrak dari simplisia Kaempferiae rhizoma sebesar 5,24% b/b.

Untuk penetapan bobot jenis ekstrak, dapat dilakukan dengan menimbang piknometer dalam keadaan kosong. Selanjutnya piknometer diisi dengan air dan ditimbang ulang. Kerapatan air dapat ditetapkan. Piknometer dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak, lalu ditimbang. Melalui berat ekstrak yang mempunyai volume tertentu, dapat ditetapkan kerapatan ekstrak. Bobot jenis ekstrak yang diperoleh yaitu 0,873. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan parameter ekstrak melalui pola Kromatografi Lapis Tipis untuk mengamati pemisahan isolat yang terkandung dalam simplisia Kaempferiae rhizoma. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan fasa diam silika gel GF 254 dan fasa gerak atau pengembangnya kombinasi pelarut dengan perbandingan yang cocok. Silika gel GF 254 bersifat polar karena mempunyai gugus hidroksil. Adapun pengembang yang digunakan yaitu n-heksan: etil asetat dengan perbandingan 8:2 sesuai data yang diperoleh dari literatur. N-heksan bersifat nonpolar sedangkan etil asetat bersifat semi polar. Pelat silika gel disiapkan dengan ukuran 10 cm, lalu masing-masing ujungnya diberi garis 1 cm dari masingmasing sisi. Kemudian ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan pipa kapiler, biarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap. Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan menaik (ascending), yang mana ujung bawah lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan reprodusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak (chamber) harus dijenuhkan dengan uap fase gerak.

Proses penutulan dilakukan tidak terlalu tipis agar bercak yang diperoleh dapat terlihat jelas. Pelat silika kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan pengembang (n-heksan:etil asetat). Proses kromatografi dihentikan sampai cairan pengembang tiba di garis depan. Selanjutnya amati pola kromatogram dibawah lampu UV 254 dan 366 nm dan hitung Rf setiap bercak. Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan

tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Adapun pada UV 366 nm noda akan

berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm. Penampak bercak yang digunakan pada percobaan ini yaitu vanillin sulfat. Pada pengamatan dibawah lampu sinar UV tidak terlihat adanya bercak. Hal ini disebabkan karena pada saat proses penutulan sangat tipis, sehingga perlu digunakan penampak bercak. Setelah disemprot dengan penampak bercak vanillin sulfat, dapat terlihat bercak berwarna ungu kebiruan dan diperoleh nilai Rf 0,375 ; 0,0568; 0,8125 dan 0,875. Pada literatur, nilai Rf untuk senyawa kamfen ini yaitu antara 0,3 hingga 0,8. Pemeriksaan parameter ekstrak yang terakhir dilakukan pada percobaan ini yaitu pola dinamolisis. Dinamolisis dilakukan untuk memberikan gambaran secara kualitatif dari kandungan kimia yang terdapat dalam ekstrak karena masing-masing ekstrak memiliki pola dinamolisis yang berbeda. Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara menyiapkan kertas saring whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi, kemudian pasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring bersumbu ini kemudian ditutupkan pada cawan petri yang berisi ekstrak cair. Biarkan terjadi proses difusi sirkular selama kurang lebih 10 menit. Didapatkan hasil dinamolisis

pada diameter 1: 3cm berwarna kuning, pada diameter 2: 5,5 cm berwarna kuning pucat dan pada diameter 3: 6 cm berwarna kuning lebih pucat dari diameter yang ke 2. Pola ini menunjukkan karakteristik dari simplisia Kaempferiae Rhizoma. Tahap selanjutnya yang dilakukan yaitu memisahkan metabolit sekunder dari ekstrak atau fraksinasi tumbuhan obat dengan menggunakan metode ekstraksi cair-cair. Pada sistem pemisahan selalu berhubungan dengan tiga hal, yaitu sampel dan dua pelarut yang yang saling tidak bercampur satu sama lain. Sampel akan terpartisi atau terdistribusi ke dalam pelarut kedua pelarut dan pemisahan akan berakhir setelah terjadi kesetimbangan. Ada tiga macam penggolongan metode pemisahan yang didasarkan pada jenis kedua pelarut, jenis pelarut pertama (initial phase) dan pelarut kedua (second phase). Pada ekstraksi cair-cair, pelarut pertama dinamakan rafinat, dan pelarut kedua dinamakan ekstraktan. Ekstraksi cair-cair (corong pisah) merupakan pemisahan komponen kimia di antara 2 fase pelarut yang tidak saling bercampur di mana sebagian komponen larut pada fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua, lalu kedua fase yang mengandung zat terdispersi dikocok, didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna dan terbentuk dua lapisan fase cair, dan komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase tersebut sesuai dengan tingkat kepolarannya dengan perbandingan konsentrasi yang tetap. Sebanyak 0,5 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi metode soxhlet dilarutkan dalam 50 ml aquadest. Cara melarutkannya adalah pada ekstrak tersebut ditambahkan sedikit demi sedikit aquadest sampai ekstrak tercampur homogen. Masukkan larutan ekstrak ke dalam corong pisah dan tambahkan nheksan sebanyak 50 ml. Kocok larutan dalam corong pisah dengan seksama sambil sesekali udara dalam corong dikeluarkan. Diamkan larutan dalam corong pisah sampai kedua pelarut terpisah sempurna dan pisahkan lapisan n-heksan. Ulangi proses pengocokan sebanyak sampai diperoleh fraksi n-heksan yang hampir tidak

berwarna. Lapisan air dalam corong pisah kemudian dikocok kembali dengan pelarut etil asetat dengan cara yang sama seperti dengan pelarut n-heksan. Fraksi-fraksi diperoleh berdasarkan tingkat kepolarannya. Fraksi air mengikat senyawa polar pada ekstrak, fraksi etil asetat mengikat senyawa semipolar pada ekstrak dan fraksi n-heksan mengikat senyawa nonpolar pada ekstrak. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang telah diperoleh dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis menggunakan penjerap silika gel GF 254 dan pengembangnya pelarut campuran n-heksan:etil asetat (7:3). Dari hasil KLT fraksi, yang menunjukkan adanya bercak yaitu pada fraksi n-heksan dengan Rf 0,625 , bercak berwarna ungu biru. Fraksi n-heksan selanjutnya diuapkan dan dianalisis menggunakan KLT preparatif. KLT Preparatif digunakan untuk memisahkan senyawa kamfen dalam jumlah gram. Sampe yang digunakan adalah sampel fraksi n-heksan. Karena senyawa kamfen cenderung bersifat non polar, dan menurut KLT Fraksi, senyawa ini terdapat Fraksi n-heksan. Maka dipilihlah Fraksi ini sebagai sampel pada KLT preparatif. Pertama-tama dibuat pelat silika gel dengan penyangga kaca. Pelat silika gel dibuat dengan cara kaca dibersihkan dahulu kemudian kaca diatur diatas alat Desaga dengan aseton supaya bebas dari lemak. Hal ini bertujuan agar zat pengotor seperti lemak tidak mempengaruhi partisi dari senyawa yang dapat mempengaruhi pengamatan terbentuknya pita. Lalu bubur silika gel dan air suling dikocok dalam labu erlenmeyer kemudian bubur dituang diatas kaca, lalu segera dibalik diatas kaca pertama kemudian diratakan . Kemudian pelat dibiarkan hingga mengering pada suhu kamar lalu dikeringkan bila perlu dengan oven pasa duhu 110-120 derajat celcius selama 1-2 jam. Pada percobaan kali ini, praktikan langsung mendapatkan pelat silika gel penyangga kaca tanpa melakukan rangkaian prosedur tersebut. Kemudian, sampel diteteskan ke pelat dengan alat syringe membentuk suatu pita. Lalu pelat dimasukkan dalam pelarut n-heksan : etil asetat ( 8 : 2 ) lalu

ditunggu hingga pelarut mencapai garis batas 1cm pada pelat. Kemudian pelat dikeringkan, dan hasilnya dilihat menggunakan UV. Pita yang terbentuk ditandai menggunakan pensil lalu dikerok hingga didapat sejumlah senyawa kamfen. Pita yang terbentuk pada hasil KLT Preparatif dibawah sinar UV 254 nm berjumlah 2 pita. Pita atas dan pita bawah, lalu untuk pengerokan dipilih pita bagian bawah karena memiliki Rf sebesar 0,8 sedangkan Pita atas memiliki Rf 0,9. Karena rentang Rf senyawa kamfen pada rentang 0,3 0,8 maka dipilih pita bawah yang dikerok untuk selanjutnya dilakukan KLT 2 Arah. KLT 2 Arah digunakan dalam rangka mengetahui kemurnian dari senyawa kamfen yang telah dipisahkan. dengan asumsi bahwa bercak yang terdapat dari eluen pertama dan kedua pada dua arah tetap (tempat dan warna tidak berubah), berarti sampel yang digunakan sudah cukup murni. Sampel kamfen dari hasil pengerokan KLT Preparatif dilarutkan dengan pelarut n-heksan. Lalu pelat KLT ditetesi sampel tersebut sebanyak 1 spot. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah berisi pengembang (n-heksan : etil asetat = 8 : 2) yang telah dijenuhkan. Kromatografi berakhir ketika bercak yang timbul mendekati batas atas pelat kromatografi (1 cm dari tepi). Lalu setelah itu, pelat diputar 90 derajat dan dimasukkan dalam chamber berisi Butanol, Asam Asetat dan Air sebanyak 7 ml. Kromatografi berakhir ketika bercak yang timbul mendekati batas atas pelat kromatografi (1 cm dari tepi).Sebelum disemprot, pelat dilihat pada UV 254 dan UV 366. Kemudian pelat disemprot dengan penampak bercak, yaitu vanilin sulfat. Namun pada saat pengamatan, terlihat bahwa spot yang terdapat dalam pelat tidak merupakan suatu titik, namun merupakan spot berekor yang berwarna ungu. Dapat dikatakan bahwa sampel tersebut belum cukup murni, karena pada spot masih terdapat ekor yang merupakan pertanda bahwa terdapat senyawa lain yang terdapat dalam sampel hasil KLT Preparatif. Hal ini dapat terjadi karena berbagai faktor. Pertama kemungkinan adalah karena kekurangterampilan praktikan dalam melakukan KLT Preparatif, yang

memungkinkan masuknya zat kontaminan saat dilakukan pengerokan sehingga senyawa kamfen tidak murni lagi. Atau karena pemakaian lat-alat yang kurang bersih, seperti spatel yang berminyak, botol vial yang masih terdapat zat pengotor, dan sebagainya yang dapat mempengaruhi sifat larutan sampel sehingga analisis pemurnian senyawa kamfen memberikan hasil yang kurang optimal. Setelah dilakukan KLT 2 Arah, selanjutnya dilakukan penguapan dari sampel larutan yang diduga murni, untuk dihitung rendemennya. Rendemen yang didapat adalah sebanyak 0,9%

VIII. Kesimpulan dan Saran a.Kesimpulan Metabolit sekunder kamfen dari rimpang kencur (Kaempferia galanga) dapat diisolasi namun memberikan hasil kurang optimal pada analisis pemurniannya.

b.Saran Karena jumlah penelitian mengenai kamfen begitu minim, sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai karakteristik senyawa kamfen dan bentuk sediaan yang sesuai pada pembuatan obat dari bahan alam menggunakan zat kamfen serta efek farmakologi zat tersebut.

Daftar Pustaka