Cultivos celulares y sus aplicaciones

Instituto de Oncologa Angel H. Roffo rea de Investigacin Dpto. Biologa Celular

El cultivo celular

Tc. Alicia Rivelli

Breve introduccin histrica

En 1907 el Dr. Harrison cultiv clulas del tubo neural de embrin de rana En 1910 el Dr. Burrows cultiv explantos de tejido de embrin de pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de clulas de mamferos. Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre clulas cultivadas. En 1952 se establece la lnea celular HeLa (primera lnea celular de origen humano) Durante la dcada del 70 los cultivos celulares se incorporan a la ingeniera gentica. En 1975 los Drs. Koehler y Milstein establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales. En los ltimos aos la aplicacin de la tecnologa del cultivo celular a permitido grandes avances en la comprensin de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.

Para qu cultivar clulas in vitro?

ESTUDIOS DE INVESTIGACIN: comprender la fisiologa celular, toxicologa, y virologa.
INGENIERIA DE TEJIDOS: transplantes , injertos (piel, hgado, hueso, cartlago). PRODUCCIN DE BIOLOGICOS: anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.) CITOGENTICA: estudios cromosmicos. TRANSGENICOS: organismos genticamente modificados.

Diferentes tipos de cultivos de tejidos:

Cultivo de rganos: mantenimiento de rganos o parte de rganos in vitro (por ejemplo corazn).
Cultivo de tejidos y explantes: mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de clulas

Cultivo de clulas:

Se define como el conjunto de tcnicas de aislamiento de clulas y obtencin de poblaciones celulares in vitro, manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.

Diferentes tipos de cultivos celulares

Primario: iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un organismo. Lneas celulares: se origina del cultivo primario, a partir del primer subcultivo exitoso. Lnea celular continua: clulas que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida infinita.

Cultivo primario:
Pasos: Aislamiento del tejido de inters.
Disociacin mecnica y enzimtica del tejido Obtencin de la suspensin celular. Siembra en soporte adecuado para la proliferacin en monocapa o en suspensin.

Subcultivos

Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (mxima proliferacin posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porcin clulas y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).

Crecimiento celular:

En monocapa Las clulas crecen

En suspensin

Clulas en monocapa

Los cultivos cuyas clulas son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de clulas adheridas al plstico o vidrio. Para despegar las clulas se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.

Clulas en monocapa

Clulas en suspensin

Las clulas que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (caracterstico de clulas hematopoyticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente. El repique se realiza mediante una dilucin de la suspensin celular.

Lneas celulares continuas

BHK: fibroblastos de rin hmster cirio dorado. CrFK: fibroblasto de rin gato domstico. MDCK: epitelio de rin canino. CHO: epitelio de ovario de hmster chino. HeLa: epitelio tumoral de cuello uterino humano. MDBK: epitelio de rin adulto. HUVEC: endotelio de vena umbilical humana

Lnea celular LM3

Lnea celular establecida a partir de pasajes sucesivos in vitro de un cultivo primario del adenocarcinoma mamario murino M3. El adenocarcinoma mamario M3 surgi espontneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del Instituto de Oncologa ngel H. Roffo. Las clulas LM3 presentan un fenotipo altamente invasivo y metastsico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo muestran una morfologa epitelial polidrica

ABAC
Asociacin Banco Argentino de Clulas
Desde 1987 mantiene y administra lneas celulares en distintos centros de investigacin, proveyendo clulas congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.

Mantenimiento de lneas celulares

Repique o pasaje: para mantener las clulas en cultivo. Congelacin (criopreservacin): para preservar las clulas a lo largo del tiempo (aos) y mantener un stock para los prximos usos.

Criopreservacin

Tcnica:

Se levanta la monocapa por tripsinizacin Se obtiene una suspensin celular. Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min, para separar la fraccin celular del medio de cultivo. El pellet celular se resuspende en medio de congelacin (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol anticongelantes-)

Criopreservacin

Se fraccionan en criotubos. Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en heladera y luego se la lleva a freezer -80C durante 24-48 hs Se guardan en tanque de nitrgeno lquido

Componentes del medioambiente del cultivo:

Medio de cultivo:( aporta nutrientes, vitaminas etc.)
Suplementos: (ej suero que aporta factores de crecimiento)

pH: ( ej: 7,4 )

Temperatura: (ej. 37 C) Gas: Dixido de carbono (ej. 57%)

Soportes: materiales adecuados para el crecimiento (ej vidrio, plstico, biolgicos etc.)

Medios de cultivo

Suplementos

Atmsfera y temperatura

Estufa de cultivo con atmsfera de Dixido de carbono

Soportes

Estriles Generalmente se utiliza material de plstico:

Soportes

Biolgicos:

El laboratorio de cultivo celular

Adems del equipamiento usual se requiere: Microscopios: invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.

El laboratorio de cultivo celular

Flujo Laminar o campana de seguridad biolgica: mantienen la esterilidad del rea de trabajo.

El laboratorio de cultivo celular

-

Espacios fros: Heladeras (4C) Freezer (-20, -40,-80 C) Tanque de Nitrgeno Liquido (- 196C)

El laboratorio de cultivo celular

Factores crticos

No biolgicos: orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc. Biolgicos: CONTAMINACIONES La contaminacin puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos tiene efectos adversos

Contaminaciones Biolgicas

Microorganismos: Bacterias Hongos/Levaduras Mycoplasmas

Otras clulas

Contaminaciones Biolgicas

Efectos adversos sobre el metabolismo celular Pobre calidad de resultados experimentales Prdida de clulas valiosas Prdida de productos celulares (por ejemplo produccin de antgenos para vacunas, etc.) Prdida de tiempo, dinero y esfuerzo

MUCHAS GRACIAS!!!

Aplicaciones en Oncologa

Tc. Silvina Romero

Instituto de Oncologa Angel H. Roffo

Aplicaciones de los cultivos celulares en la Investigacin en cncer

Investigacin en Oncologa

Se realizan ensayos tendientes a:

Caracterizar el comportamiento de las clulas tumorales in vitro e in vivo.

Revertir la agresividad tumoral mediante drogas y herramientas genticas tanto in vitro como in vivo.

Introduccin

El cncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de clulas, con crecimiento y divisin ms all de los lmites normales, invasin del tejido circundante y, a veces, metstasis. La metstasis es la propagacin a distancia de las celulas tumorales, por va linftica o sangunea, lo que implica el crecimiento de nuevos tumores en un lugar diferente al tumor original (primario). Estas propiedades diferencian a los tumores malignos de los benignos, que son limitados y no producen metstasis.

Celulas normales vs tumorales

Clulas normales

Clulas tumorales

Caractersticas de las clulas tumorales

Cambios

en el citoesqueleto: estos cambios

afectan:
1.

2.

Forma (pleomorfismo): cambio de en la morfologa y tamao del citoplasma. Adhesin/ Movilidad: la reduccin de la adhesin entre clulas y con la matriz celular facilita la movilidad celular favoreciendo la aparicin de metstasis

Caractersticas de las clulas tumorales

Cambios nucleares: tiene valor diagnstico

Nmero: celulas multinucleadas Forma: mas grandes o mas pequeos Organizacin de los ncleos: (nucleolos prominentes) Hipercromasia: por la presencia de mayor cantidad de ADN.

Caractersticas de las clulas tumorales

Produccin de enzimas proteolticas: permiten invadir los tejidos adyacentes facilitando la migracin y la propagacin de las clulas tumorales.

Caractersticas de las clulas tumorales

Grado de diferenciacin celular: las clulas neoplsicas por su alta tasa de proliferacin se desdiferencian parecindose al tipo celular que le dio origen. Alteraciones en el crecimiento: crecen de manera desordenada, pierden la polaridad celular y no respetan lmites por contacto clula-clula. Resistencia a la apoptosis: muerte celular programada

Biologa Molecular del Cncer

La transformacin maligna implica la adquisicin progresiva de una serie de cambios genticos y bioqumicos especficos que actan desobedeciendo los fuertes mecanismos antitumorales presentes en las clulas normales.

Investigacin en Oncologa

Se trabaja con dos modelos

Celulares: Lneas celulares cancergenas vitro)

(in

Animales de experimentacin: Ratones (in vivo) a los cuales por inyeccin de la celulas tumorales se les genera la enfermedad experimentalmente.

Estudios in vitro

Investigacin en Oncologa

Lineas celulares tumorales usadas en nuestro laboratorio.

LM3 : Ca mamario murino MCF7: Ca mamario humano MB49: Ca de vejiga murino T24: Ca de vejiga humano LP07: Ca de pulmn murino Entre otras

Estudios celulares

Estudios celulares:

Morfolgicos Funcionales

Mixtos
Cromosmicos

Estudios Morfolgicos:

Observacin en fresco o post fijacin (formol neutro) de monocapas celulares, en microscopio ptico invertido, contraste de fase, fluorescencia etc.

Estudios funcionales:
1. 2.

3.
4. 5.

6.

Viabilidad celular Adhesin * Ensayos clonognicos* Migracin* Actividad enzimtica* Citotoxicidad

*evalan la capacidad
invasiva y metastsica.

Estudios funcionales:
1- Viabilidad celular:

Se siembra en placas multipozo una cantidad conocida de clulas Se las somete a hambreado colocando medio de cultivo sin suero (SFB) durante 72hs Se evala la actividad celular (viabilidad) por fotocolorimetra. La produccin del color se debe a la metabolizacin del reactivo (MTS) llevado a cabo por las clulas vivas.

Estudios funcionales:
1- Viabilidad celular:

Estudios funcionales:
2- Ensayo clonognico en agar:

Capacidad de crecer en un medio independiente de anclaje .

Formacin de colonias celulares a partir de una nica celula.

Estudios funcionales:
2- Ensayo clonognico:

Estudios funcionales:
3- Migracin:
Ensayo de cicatrizacin de heridas
Se realiza una herida en la monocapa y se deja a

las clulas crecer durante un tiempo determinado en presencia de tratamientos o condiciones especficas. La migracin se evaluar a travs del porcentaje de cubrimiento del rea inicial.

Estudios funcionales:
3- Migracin:
Ensayo de cicatrizacin de heridas

Tipo celular 1

Tipo celular 2

Tipo celular 3

Estudios funcionales:
4- Citotoxicidad celular:

Se utiliza para encontrar la dosis justa de drogas o reactivos que generen el efecto deseado sin daar la monocapa. Se puede buscar la muerte de la totalidad de las clulas (ej. Drogas quimioterpicas).

Estudios funcionales:
5- Citotoxicidad celular:

Igual cantidad de celulas en cada posillo. Dosis creciente de reactivo o droga El resultado se evalua con una curva dosis respuesta.

Estudios mixtos

Mofolgicos y funcionales: Inmunofluorescencia: empleo de

Ac.fluorescentes

Estudios cromosmicos

Cariotipo: estudia la morfologa y nmero de los cromosomas

Nos da una idea de la evolucin de los cultivos celulares.

Estudios cromosmicos
Regiones homogneamente teidas

Translocaciones

Estudios Moleculares

Estudios Moleculares

Se utiliza:

Lisados celulares: el producto de la destruccin celular y purificacin de la fraccin a utilizar (protenas, cidos nucleicos, etc) Partes celulares: obtencin de ncleos, citoplasmas, membrana celulares etc. Medios condicionados: se utilizan los medios en los que crecieron las clulas y se estudian factores de crecimiento, protenas, etc. secretadas al exterior.

Electroforesis en gel
Fundamento: Migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico estas partculas migran hacia el polo o positivo+ segn la combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.

Utilidades: Separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas. Aportan un potente criterio de pureza

Electroforesis en gel:
Gel de Poliacrilamida: para separar protenas.

Gel de Agarosa: para separar cidos Nucleicos.

Separacin de molculas Electroforesis en gel

Estudios Moleculares

Biomolculas mas importantes en investigacin:

ADN ARN PROTEINAS

Estudios del ADN

Electroforesis en gel

El ADN extrado por lisis celular, se corta con enzimas para obtener diferentes fragmentos. Se realiza la corrida electrofortica en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN e identificarlos segn su peso (kb) Luego de la electroferesis, se tie el gel con colorantes que emiten fluorescencia al ser excitado con luz UV:

Estudios del ADN

Colorantes fluoerescentes

BROMURO DE ETIDIO: altamente txico y mutagnico.

Estudios del ADN

Colorantes fluoerescentes
SYBR green, SYBR safe, SYBR gold. No es mutagnico ni txico.

Estudios del ADN

PCR:
Reaccin en cadena de la Polimerasa

Usos: Deteccin de mutaciones Amplificacin de genes de inters Estudios diagnsticos

Estudios del ADN

Transfeccin:
Introduccin de un fragmento de ADN externo a una clula animal. Para qu?

Caracterizar oncogenes Confirmar la identidad de genes Sntesis de ARN Expresin de protenas, etc Estudio de sntesis y transporte intracelular

Cmo se introduce el ADN a la clula?

Una de tcnicas es usando virus. El proceso se llama INFECCIN Una vez que el virus infecta las clulas en cultivo: 1. El fragmento de ADN de inters pasa del citoplasma al ncleo celular. 2. Se expresa produciendo el efecto deseado. 3. El ADN puede incorporarse en las clulas transfectadas de dos formas: Momentnea: transfeccin transiente. Llevada a cabo por Adenovirus Estable: implica la integracin del ADN genoma celular. Retrovirus.

Seleccin de las clulas transfectadas

Junto con el ADN a insertar se incorporan genes que nos permiten identificar en cultivo a las clulas transfectadas. Genes mas utilizados: Resistencia a antibiticos: Hygromicina G418 Las clulas que no incorporaron el ADN durante la transfeccin mueren al colocar estos atb.

Permiten la expresin de GFP (protena verde fluorescente)

Protena verde fluorescente GFP

Cultivos celulares Animales de laboratorio

La protena GFP fluorece bajo luz UV, la presencia esta protena en la clula nos da la idea de una transfeccin exitosa: si est la protena en la celula tambin esta nuestro ADN de inters.

Estudios de ARN

Electroforesis en gel:

Gel tenido con BrEt y mirado con UV

Estudios de ARN

Recientemente: Transfeccin con ARN ARN interferente

Suprime la expresin de un gen en particular. Es un ARN complementario al ADNm y al unirse a ste promueve su degradacin.

Estudios de Protenas

Se usan lisados celulares Sirve para identificar, cuantificar y evaluar la funcin de protenas como:

Enzimas Protenas estructurales Receptores

Sirve para evaluar indirectamente la funciones de genes a travs de su producto: Las Protenas!

Estudios de Protenas: Western Blot

Western Blot

Western Blot

Para la identificacin de la protena de inters se utiliza un marcador de peso molecular, que indica PM correspondiente a cada altura del gel.

Western Blot

Estudios In vivo

Investigacin en Oncologa

Animales de experimentacin: contamos con un bioterio con cria propia de ratones.

BALB/C

C57 B16/ J-GFP

Estudios in vivo

Objetivo: Estudiar el comportamiento in vivo de los modelos celulares que generados in vitro. Metodologa: Inyeccin subcutnea, endovenosa, intraperitoneal, etc., de las clulas en estudio. Colocacin de parches de las drogas en estudio en ratones a los cuales se les provoc experimentalmente la enferemdad.

Estudios in vivo

Se evala: Capacidad tumorignica: porcentaje de toma tumoral. Capacidad metastsica espontnea: produccin de metstasis por inoculacin de celulas tumorales in situ. Capacidad metastsica experimental: produccin de metstasis por inoculacin ev de las clulas en estudio.

Estudios in vivo
Capacidad tumorignica

Estudio in vivo

Metstasis experimentales: - via e.v. - 21 das post inyeccin se

cuentan las mts pulmonares

Aplicaciones en otros campos

Otras aplicaciones:

Virologa:

Aislamiento y multiplicacin de virus Produccin de vacunas Estudio y produccin de antivirales Deteccin de virus desconocidos Estudios de oncognesis viral

Otras aplicaciones:

Transplantes/Injertos: Cultivo de piel Cultivo de celulas stem (pluripotentes) Cultivo de islotes pancreaticos, hepatocitos, etc

Otras aplicaciones:

Fertilizacin in vitro Produccin de biolgicos (proteinas, anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas). Produccin de transgnicos: GMOs (organismos geneticamente modificados: soja, arroz, ovinos, caprinos, etc.) Transgenesis parcial: Terapia gnica en humanos.

Agradecimientos:

rea de Investigacin Instituto Roffo: - Dra Lydia Puricelli - Dr Martin Krasnapolski - Lic. Maria Ines Diaz Bessone - Lic. Denis Belgoroski

MUCHAS GRACIAS!!!