TUGAS PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN DAN ELEKTROMETRI PERCOBAAN 5 PENENTUAN KADAR Cr DENGAN HPLC KELOMPOK 13 AVRINA KUMALASARI M0311015

1. Prinsip kerja HPLC Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien. Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

2. Keuntungan HPLC Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

Kolom dapat digunakan kembali. Waktu analisa cukup singkat. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

3. Perbedaan HPLC dengan GC HPLC mempunyai beberapa keunggulan daripada GC diantaranya : a. Dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile), isolasi zat secara termal tidak stabil, pemisahan senyawa anorganik, dan dapat dioperasikan pada suhu kamar. b. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. HPLC Fasa diam GC

Fisa diam berupa adsorben yang tidak Fasa diam berupa suatu cairan boleh larut dalam fasa gerak. bertitik didih tinggi dan proses

Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10 mm) serapannya lebih banyak berupa dan tekanan sampai 6000 psi. Ukuran partisi yang berupa padatan dan yang kecil dari fasa diam menyebakan adsopsi fasa diam mempunyai luas permukaan utama. yang besar, keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien memainkan peranan

pemisahan dipertinggi. Fasa gerak Fasa gerak merupakan suatu cairan. fase gerak adalah gas seperti helium, hidrogen, atau nitrogen.

Kolom

Ada 2 tipe:

Ada dua tipe utama kolom dalam gas-cair. Tipe

- Kolom analitik dengan performance kromatografi tinggi, diameter dalam 1-6 mm - Kolom preparative, diameter lebih besar

pertama, tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe

Tabung kolom dibuat dari kaca dan baja kedua, lebih tipis dan memiliki tahan karat. Panjang kolom 0,3-6 meter fase diam yang berikatan dengan atau lebih, rata-rata 0,9 m. Kolom yang pada lebih panjang akan bagian terdalam

menghasilkan permukaannya.

resolusi bertambah baik, tetapi perlu Kolom biasanya dibuat dari baja tekanan tinggi. Tabung kolom dapat tak berkarat dengan panjang

dikelilingi selubung air (water jacket) antara 1 sampai 4 meter, dengan untuk pengaturan suhu. Jenis isi kolom diameter internal sampai 4 mm. (kemasan kolom) tergantung cara Kolom digulung sehingga dapat

kromatografi yang dipakai (adsorpsi, disesuakan dengan oven yang partisi, atau penukaran ion). terkontrol secara termostatis. Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi Ada beberapa tipe detektor yang substansi yang telah melewati kolom. biasa digunakan. Detektor

Metode umum yang mudah dipakai ionisasi nyala merupakan detektor untuk menjelaskan yaitu penggunaan yang umum dan lebih mudah serapan ultra-violet. untuk detektor dijelaskan alternatif daripada lainnya.

Dalam mekanisme reaksi detektor ionisasi Detektor nyala, pembakaran

senyawa organik merupakan hal

yang paling banyak digunakan adalah yang sangat kompleks. Selama detektor fotometer sinar tampak atau proses, sejumlah ion-ion dan sinar ultraviolet, dan detektor indeks elektron-elektron bias. Fungsi adanya mengukur detektor untuk dihasilkan

dalam nyala. Kehadiran ion dan mendeteksi elektron dan dapat dideteksi.

komponen

cuplikan,

banyaknya

komponen. Seluruh detektor ditutup dalam

Syarat-syarat yang baik detektor adalah oven yang lebih panas dibanding mempunyai kepekaan tinggi, gangguan dengan temperatur kolom. Hal itu noise sedikit, daerah respon linear cukup menghentikan kondensasi dalam luas, memberikan respon terhadap detektor.

semua tipe senyawa, dan tidak peka terhadap perubahan kecepatan aliran dan perubahan suhu.

Jumlah sample

Sampel cuplikan harus dimasukkan ke Sample harus mudah menguap dalam kolom sebagai lapisan setipis dan memiliki kstabilan termal mungkin. Ukuran sampel sekitar 1-20 pada suhu pengoperasian. Sampel mL. Dua cara untuk melakukan injeksi: dimasukkan ke dalam aliran gas cara injeksi dan katup pemasukan melalui cuplikan mikro (micro-sampling valve) lubang injeksi yang

terletak pada bagian atas kolom. Suatu aliran gas yang sinambung mengelusi komponen-komponen dari kolom dan detektor dengan kemudian yang suatu Berikut

mencapai dihububngkan sistem diagramnya

pencatat.

Prinsip pemisahan Prinsip kerja

Mula-mula

solven

diambil

melalui Ada

tiga

hal

yang

dapat molekul

/ pompa Solven ini kemudian masuk ke berlangsung

pada

dalam katup injeksi berputar, yang tertentu dalam campuran yang dipasang tepat pada sample loop. diinjeksikan pada kolom: Molekul dapat berkondensasi

Dengan pertolongan mikrosiring, sample -

dimasukkan ke dalam sample loop yang pada fase diam. kemudian bersama-sama dengan solven Molekul dapat larut dalam

masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan cairan pada permukaan fase diam dideteksi oleh detektor yang ditampilkan Molekul dapat tetap pada fase

oleh perekam/recorder. Tekanan solven gas diatur dengan pengatur dan pengukur Dari ketiga kemungkinan itu, tak tekanan. Pompa memasok solven pada satupun yang bersifat permanen. tekanan konstan hingga tekanan 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni Hasil beberapa milliliter per menit. urutan akan direkam sebagai setiap

puncak-puncak;

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak mewakili satu senyawa puncak-puncak, dimana masing-masing dalam campuran yang melalui puncak mewakili satu senyawa dalam detektor. campuran yang melalui detektor dan mengontrol Sepanjang secara anda hati-hati

menerap sinar UV. Sepanjang anda kondisi dalam kolom, anda dapat mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan menggunakan membantu waktu retensi waktu retensi

untuk untuk membantu mengidentifikasi

mengidentifikasi

senyawa senyawa yang tampak-tentu saja

yang diperoleh, tentunya, anda (atau anda atau seseorang lain telah

orang lain) sudah mengukur senyawa- menganalisa senyawa murni dari senyawa murninya dari berbagai berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

senyawa pada kondisi yang sama. Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat

menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa dihasilkan. yang telah melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor.

Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang hijau dalam gambar yang

disederhanakan.

melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang gambar adalah puncak

tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya. Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi

meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi dapat terbukti dari kolom dalam instrumen sehingga dapat digunakan jumlah relatif sedikit melalui untuk mengetahu berapa jumlah jumlah yang lama. Pengukuran

substansi yang dihasilkan meskipun area selain tinggi puncak dapat dalam jumlah kecil. dipergunakan dalam hal ini.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode

pendeteksinya.

4. Bagian-bagian HPLC dan jelaskan Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder. 1. Tandon (Reservoir) Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Gas terlarut tersebut antara lain oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu. Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum. Untuk memperoleh pemisahan yang optimum dianjurkan menggunakan solvent yang masih baru.

2. Pompa Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan: a) Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm) b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa. c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit. d) Dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. e) Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain : a. Reciprocating pump: Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang bergerak maju mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi. b. Displacement Pump: Terdiri dari semacam alat suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250 ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston. c. Pneumatic Pump: Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas. Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur secara manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua atau lebih solvent. Kemudian langkah selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system. Pompa perlu dirawat dengan baik, antara lain: a. Menggunakan solvent yang bebas debu/ partikulat. b. Pompa jangan dibiarkan kering, sehingga tidak terjadi geseran yang bisa mengakibatkan kebocoran pompa. c. Bila dalam solvent terdapat garam-garam, maka setelah selesai menggunakan alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest) sampai bersih kemudian dibilas dengan methanol agar

tidak terjadi pengendapan garam dalam dinding pompa. d. Jangan menjalankan pompa dalam keadaan kering.

3. Katup Injector Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem injeksi: a. Syringe Injection; Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai 1500 psi. b. Stop Flow Injection: Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke dalam ruang injeksi (atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan. Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali dan sampel akan terbawa. c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector) Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control system. Sampel ditaruh dalam wadah seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot secara otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak. Pada auto sampler ini dapat dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem injeksinya setelah melakukan injeksi.

4. Kolom (Column) a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom. Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel yang dibor halus atau dari gelas. Untuk yang dibuat dari gelas pada umumnya kurang terhadap tekanan, hanya dipakai di bawah 600 psi dan di pasaran tersedia bermacam-macam jenis kolom dari berbagai pabrik. Ukuran kolom antara 10 sampai 30 cm, berbentuk lurus, diameter dalam

4 sampai 10 mm dan ukuran partikel dalam kolom 5 sampai 10 um. Ada juga kolom dengan ukuran yang lebih kecil, panjang 3 sampai 7,5 cm; diameter dalam 1 sampai 4,6 mm, ukuran partikel 3 sampai 5 um. Dalam pemakaian yang berhati-hati, digunakan kolom pengaman (grand column) yang dipasang sebelum kolom analitik. Kolom ini berisi packing yang sama dengan kolom analitik, ukurannya kolom lebih pendek dengan partikel yang ukurannya lebih besar. Kolom ini akan menahan debu partikulat yang ikut terelusi sehingga umur kolom analitik lebih panjang. Contoh perbandingan waktu dan hasil kolom panjang dan pendek untuk campuran theobromine, theophyline, BHET, caffein yang menunjukkan bahwa kolom, pendek dapat memisahkan sampel hanya dalam waktu 120 detik (2 menit), sedang kolom panjang perlu waktu 6 menit. Kolom analitik ada pula yang dapat diatur suhunya. Sebenarnya yang diatur bukan kolomnya tetapi ruang dimana kolom ditempatkan. Ruang ini disebut column oven dan kolomnya disebut thermostat column. Dengan cara seperti ini dapat diatur suhu kolom 1000 sampai 1500. b. Jenis Column Packing (Isi Kolom) Ada dua jenis packing kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel pelliculer. Isi kolom yang berbentuk pellicular terdiri dari partikel berbentuk bola, non porous terbuat dari gelas atau polimer. Partikel ini dilapis dengan suatu lapisan tipis yang porous dari silika, alumina atau penukar ion. Pelapisan dapat dilakukan dengan penambahan phase diam yang akan ditahan oleh partikel secara absorbsi atau dengan jalan mereaksikan bagian permukaan partikel tersebut dengan bahan organik tertentu. Dari reaksi ini dihasilkan suatu lapisan permukaan yang mempunyai sifat tertentu. Lapisan yang terbentuk selanjutnya disebut phase terikat (bonded phase). Packing kolom yang berupa silika, permukaannya terdiri dari silika yang dihidrolisis, baik dengan pemanas atau perendaman dalam HCL sehingga gugus silanol bersifat polar. Untuk mendapatkan permukaan dengan gugus yang sifatnya non polar dapat diikatkan siloxane. Ini diperoleh dengan menghidrolisis permukaan silika dengan organochlorosilan.

5. Detektor Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis. a. Detektor UV Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat. 6. Recorder Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.

5. Macam-macam detector a. Detektor UV Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat.