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Laboratorio RM Consultores y asesores C. A.

Asentamiento Las Becerrinas parcela N 1Sector la Encrucijada, Municipio Santiago Mario del Edo Aragua, Centro Comercial Los Laureles planta alta, oficina 64 y 65. Cel.04168462974-04141498117.

MANUAL DE CALIDAD
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METODO MICROBIOLOGICO: Alimentos, Aislamiento e identificacin


Revisin 02

Fecha 18-07-2013

de salmonella. Covenin 1291-88

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INTRODUCCIN: La presente norma ha sido concebida para su aplicacin general en el campo de la microbiologa de alimentos en los productos alimenticios destinados al consumo humano animal. Debido al gran nmero y a diversidad de estos productos, puede ser necesario, en casos particulares, aportar modificaciones a las presentes directrices e inclusive utilizar otros mtodos. 1 .OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN: Esta norma establece los mtodos generales para el aislamiento e identificacin de Salmonella en los productos alimenticios.

2. RESUMEN DEL ENSAYO: Para el aislamiento e identificacin de salmonella, se preciosa de etapas sucesivas debido a que el microorganismo se encuentra por lo general presente en bajo nmero, algunas veces debilitado por los procesos tecnolgicos a que son sometidos los alimentos o por la presencia de un nmero mayor de otros miembros de la familia Enterobacterias u otras familias. Las etapas a considerar son las siguientes: Pre-enriquecimiento: Incubacin de las muestras a la temperatura adecuada en un medio lquido no selectivo. Enriquecimiento: Inoculacin del pre-enriquecimiento a dos medios lquidos selectivos, seguido de incubacin a las temperaturas adecuadas. Aislamiento e identificacin: Inoculacin del pre-enriquecimiento y/o del enriquecimiento sobre medios slidos de diagnstico selectivo, ios cuales luego de incubados a la temperatura adecuada, son examinados para observar la presencia de colonias, que por sus caractersticas sean consideradas como presuntivas de salmonella. Confirmacin: Determinacin de las caractersticas bioqumicas serolgicas a las colonias presuntivas de salmonella.

3. EQUIPOS: Equipo para preparacin de muestra segn NORMA COVENIN 1126. Licuadora. Homogeneizador mecnico. jarra metlica o de vidrio. Bolsas de polietileno. Autoclave Horno elctrico.

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Balanza. Incubadora, regulada a 35-37C. Bao de agua, regulado a 48-50C. Frascos estriles. Matraces estriles. Tubos de ensayos 15mm xl50mm. Placas Petri. Portaobjeto. Papel ph. Potencimetro. Materiales de uso comn.

4. MEDIOS DE CULTIVOS: Caldo Lactosado. Agua pectonada tamponada. Agua Destilada. Leche descremada recontituida al 10%. Caldo Nutritivo. Caldo Soya Tripticasa. Caldo Laurel Triptosa. Caldo Tetrationato-verde brillante. Caldo Selenito Cistina. Caldo Rappaport Vassiliadis. Agar Verde brillante-rojo fenol. Agar Xilosa Lisina desoxicolato. Agar desoxicolato-citrato. Agar Hektoen enterico. Agar Bismuto sulfito. Agar Kliger. Agar XSL Agar LIA. Caldo Urea. Agar Fenilalanina. Agar Nutritivo. Caldo Malonato. Caldo Triptonado.

5. REACTIVOS: Solucin de hidrxido de sodio 1N. Solucin de cido clorhdrico 1N.

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Solucin verde brillante 1 %p/p. Tergitol 7 anionico o tritn xlOO. Solucin de gelatinasa al 5%. Solucin de Yodo. Reactivos para la coloracin de gram. Solucin de cristal de Violeta. Lugol. Solucin decolorante (alcohol etano 1-acetona) 5.1 l.-Safranina. Reactivo de kovacs. Solucin de cloruro frrico al 10%. Solucin salina al 0,85%. Sueros polivalente grupo A-I, vi.

6. PROCEDIMIENTO: Pre-enriquecimiento: Se pesan 25g se miden 25 mi de la muestra del alimento, en una jarra envase apropiado previamente tarado o en bolsas de polietileno. En caso de que se analicen varias muestras de un mismo lote, puede prepararse una o varias muestras compuestas no mayores de 500 g 500 ml. Se aaden 225 ml de medio de pre-enriquecimiento por cada 25 g ml de la muestra y se lica o tritura por varios segundos. Finalmente se incuba a 35-37C. El medio de Preenriquecimiento a emplear se selecciona segn lo indicado en la tabla 1.

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TABLA 1.MEDIO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO A EMPLEAR, SEGUN EL TIPO DE PRODUCTO. Producto Medio de Pre-enriquecimiento Huevos enteros deshidratados, yemas de huevos deshidratadas, claras de huevos deshidratadas, Huevos lquidos pasteurizadas y congelados, Huevos crudos, Mezclas preparadas en polvo, (tortas, galletas, panes) galletas, frmulas infantiles, casena, pastas con huevo, harina de cereales y leguminosas. Chocolate, licor de cacao, cacao en polvo, caramelos, caramelos rellenos, cubiertas de caramelo, cubiertas de chocolote. Levaduras deshidratadas (inactivas) Leche en polvo entera o descremada Derivados lcteos (queso, crema de leche, otros)

Caldo lactosa tamponado.

caldo

de

pectona

Leche en polvo descremada reconstituida al 10% p/v, adicin de 0,45 ml de solucin verde brillante al 1%. Agua pectonada al 0,1% o caldo soya tripticasa. Agua destilada estril, con adicin de sol. Verde brillante al 1%. Caldo Nutritivo. Caldo nutritivo o leche descremada, reconstituida al 10%p/v, con adicin de 0,45 ml de verde brillante al 1%. Caldo Lactosado. Caldo lactosado con 2,25 ml de tergitol 7 anionico tritn x l00 en cantidad suficiente para iniciar la formacin de espuma (2 a 3 gotas) o agua pectonada tamponada con 2,25 ml de tergitol 7. Caldo Lactosado adicionando 5 ml de gelatinasa 5%. Caldo Nutritivo. Leche en polvo recontituida al 10% p/v, adicionando 0,45 mi de verde brillante al 1%.

Leches chocolatadas Pastas alimenticias, ensaladas preparadas, frutas y vegetales deshidratados.

Coco y productos con alto contenido graso (mayonesa y otros)

Gelatina Helados con productos lcteos

Helados con chocolate

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Helados sin productos lcteos Especias y condimentos Cebolla y ajo en polvo

Caldo lactosado o caldo nutritivo. Caldo soya tripticasa o caldo nutritivo. Caldo soya tripticasa o caldo nutritivo. Adicionando sulfito de potasio al 0,5% Caldo tripticasa o caldo nutritivo :Para canela y organo 1:100 y clavos 1:1000 Caldo lactosado pectonada con adicin de 2,25 ml de tergitol 7 anionico tritn xl 00 Caldo nutritivo tamponada. o agua pectonada

Canela, organo y clavos

Sub-productos de origen animal

Carnes crudas, pollo, conejo, crustceos y pescados

Productos crnicos procesados, mezclas deshidratadas para sopas y caldos.

Para productos con alto contenido de grasa:Caldo lactosado con 2,25 mli de tergitol 7 anionico tritn x 100 en cantidad suficiente para iniciar la formacin de espuma (2 a 3 gotas) o agua pectonada tamponada con 2,25 ml de tergitol 7. Caldo lactosado No amerita pre-enriquecimiento

Colorantes con ph mayor igual a 6 Colorantes rojos menor o igual a 6

Enriquecimiento: Despus del perodo de incubacin. Se transfiere lm del caldo de pre-enriquecimiento a 10 milde caldo tetrationato caldo rappaport-vassiliadis, se incuban a 35-36C por 24 h. a 43CC por 24 horas.

Aislamiento: Al final de las 24 horas de incubacin, se transfiere una asada de cada uno de los medios de enriquecimiento, previamente homogeneizados, a la superficies de placas con agar bismuto sulfito, agar verde brillante-rojo fenol, agar xilosa lisina desoxicolato, agar Hectoen Entrico, se debe extender el inoculo para obtener colonias aisladas Se incuban las placas invertidas, a 35-37C por 24 horas. Si no se observa crecimiento a las 24 horas debe incubarse 24 horas adicionales.

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Al final de la incubacin se observan las colonias presuntivas, cuyas caractersticas en los medios son las siguientes: Agar Bismuto-Sulfito: Colonias planas, marrones o grices a negro, con o sin brillo metlico. Algunas cepas pueden crecer de color verde sin ennegrecimiento de medio circundante. Agar Verde Brillante-rojo fenol: Colonias pequeas incoloras rosadas a fucsia y trslucidas. Agar Xilosa-Lisina-desoxicolato: Colonias incoloras, ligeramente rosadas, con sin centro negro. Agar Hectoen Entrico: Colonias azul verdosas o azules con o sin centros negros.

7. IDENTIFICACIN DE COLONIAS PRESUNTIVAS DE SALMONELLA:

Pruebas bioqumicas de Identificacin: Se transfiere por un filamento 2 ms colonias tpicas de cada medio selectivo a los siguientes agares: Agar Kliger(TSI) y Agar Lisina Hierro(LIA), Haciendo la inoculacin en profundidad (pinchazo) y en la superficie. Se incuban a 35-37C, por 24 horas . Los tubos son observados al final de la incubacin. Los cultivos sospechosos de ser salmonella muestran la siguiente reaccin: a) Agar TS1: Bisel alcalino de color rojo (no fermenta la lactosa y/o sacarosa) y taco de color amarillo (reaccin cida por fermentacin de la glucosa) con sin produccin de hidrogeno sulfurado que se manifiesta por ennegrecimiento total o parcial del agar. Algunas salmonellas pueden fermentar la sacarosa y/o lactosa y producir acidez (color amarillo) tanto en el taco como en el bisel. b) Agar Lisina- Hierro (LA): Se produce una reaccin alcalina en el tubo (color prpura) por descarboxilacin de la lisina. En este medio puede tambin observarse ennegrecimiento total o parcial ausente. Pruebas Bioqumicas confirmativas:

Estas pruebas comprenden como mnimo lo siguiente: Coloracin de GRAM, inoculacin en caldo rea, caldo malonato, caldo triptonado, y agar nutritivo inclinado. 7.2.1 .-Apartir del medio TS1, se practica una coloracin de Gram, para contactar la presencia de bacilos cortos plemorficos Gram negativos. De dar la morfologa caracterstica se procede: 7.2.2. -Inocule caldo Urea a partir del TSI, se incuba a 3537C por 24 horas conjuntamente con un tubo 9

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sin inocular. Luego de la incubacin se observan los tubos. 7.2.3. -Los cultivos que producen amoniaco a partir de urea+, producen una alcalinizacin que se manifiesta por un viraje del indicador (color rosado-fucsia).La salmonella da negativa a esta prueba. 7.2.4. -A partir del medio TSI se transfiere una asada del cultivo al caldo malonato. Se incuba por 482 horas a 35C, pero se observa el cultivo a las 24 horas para ver si hay cambio de coloracin del azul de bromotimol de verde a azul. La mayora de las salmonellas no utilizan malonato, por lo tanto no se observa cambio de color en el medio. La mayora de las salmonellas Arizonae, son positivos. 7.2.5. -A partir del cultivo en agar nutritivo, pueden realizarse otras pruebas bioqumicas adicionales como son: Oxidasa, galactosidasa, R.M.V.P. y fermentacin de algunos azcares (Glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, y dulcitol). 7.2.6. -Pruebas serolgicas:

Si las pruebas anteriores dan urea negativa, utilizacin de malonato negativo positivo, accin a la fenilalanina negativa, produccin de indol negativo, se procede a realizar las pruebas serolgicas utilizando suero somtico polivalente A-I, Vi, emplendose el procedimiento siguiente: 7.2.6.1. -Eliminacin de las cepas auto-glutinables:

En una lmina porta-objetos, perfectamente limpia se demarcan dos secciones y en cada una de ellas se coloca una gota de solucin salina. 7.2.6.2. -A cada gota se transfiere una asada de un cultivo de 24 horas en agar nutritivo y se dispersa en la gota de solucin salina, a fin de obtener una suspensin. A una de las suspensiones se agrega una gota del antisuero somtico polivalente AI,Vi. Se rota la lmina durante 30 a 60 segundos. Se observa el resultado sobre fondo oscuro, de la siguiente manera: Positivo: cuando slo se produce aglutinacin. Negativo: cuando no se produce aglutinacin. 8. -Expresin de los resultados:

8.1.-Segn los resultados de la interpretacin , se indicar la presencia o ausencia de Salmonella en la cantidad de muestra utilizada, para el anlisis (g mi) Ejem. Si se utilizan 25 g de muestra para el anlisis se reportara Positivo negativo en 25 g. 9. -Referencia:

9.1.-Procedimiento: NORMA COVENIN 1291-88.

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