ISOLASI DNA DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untukmengatur perkembangan biologis

seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapatpada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNAnukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkanDNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan proteinhiston. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanyamewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNAnukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidakmemiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk lineardan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven & Johnson 2002: 94). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purinterdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basapirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. KetikaGuanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkanketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen.Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugusfosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--178).

dapatdiisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut,tulang, liur dan lainDNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNAadalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudahdiperoleh.DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baikdengan metode PCR ( polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim ebut kemudiandapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau

mendeteksiadanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter,menentukan jenis
bakteri, kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam bidangkedokteran.Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel-sel berinti (seldarah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi DNA daridarah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harusdilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang

dipisahkan kemudian dilisiskan dengan bantuan bahan pengawetDNAyaitu,deterjenanionikyangdapat

sudah melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapatmengurangi aktivitasDNAse yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat ditambahkan RNAse untukmenyingkirkan kontaminasi RNA.Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma daninti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembaliendapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA.Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuhIsolasi DNA

merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitudengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuranberdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atastabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah,yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002). Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasiberupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam prosesisolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensiyaitu penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan.Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebutdilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDSdan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein.Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakandalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+bermuatanpositif dan DNA bermuatan negatif. Larutan dd H2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapatdengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteritersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutanbuffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus.Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Cairan DNA yang dihasilkankemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNAse untuk melisiskan RNAsupaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis danspektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobotmolekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yangdilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proseselektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada dibagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya.Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi yang kemungkinan adalah DNA plasmid. Hal ini dapat dilihat daripergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul.Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar.Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwaDNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapakelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahanteknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukantidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidakbergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalamsumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

ELEKTROFORESIS

Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan

terutama dalam ilmu Genetika. IsolasiDNA telah banyak dilakukan dandikembangkan di dunia ilmiah karenateknologi teknologi modern telah menjamah ilmugenetika. Isolasi DNAini dapat

dilakukan dengan cara dan bahan sederhana,

hinggadenganteknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapatdilakukan dariberbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun,daging buah, kalus, akar batang,daging dan sisik ikan. Namun, penggunaantumbuhan sebagai sumber lebih banyakdilakukan dalam pengisolasianDNA dewasa ini.Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutamauntuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapatterpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelahdilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis.Elektroforesis dilaku kan untukmemisahkan, mengidentifikasi,mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA.Elektroforesismerupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet.Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan.