Tryptophan operon

Tryptophan operon
Trp operon adalah contoh operon biosintesis yang ekspresinya diatur oleh sebuah effector:

operon terdiri dari 5 gen struktural bahwa kode untuk tiga enzim yang diperlukan untuk mengkonversi asam chorismic ke triptofan:
y

Anthranilate synthetase Anthranilate sintetase component I - encoded by trpE Komponen I - dikode oleh trpE component II - encoded by trpD Komponen II - dikode oleh trpD N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase/Indole-3-glycerol phosphate synthase - encoded by trpC N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate synthase fosfat isomerase/Indole-3-glycerol - dikode oleh trpC Tryptophan synthase Tryptophan synthase F -subunit - encoded by trpB FWYFYRMX - dikode oleh trpB E -subunit - encoded by trpA EWYFYRMX - dikode oleh trpA

operon ini juga mengandung gen penyandi oligopeptide pendek (trpL) yang fungsi dalam redaman (di bawah). Ekspresi diatur oleh TRP represor protein yang dikodekan oleh gen trpR. Tidak seperti operon lac, trpR tidak berdekatan dengan operon. Gen-gen struktural yang berlokasi di 28 menit pada E. coli peta; trpR terletak pada 100 menit. Represor TrpR sebenarnya mengatur ekspresi dari dua operon yang lain di samping operon trp.

protein TrpR tidak mampu untuk mengikat ke operator dengan sendirinya. Selama ada cukup triptofan dalam sel, ia akan tetap begitu. Namun, setelah tingkat tryptophan membangun, maka represor TRP akan memblokir lebih lanjut transkripsi operon dan, sebagai hasilnya, sintesis tiga enzim akan menurun.

Atenuasi
Sebuah prediksi langsung dari model ekspresi gen operon diterapkan pada kasus operon trp adalah ekspresi dari operon dalam mutan trpR harus sensitif terhadap triptofan ditambahkan. Jika tidak ada represssor mempengaruhi transkripsi, maka sejak itu represor yang merasakan kehadiran triptofan, harus ada pengaruh. Tapi ada! Ekspresi trpEDCBA dikurangi dengan penambahan trypophan di mutan trpR. Penelitian lebih lanjut membuktikan bahwa tingkat kedua kontrol triptofan melibatkan dua komponen:
y y

tRNA, khususnya tryptophanyl-tRNA TRP, yaitu tRNA TRP dibebankan dengan triptofan. gen trpL

trpL kode untuk oligopeptide 14 aa pendek.. Ini mengandung dua kodon trp berturut-turut dan karena itu berfungsi sebagai ukuran pasokan triptofan dalam sel. Jika suplai yang baik, maka tRNA akan diisi dan peptida pemimpin akan diterjemahkan tanpa masalah. Jika pasokan cukup memadai, maka tRNA tidak akan dikenakan biaya, dan terjemahan akan kios di kodon trp. Bagaimana hal ini mempengaruhi transkripsi operon trp? penjelasan ini berasal dari pengamatan bahwa wilayah mRNA trpL dapat mengadopsi sejumlah konformasi yang berbeda. Daerah ini berisi beberapa pelengkap diri yang dapat membentuk berbagai struktur stem-loop sebagai berikut:

Dalam satu konformasi, ditampilkan di sebelah kiri, terminator transkripsi khas bakteri dapat terbentuk sebagai akibat dari pasangan antara daerah 3 (kotak hijau) & 4 (kotak kuning). Dalam konformasi lain, di kanan, terminator tersebut dilarang karena membentuk 3 daerah kini dipasangkan dengan wilayah 2 (kotak ungu) membentuk struktur alternatif. Sekarang, apa yang mengatur pembentukan terminator atau anti-terminator? Ingat bahwa transkripsi dan translasi dapat terjadi secara simultan pada bakteri. Ini berarti bahwa ribosom akan melampirkan mRNA dan mampu mempengaruhi pembentukan struktur sekunder oleh mRNA. Dalam kasus mRNA trpL, jika ada suplai triptofan, maka ribosom mengikuti tepat di belakang RNA polimerase sampai dihentikan oleh kodon berhenti. Hal ini memungkinkan pembentukan terminator batang-loop yang akan menyebabkan RNA polimerase untuk memisahkan.

Perhatikan kodon UGA berhenti di bagian bawah wilayah 1 di urutan diagram di atas. Jika pasokan triptofan rendah, maka tRNA TRP tidak akan dikenakan biaya dengan triptofan, dan ribosom akan warung menunggu tRNA cocok untuk dibawa ke situs A:

Karena warung ribosom, wilayah 2 (ungu) sekarang dapat dasar-pasangan dengan wilayah 3 (hijau) segera setelah kedua ditranskripsi. Pembentukan terminator-anti mencegah pembentukan terminator tersebut.

Operon lac adalah operon diperlukan untuk transportasi dan metabolisme dari laktosa dalam Escherichia coli dan beberapa lainnya bakteri enterik . Ini terdiri dari tiga berdekatan gen struktural , sebuah promotor , sebuah terminator , dan operator . Operon lac diatur oleh beberapa faktor termasuk ketersediaan glukosa dan laktosa . Regulasi gen dari operon lac adalah mekanisme genetik kompleks peraturan pertama yang harus ditetapkan dan merupakan salah satu contoh terkemuka prokariotik regulasi gen . Dalam lingkungan alam, operon lac memungkinkan untuk pencernaan efektif laktosa. Sel dapat menggunakan laktosa sebagai sumber energi dengan menghasilkan enzim -galaktosidase untuk mencerna laktosa yang menjadi glukosa . Namun, akan tidak efisien untuk menghasilkan enzim bila tidak ada laktosa tersedia, atau jika ada sumber energi yang tersedia lebih mudah tersedia seperti glukosa. Operon lac menggunakan-bagian pengendali mekanisme dua untuk memastikan bahwa sel mengeluarkan energi yang memproduksi -galaktosidase , -galactoside permease dan transasetilase thiogalactoside (juga dikenal sebagai O-asetiltransferase galactoside) hanya bila diperlukan. Ini mencapai ini dengan represor lac , yang menghentikan produksi karena tidak adanya laktosa, dan katabolit protein aktivator (CAP), yang membantu dalam produksi tanpa adanya glukosa. Mekanisme kontrol ini menyebabkan pemanfaatan dual sekuensial glukosa dan laktosa dalam dua tahap pertumbuhan yang berbeda, yang dikenal sebagai diauxie . Diauxic pola pertumbuhan serupa telah diamati dalam pertumbuhan bakteri pada campuran lain gula juga, seperti campuran glukosa dan xilosa , atau glukosa dan arabinosa , dll mekanisme kontrol genetik yang mendasari pola-pola pertumbuhan tersebut diauxic dikenal sebagai xyl operon dan ara operon , dll
Struktur operon lac

Struktur laktosa dan produk dari belahan dada nya.

y

Lac operon terdiri dari tiga gen struktural , dan promotor , sebuah terminator , regulator , dan operator . Ketiga gen struktural: lacZ, lacY, dan lacA.

y y y

. lacZ menyandikan -galaktosidase (lacZ), sebuah intraselular enzim yang melekat pada disakarida laktosa menjadi glukosa dan galaktosa . . lacY menyandikan -galactoside permease (Lacy), sebuah membran transpor protein yang terikat-pompa laktosa ke dalam sel. lacA encode -galactoside transasetilase (LacA), sebuah enzim yang mentransfer sebuah grup asetil dari asetil-KoA untuk -galactosides .

Hanya lacZ dan lacY tampaknya perlu untuk laktosa katabolisme . kontrol khusus dari gen lac tergantung pada ketersediaan substrat untuk bakteri laktosa.. Protein yang tidak diproduksi oleh bakteri ketika laktosa tidak tersedia sebagai sumber karbon. Gen lac diatur menjadi operon , yaitu, mereka berorientasi pada arah yang sama langsung yang berdekatan di kromosom dan co-ditranskripsi menjadi satu polisistronik molekul mRNA. Transkripsi dari semua gen dimulai dengan pengikatan enzim polimerase RNA (RNAP), yang mengikat protein DNA , yang mengikat DNA spesifik ke situs pengikatan, promotor, segera hulu dari gen.Dari posisi ini RNAP hasil untuk mencatat semua tiga gen (lacZYA) ke dalam mRNA. Urutan DNA dari E. coli lac operon , the lacZYA mRN , yang lacZYA mRNA , dan gen lacI tersedia dari GenBank (tampilan) . Mekanisme kontrol pertama adalah respons peraturan untuk laktosa, yang menggunakan sebuah protein intraselular peraturan disebut represor laktosa untuk menghambat produksi galaktosidase tanpa adanya laktosa. . LacI gen coding untuk represor terletak dekat operon lac dan selalu disajikan (konstitutif).. Jika laktosa yang hilang dari medium pertumbuhan, represor sangat erat mengikat urutan DNA pendek hanya hilir dari promotor dekat awal lacZ disebut operator lac. . represor yang mengikat operator mengganggu pengikatan RNAP ke promotor, dan karena itu lacZ mRNA encoding dan Lacy hanya dibuat pada tingkat yang sangat rendah. . Ketika sel-sel yang tumbuh dengan adanya laktosa Namun, metabolit disebut laktosa alolaktosa , yang merupakan kombinasi glukosa dan galaktosa, mengikat represor, menyebabkan perubahan dalam bentuk. Jadi diubah, represor tidak mampu untuk mengikat ke operator, memungkinkan RNAP untuk mentranskripsikan gen lac dan dengan demikian yang mengarah ke tingkat tinggi dari protein yang disandikan. Mekanisme kontrol yang kedua adalah tanggapan terhadap glukosa, yang menggunakan protein aktivator katabolit (CAP) untuk lebih meningkatkan produksi -galaktosidase dengan tidak adanya glukosa. siklik adenosine monophosphate (cAMP) adalah molekul sinyal yang prevalensi berbanding terbalik dengan yang glukosa.. Ia mengikat ke CAP, yang pada gilirannya memungkinkan CAP untuk mengikat ke situs CAP mengikat (16 pb DNA hulu promotor di sebelah kiri pada diagram di bawah), yang membantu RNAP dalam mengikat DNA. Dengan tidak adanya glukosa, cAMP konsentrasi tinggi dan mengikat CAP-cAMP untuk DNA secara signifikan meningkatkan produksi -galaktosidase , memungkinkan sel untuk hydrolyse (mencerna) laktosa dan galaktosa dan glukosa rilis. . Diagram di bawah ini merangkum laporan.

lac operon terinci

Tatanama Genetik Tiga huruf singkatan yang digunakan untuk menggambarkan fenotipe pada bakteri termasuk E. coli . coli. Contohnya termasuk:
y y

Lac (kemampuan untuk menggunakan laktosa), Nya (kemampuan untuk mensintesis asam amino histidin) Mot (motilitas berenang)

Sm R (response to the antibiotic streptomycin) Sm R (respon terhadap antibiotik streptomisin)

Dalam kasus Lac, sel tipe liar Lac + dan dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon dan energi, sementara Lac - Turunan mutan tidak dapat menggunakan laktosa. Tiga huruf yang sama biasanya digunakan (huruf kecil, dicetak miring) untuk label gen terlibat dalam fenotipe tertentu,

di mana setiap gen yang berbeda adalah tambahan dibedakan dengan surat ekstra. Gen lac pengkodean enzim adalah lacZ, lacY, dan lacA.. Gen lac keempat adalah lacI, pengkodean represor laktosa-"Aku" singkatan inducibility. Lancar memperluas penggunaan nomenklatur fenotipik untuk diterapkan ke protein: demikian, lacZ adalah produk protein dari gen lacZ, -galaktosidase. Berbagai urutan pendek yang tidak gen juga mempengaruhi ekspresi gen, termasuk promotor lac, lac p, dan operator lac, o lac. Walaupun tidak secara ketat penggunaan standar, mutasi mempengaruhi lac o disebut sebagai c o lac, karena alasan historis. Sebuah terobosan konseptual Yakub dan Monod [4] adalah untuk mengenali perbedaan antara substansi peraturan dan situs mana mereka bertindak untuk mengubah ekspresi gen. Jacob menggunakan analogi dari seorang pembom yang akan rilis kargo mematikan perusahaan setelah menerima transmisi radio khusus atau sinyal. Sebuah sistem bekerja membutuhkan kedua pemancar tanah dan penerima dalam pesawat.Sekarang, anggaplah bahwa pemancar biasa rusak. Sistem ini dapat dibuat untuk bekerja dengan penerapan suatu pemancar, kedua fungsional.Sebaliknya, katanya, pertimbangkan pembom dengan penerima rusak. Perilaku pembom ini tidak dapat diubah dengan pengenalan fungsional, pesawat kedua. Untuk menganalisis mutan regulasi operon lac, Yakub dikembangkan suatu sistem dimana salinan kedua gen lac (lacI dengan promotor, dan lacZYA dengan promotor dan operator) dapat diperkenalkan ke dalam sel tunggal. Budaya bakteri tersebut, yang diploid untuk gen lac tapi dinyatakan normal, kemudian diuji untuk fenotipe peraturan. Secara khusus, itu ditentukan apakah lacZ dan Lacy dibuat bahkan dalam ketiadaan IPTG. Percobaan ini, di mana gen atau kelompok gen diuji berpasangan, disebut uji komplementasi .

Tes ini diilustrasikan pada gambar (lacA dihilangkan untuk kesederhanaan). Pertama, negara haploid tertentu yang ditampilkan (yaitu sel hanya membawa satu salinan dari gen lac). Panel (a) menunjukkan penindasan, (b) menunjukkan induksi oleh IPTG, dan (c) dan (d) menunjukkan pengaruh mutasi ke gen lacI atau operator, masing-masing. Pada bagian (e) uji komplementasi untuk represor ditampilkan. Jika salah satu salinan gen lac membawa mutasi di lacI, namun salinan kedua jenis liar untuk lacI, fenotipe yang dihasilkan adalah normal --- tetapi lacZ diungkapkan ketika terkena inducer IPTG. Mutasi mempengaruhi represor dikatakan resesif untuk mengetik liar (dan yang wild type dominan), dan ini dijelaskan oleh fakta bahwa represor merupakan protein kecil yang dapat menyebar di dalam sel . Salinan operon lac berdekatan dengan gen lacI rusak secara efektif mematikan oleh protein yang dihasilkan dari copy kedua lacI. Jika eksperimen yang sama dilakukan dengan menggunakan operator mutasi, hasil yang berbeda diperoleh (panel (f)). Fenotipe dari sel membawa satu mutan dan satu jenis situs operator liar adalah bahwa lacZ dan Lacy diproduksi bahkan dalam tidak adanya IPTG inducer; karena situs operator yang rusak, tidak mengizinkan pengikatan represor untuk menghambat transkripsi gen struktural . Ketika situs operator mana represor harus mengikat dirusak oleh mutasi, kehadiran situs fungsional kedua dalam sel yang sama tidak ada bedanya ekspresi gen dikontrol oleh situs mutan. Sebuah versi yang lebih canggih dari percobaan ini menggunakan ditandai operon untuk membedakan antara dua salinan gen lac dan menunjukkan bahwa gen yang tidak diatur (s)

adalah orang-orang di sebelah operator mutan (panel (g). Sebagai contoh, anggaplah bahwa satu salinan ditandai oleh mutasi menonaktifkan lacZ sehingga hanya bisa menghasilkan protein Lacy, sedangkan yang kedua membawa salinan mutasi yang mempengaruhi lacY dan hanya bisa menghasilkan lacZ. Dalam versi ini, hanya salinan operon lac yang berdekatan dengan operator mutan diungkapkan tanpa IPTG. Kami mengatakan bahwa mutasi operator cis-dominan, adalah yang dominan dengan jenis liar namun hanya mempengaruhi salinan operon yang berbatasan langsung dengan itu. Penjelasan ini menyesatkan dalam arti penting, karena hasil dari deskripsi percobaan dan kemudian menjelaskan hasil dalam hal model. Namun pada kenyataannya, sering benar bahwa model datang pertama, dan percobaan adalah model khusus untuk menguji model. Jacob dan Monod pertama membayangkan bahwa harus ada sebuah situs di DNA dengan sifat-sifat operator, dan kemudian dirancang tes komplementasi mereka untuk acara ini. Dominasi mutan operator juga menyarankan sebuah prosedur untuk memilih mereka secara khusus. Jika mutan peraturan dipilih dari budaya wild type menggunakan fenil-Gal, seperti dijelaskan di atas, operator mutasi jarang terjadi dibandingkan dengan mutan represor karena target-ukuran sangat kecil. Tapi kalau bukan kita mulai dengan suatu galur yang membawa dua salinan dari seluruh wilayah lac (yang diploid untuk lac), mutasi represor (yang masih terjadi) tidak sembuh karena komplementasi oleh, kedua gen tipe liar lacI menganugerahkan jenis liar fenotipe. Sebaliknya, mutasi dari satu salinan dari operator menganugerahkan fenotipe mutan karena dominan untuk salinan, jenis kedua liar.

Penggunaan dalam biologi molekular

Gen lac dan turunannya yang setuju untuk digunakan sebagai gen reporter di sejumlah pilihan berdasarkan teknik-bakteri seperti dua hibrida analisis, di mana berhasil mengikat dari aktivator transkripsi ke urutan promotor spesifik harus ditentukan. [3] Dalam LB piring berisi X-gadis, perubahan warna dari koloni putih ke warna biru, sesuai dengan sekitar 2-10 unit galaktosidase, sedangkan laktosa tetrazolium dan media laktosa MacConkey memiliki kisaran 1100 unit, yang paling sensitif dalam bagian-bagian yang tinggi dan rendah dari rentang masingmasing. Sejak laktosa MacConkey dan laktosa media tetrazolium baik mengandalkan produk mengalami gangguan laktosa, mereka membutuhkan keberadaan kedua lacZ dan lacY gen. Fusi teknik lac banyak yang hanya mencakup gen lacZ demikian sesuai dengan piring-cewek X atau ONPG kaldu cair