Spektrofotometer Sederhana Sistem Sequential Injection Analysis untuk Pengukuran Kalsium Serum

Intisari Suatu metode sequential injection analysis (SIA) untuk pengukuran kalsium darah total telah diterapkan. Prinsip uji didasarkan pada metode Arsenazo III, merupakan indikator yang membentuk kompleks dengan kalsium menimbulkan warna biru-ungu. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 650 nm yang sebanding dengan kandungan kalsium dalam sampel. Range linier berkisar 2,5-15 mg/dL (r2 = 0,999), dengan batas deteksi 0,430 mg/dL. Magnesium, glukosa, hemoglobin, dan bilirubin secara berturut turut pada kadar 123, 1.000, 50, dan 0,5 mg/dL, tidak memengaruhi secara signifikan (recovery 99,1% - 104,4%). Frekuensi sampling adalah 30/jam, dengan efek carry over (0,69%) dapat diabaikan. Metode SIA dianjurkan untuk dipakai dalam pengukuran kadar kalsium dari sampel serum (r2 = 0,970, n = 30). Kata kunci: Sistem Sequential Injection Analysis, Kalsium, Arsenazo III; Green Chemistry, Spektrofotometri; Analisis Klinis

1. Pendahuluan Kalsium darah didistribusikan dalam beberapa bentuk, bentuk utamanya adalah kalsium ion yang bebas dan kalsium protein yang terikat. Kadar kalsium sangat erat kaitannya dengan beberapa penyakit, seperti hiptiroid dan hipertiroid, pankreatitis akut, keganasan, dan kekurangan vitamin D. Banyak peneliti telah mengalihkan perhatian mereka untuk mengembangkan pengukuran kadar kalsium dalam spesimen serum secara kuantitatif mendiagnosis penyakit. Sampai saat ini, karena hal ini berpotensi untuk

kemajuan dalam pengukuran kadar

kalsium sangat tergantung pada jenis kalsium yang terkandung dalam sirkulasi darah. Penggunaan kalsium terionisasi, merupakan penanda yang berguna untuk menilai adanya gangguan regulasi kalsium, tetapi interpretasi hasil yang akurat adalah sulit karena berhubungan dengan pH yang sangat bergantung pada kadar karbondioksida dalam sampel. Sebaliknya, penentuan kalsium total lebih

populer dan banyak digunakan di sebagian besar laboratorium klinis karena metode yang sederhana. Metode ini berdasarkan pengikatan zat warna, seperti kompleks o-cresolphthalein dan Arsenazo III, yang biasanya digunakan untuk menentukan kadar kalsium darah. Pertimbangan zat pewarna khusus Arsenazo III
1

yang membentuk kompleks dengan kalsium, bisa secara sederhana disiapkan dan digunakan tanpa penambahan 8-hydroxyquinoline, suatu reagen penutup magnesium yang potensial. Merupakan suatu keuntungan dibandingkan dengan metode pengikatan zat warna lain yang memerlukan persiapan reagen secara terpisah. Akhir akhir ini , telah dilaporkan banyak cara yang dilakukan untuk mengukur kadar kalsium berdasarkan Arsenazo III, seperti metode

spektrofotometri, microfluidic berdasarkan platform , flow injection analysis , dan sequential injection analysis (SIA). Pengukuran kalsium dengan metode SIA telah diterapkan dan divalidasi pada penelitian sebelumnya, tetapi hanya untuk sampel yang berasal dari lingkungan, belum ada penerapan yang nyata untuk sampel biologi. Dalam penilaian klinis , kemampuan untuk membuat pengukuran yang cepat telah dijadikan dasar untuk tes kalsium serum. Alasan adanya metabolisme anaerobik sel darah, sehingga spesimen harus ditangani dan dianalisis segera . Perubahan pH sampel dapat memengaruhi kadar kalsium , oleh karena itu, analisis harus dilakukan dalam waktu 1 jam. Secara khusus, turn around time sangat penting dalam sejumlah proses, sehingga menggunakan SIA merupakan

pendekatan alternatif untuk sistem analitis . Metode SIA dianjurkan, seperti telah diketahui dalam hal operasi sepenuhnya otomatis, prosedur pengambilan sampel sederhana, troughput sampel yang tinggi, pemakaian reagen yang sedikit,

instrumentasi murah, dan waktu analisis yang singkat. Metode SIA sesuai untuk mayoritas laboratorium klinis dalam memonitor status kalsium di samping tempat tidur pasien karena proses yang cepat dan presisi yang baik. Meskipun penghitungan kadar kalsium menggunakan SIA berdasarkan reaksi pembentukan ikatan kompleks o-cresolphthalein telah dilaporkan,

penggunaan Arsenazo III untuk pengukuran kalsium serum belum diteliti. Untuk alasan ini, peneliti mengusulkan prosedur analisis ini yang sederhana, cepat, dan greener untuk analisis sampel kalsium serum total. Menggunakan konfigurasi SIA ini, peneliti mendapatkan akurasi dan kemampuan yang sangat baik dalam mengukur kalsium ini.

2 . Bahan dan Metode 2.1 . Reagen dan Bahan Kimia Analisis secara kimia digunakan dalam penelitian ini. Standar kalsium digunakan kalsium karbonat yang berasal dari Mallinckrodt. Arsenazo III dan bilirubin berasal dari Fluka. Piperazine - N , N' -bis acid [ 2 - ethanesulfonic ( PIPA ), 2 - ( N -mo - rpholino ) asam ethanesulphonic ( MES ), hemoglobin, magnesium sulfat , dan D-glukosa berasal dari Sigma. Asam klorida berasal dari Merck. Validasi metode penghitungan, digunakan kit pengukuran kalsium dari Randox sebagai pembanding . Untuk mendapatkan berbagai kadar kalsium dalam sampel , dua level serum kontrol digunakan untuk spike dalam sampel serum . Persiapan larutan stok standar kalsium ( 200 mg/dl), lima gram kalsium karbonat kering dilarutkan dalam 1 M asam dihidrochloorida dan diencerkan sampai 1 L dengan air Milli - Q. 2.2. Peralatan Sistem yang memastikan konfigurasi metode SIA, termasuk pompa dilengkapi dengan syringe pump 2,5 mL, katup pemilihan multiposisi, dan detektor spectrophotometri digabungkan dengan 18 L quartz flowthrough cell. Sistem ini digambarkan pada Gambar 1. Setiap tinggi puncak absorbansi direkam dan dinilai dengan perangkat lunak. Pipa PTFE dengan ukuran 0,8 mm i.d. digunakan untuk menghubungkan berbagai komponen dari sistem aliran, dan semua konektor yang digunakan terbuat dari PEEK . Metode konvensional Arsenazo III, merupakan metode batch cuvette based, dilakukan dengan menggunakan UV-VIS sama spektrofotometer seperti yang disebutkan di atas, sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam instruksi manual yang disediakan oleh Randox Laboratories. 2.3. Prosedur Urutan operasi seluruh sistem SIA untuk analisis kuantitatif kalsium ditampilkan pada Tabel 1. Sistem ini dimulai dengan aspirasi bufer pembawa dalam syringe. Larutan arsenazo III dan standar/sampel kemudian diikuti bufer pembawa masuk ke holding coil, sesudah itu reagen Arsenazo III aspirasi lagi. Arah aliran kemudian berbalik kembali, sehingga ada pemindahan dari campuran

reaksi terhadap aliran melalui kuvet. Dengan menggunakan detektor spectrometri, reaksi kimia antara Arsenazo III dan kalsium akan menimbulkan kompleks berwarna biru-ungu yang diukur pada 650 nm . Untuk menghindari kontaminasi dari zat lain, larutan asam klorida 1M ditambahkan ke dalam sistem SIA dan kemudian dicuci dengan bufer pembawa.

Gambar 1. Susunan Sistem Uji Kalsium SIA Berdasarkan Metode Arsenazo III 3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Kinerja Optimal Pengukuran Kalsium 3.1.1. Cara Kerja Hasil penelitian awal menunjukkan bahwa 200 uL reagen Arsenazo III berinteraksi sessuai dengan 10 uL kalsium. Dengan demikian, peneliti memutuskan untuk memilih reagen/sampel dengan rasio 200:10. Menurut

Gambar 2 (a), urutan aspirasi dioptimalkan dengan meneliti empat variabel dari urutan aspirasi. Operasi urutan 2 (SQ-2) memberikan sinyal analitik tertinggi ketika dievaluasi dengankadar kalsium 5mg/dl dan 15 mg/dL, seperti yang

ditunjukkan pada Gambar 2 (b). Untuk alasan ini, urutan aspirasi Arsenazo III reagen (100 L), sampel (10 L), dan reagen Arsenazo III (100 L) dipilih untuk penelitian lebih lanjut.

Tabel 1. Urutan Operasi dari Sistem SIA untuk Mengukur Kalsium Serum
Tahap Operasi Katup pompa Ke dalam Ke dalam Ke dalam Ke dalam Ke luar Ke dalam Ke dalam Ke luar Ke dalam Ke dalam Tempat pemilihan katup 1 2 1 5 3 5 2 Volume (L) 1800 100 10 100 2010 1800 200 2000 1000 100 Flow rate (Ls1) 200 100 10 100 25 200 200 2000 200 100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

Aspirasi bufer pembawal ke jarum pompa Aspirasi reagen arsenazo III Aspirasi standar/sampel ke holding coil Aspirasi reagen arsenazo III Penyauram mixture ke spektrofotometer Aspirasi bufer pembawal ke jarum pompa Aspirasi asam hidrochlorida 1M Penyauram ke flow-cell pencucian Aspirasi bufer pembawal jarum pompa Aspirasi subsequence standar/sampel (tahap pembilasan) Penyauram ke pencucian

Ke luar

1100

200

3.1.2. Volume Sampel Untuk mempelajari pengaruh volume sampel, ditetapkan reagen III Arsenazo 200 uL, 100 uL diaspirasi dengan berbagai volume sampel mulai dari 5 uL hingga 75 uL. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 3, hasil menunjukkan bahwa tinggi puncak sinyal meningkat dengan peningkatan volume sampel.

Namun, ketika diuji dengan konsentrasi kalsium yang tinggi (15 mg/dL), peningkatan volume sampel tidak memengaruhi sinyal secara jelas . Tinggi

puncak kurva mencapai plateau pada saat menambahkan volume yang lebih besar dari 10 L. Selain itu, penggunaan volume sampel 10 L memberikan linier lebih luas daripada volume lainnya. Oleh karena itu, volume sampel 10 L dipilih untuk eksperimen lebih lanjut.

Gambar 2. (a) Urutan Aspirasi Reagen Arsenazo III (L) dan Sampel (L), SQ-1(100-5-100-5 L), SQ-2(100-10-100 L), SQ-3 (200-10 L), SQ-4 (5-200-5 L), (b) Hubungan antara Setiap Urutan Operasi Dibandingkan Pengukuran Sinyal yang dinilai pada 5 mg/dLdan 15 mg/dL

3.1.3 . Pengaruh Arsenazo III Konsentrasi Variabel yang berbeda dipertimbangkan dalam pengukuran kadar kalsium, konsentrasi reagen adalah salah satu faktor yang paling signifikan dalam uji kalsium . Dalam penelitian ini, urutan operasi aspirasi reagen Arsenazo III (100 L ), sampel (10L ), dan reagen Arsenazo III (100 L) digunakan sebagai model untuk mempelajari pengaruh konsentrasi Arsenazo III . Efek peningkatan konsentrasi Arsenazo III pada sensitivitas absorbansi yang diteliti pada range 50pM-400 pM. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4 , yang membandingkan analisis sinyal dari empat konsentrasi Arsenazo III yang berbeda. Hasil menunjukkan bahwa sensitivitas meningkat dengan peningkatan konsentrasi Arsenazo III . Oleh karena itu, konsentrasi Arsenazo III dari 400 pM dipilih untuk semua percobaan karena memberikan linearitas yang lebih luas, dan kadar kalsium lebih dari 15 mg/dL dapat diukur . Referensi range untuk kalsium total

pada orang dewasa adalah antar

8,6 mg/dL-10,3 mg/dL. Pengukuran yang

dianjurkan karena mampu mendeteksi konsentrasi kalsium total yang mencakup seluruh rentang klinis.

3.1.4. Bufer Pembawa dan Flow Rate Pada pH alkali, Arsenazo III bereaksi dengan magnesium, kation divalen yang ditemukan dalam darah, sehingga mengurangi spesifisitas pengukuran. Asam hydroxyquinoline-5-sulfonat (8HQS) diperlukan sebagai agen penutup pada reagen alkali. Meskipun keadaan pH alkali memberikan sensitivitas yang lebih besar daripada keadaan asam, peneliti memutuskan pada keadaan pH asam sebagai pereaksi untuk menghindari penggunaan 8HQS. Dalam rentang asam, masih mempertahankan sensitivitas yang cukup untuk menentukan kalsium serum dan menyediakan linearitas yang luas meliputi interval referensi dan jangkauan patologis. Dengan demikian, efek pengenceran sampel pada uji hampir dapat diabaikan

Gambar 3. Hubungan antara Rerata Ketinggian Puncak Absorbansi dan Volume Sampel yang Diaspirasi ke Sistem SIA , Kalsium 5 mg/dL, Kalsium 15 mg/dL.

Gambar 4. Pengaruh Konsentrasi Arsenazo III pada Respons Sinyal: Arsenazo() 50 pM, () 100 M, () 200 M, dan () 400 pM. Setiap konsentrasi kalsium diuji dalam dua kali dan standar deviasi dari tes digambarkan sebagai error bar. Dalam penelitian pendahuluan, dua jenis bufer, PIPES dan MES, diteliti pada pH 6,5. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan bufer PIPES 25 mM memberi sinyal uji yang lebih baik daripada bufer MES 25 mM pada pH yang sama (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, bufer PIPES adalah bufer yang dipilih untuk penelitian ini. Selain itu, tiga konsentrasi yang berbeda dari PIPES juga dipelajari dengan tiga kadar kalsium standar, yaitu 5 mg/dL, 10 mg/dL, dan 15 mg/dL. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 5, meningkatnya konsentrasi PIPES memperlihatkan penurunan sinyal uji. Sensitivitas tertinggi diperoleh pada kadar bufer PIPES 25 mM, sehingga konsentrasi ini dipilih untuk penelitian lebih lanjut. Selain itu, penelitian terhadap aliran bufer pembawa juga diteliti untuk sensitivitas absorbansi. Setelah reaksi pengikatan warna selesai, kompleks

kalsium Arsenazo III tersebar ke detektor spektrofotometri dengan laju aliran konstan berkisar antara 15 uL/s - 35 uL/s. Gambar 6, menampilkan pengaruh

lima tingkat aliran yang berbeda pada sinyal absorbansi. Dari hasil penelitian didapatkan , hasil yang memberikan respons sinyal tertinggi pada tingkat aliran 25 mL/s , sehingga dipilih untuk eksperimen lebih lanjut.

Gambar 5. Pengaruh Konsentrasi Bufer PIPES (25 mM, 50 mM, 100 mM) pada Ketinggian Puncak Absorbansi.

Gambar 6. Pengaruh Penyaluran Laju Aliran pada Tinggi Puncak Absorbansi 3.2. Karakteristik Analisis 3.2.1. Kurve Analisis dan Batas Deteksi Ketinggian puncak absorbansi standar kalsium dan kekhususan kurva analisis ditunjukkan pada Gambar 7 (a). Hubungan linier antara ketinggian puncak absorbansi dan konsentrasi kalsium diamati dari 2,5 mg/dL - 15 mg/dL dengan koefisien korelasi 0,999, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7 (b). Batas deteksi dinilai oleh rasio signal-to-noise dari tiga adalah 0, 430 mg/dL, atau 0.107 mM. Hal ini menunjukkan bahwa sensitivitas sistem SIA yang diteliti sedikit lebih sensitif dibandingkan metode yang dijelaskan sebelumnya oleh J. Nyman et al. Berdasarkan pendekatan kompleks o-cresolphthalein yang
9

berbasis SIA, batas deteksi dimaksimalkan pada 0,125 mM. Walaupun metode SIA yang dijelaskan disini adalah kurang sensitif dibandingkan metode sebelumnya yang berdasarkan teknik mikofluida. Namun demikian, metode SIA lebih menguntungkan dibandingkan platform mikofluida, dalam hal analisis throughput yang tinggi. Meskipun telah ada beberapa laporan yang menggambarkan fleksibilitas dari sistem SIA untuk analisis kalsium dalam air, lingkungan dan makanan, sampai sekarang, sangat sedikit penelitian telah menggunakan sistem SIA untuk pengukuran kalsium dalam sampel klinis. Staden et al. menganjurkan sistem SIA untuk pengukuran kalsium dalam air, urin, dan sampel farmasi berdasarkan metode kompleks o-cresolphthalein.Walaupun, kurva analisis linier antara 0 dan 2 mg/dL, yang lebih sempit daripada sistem SIA oleh faktor sekitar 7,5. Peneliti menganjurkan sistem SIA yang mempunyai rentang linier luas, sehingga

mengurangi kebutuhan untuk mengencerkan sampel serum sebelum analisis. 3.2.2. Presisi, Reproducibility, dan Sampel Frekuensi Reproducibility yang diteliti dari metode ini 20 runs pada kadar kalsium 10 mg/dL dan 15 mg/dL pada hari yang sama. Hasil menunjukkan bahwa withinrun dari reproducibility yang diamati pada masing masing koefisien variasi (KV) 1,3% untuk kadar kalsium 10 mg/dL dan 1,2% untuk kadar kalsium 15 mg/dL. Hasil analisis empat kurva yang dilakukan berturut turut pada hari yang berbeda didapatkankan reproducibility baik, dengan KV within run dari 0,7% - 1,7% dan KV run-to-run 2,6%. Sesuai dengan throughput yang tinggi, sistem SIA yang dipakai dapat memproses sampai 30 runs per jam.

3.2.3. Efek Carry-Over Efek carry over antara sampel ditentukan dengan terlebih dahulu menganalisis sampel dengan konsentrasi analit tinggi (kalsium 15 mg/dL)

dalam tiga kali pemeriksaan berturut turut, diikuti dengan menganalisis sampel dengan konsentrasi analit rendah dalam tiga kali pemeriksaan (kalsium 2,5 mg/dL). Efek carry over diteliti sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Haeckel et al.
10

(a)

(b) Gambar 7. (a) Ketinggian Puncak Absorbansi Standar Kalsium, (b) Kurva Analisi Kalsium Berdasarkan Metode SIA Arsenazo III yang Dianjurkan (linier 2,5-15 mg / dL; r2 = 0, 999). Dengan metode ini, efek carry over yang dihitung adalah 0,69%, yang dapat diabaikan. Karena pada tahap pencucian dengan asam dimasukkan dalam running protokol, efek carry over yang rendah dicapai pada between run.

3.2.4. Interferensi Pengaruh interferensi dari substansi asing pada pengukuran kalsium yang biasanya ada dalam sampel darah diteliti. Dengan tujuan mempelajari uji spesifisitas, tes recovery kalsium dilakukan dengan adanya zat-zat lain. Serum kontrol (kalsium ~ 9,8 mg/dL) yang mengandung konsentrasi tertentu dari setiap
11

substansi yang ditambahkan ke dalam sistem SIA, dan ketinggian puncak absorbansi dibandingkan dengan yang diperoleh dari kontrol serum saja. Seperti terlihat pada Tabel 2, memperlihatkan hasil adanya interferensi yang masih dapat diterima dari komponen yang biasanya terdapat dalam serum seperti magnesium (123 mg/dL), glukosa (1000 mg/dL), hemoglobin (50 mg/dL), dan bilirubin (0,5 mg/dL), dengan recovery antara 99,1% - 104,4% Tabel 2. Pengaruh Berbagai Substansi yang Diuji pada Pengukuran Kalsium oleh Sistem SIA
Interferensi tes Tidak ada Magnesium Haemoglobin Bilirubin Glukosa Penambahan konsentrasi (mg/dL)) 123 50 0,5 1.000 % Recovery 100 104,4 99,1 101,3 99,7

3.2.5. Perbandingan Metode Sampel darah yang dibiarkan beku disentrifugasi pada 1500 g selama 15 menit untuk memisahkan serum. Dalam penelitian ini, beberapa tingkat pengujian sampel, termasuk kadar kalsium yang lebih rendah dan lebih tinggi dari kadar kalsium normal, diperoleh dengan spiking sampel serum dengan berbagai

tingkatan kadar kalsium dari serum kontrol komersial. Tiga puluh sampel diteliti dalam sistem SIA Arsenazo III untuk pengukuran kadar kalsium dan dibandingkan dengan metode spektrofotometri dengan skala besar. Dalam pasien dengan salin sebelum

praktek, tidak diperlukan pengenceran sampel

analisis, karena linearitas yang agak luas pada sisten ini, dengan range kalsium 2,5 mg/dL - 15 mg/dL. Hasil scatter plot yang diperoleh dari kedua metode ditunjukkan pada Gambar 8 (r2 = 0,970, n = 30). Idealnya, intercept dan slope dari persamaan regresi masing masing harus mendekati 0 dan 1,0 , untuk korelasi yang baik dua metode . Dalam penelitian ini regresi statistik dihitung untuk mengevaluasi kemaknaan slope dan intercept dari persamaan regresi , dan ditampilkan y = (0,979 0,03 ) x (0,192 0,299). Intercept adalah 0,192 , dengan confidence limits bawah dan atas masing masing dari -0,421 dan 0,805. Kisaran ini termasuk nilai ideal dari nol, yang menunjukkan bahwa intercept tersebut tidak berbeda secara bermakna dari 0

12

pada tingkat alpha 0,05 ( p value = 0,526 ). Slope grafik adalah 0,979 dengan interval kepercayaan (IK) 95 % 0,913-1,045 , menunjukkan bahwa slope tersebut tidak berbeda secara bermakna dari 1 karena kisaran ini termasuk nilai model 1.0 . Dengan IK 95 % dan derajat kebebasan 28, nilai kritis t ( t 0,05 , 28 ) dihitung menjadi 2,048 . Paduan analisis statistik sampel menunjukkan bahwa nilai eksperimentaltadalah 0,092, secara bermakna lebih rendah daripada nilai kritis t sehingga hipotesis nol yang diasumsikan tidak ada perbedaan bermakna antara hasil kedua metode. Data ini menunjukkan bahwa sistem SIA Arsenazo III sangat berkorelasi dengan metode spektrofotometri konvensional dengan menggunakan kit pengukuran dari Randox ( p - value < 0,05 ) .

Gambar 8. Tampilan Sistem SIA Berdasarkan Metode Arsenazo III Dibandingkan dengan Metode Konvensional. Persamaan regresi adalah y = 0,979 ( 0,033) x + 0,192 ( 0,299) dan r2 = 0.970 4. Kesimpulan Sistem spektrofotometri sederhana SIA untuk pengukuran kadar kalsium serum telah digunakan. Kelebihan utama dari metode ini antara lain pemakaian reagen Arsenazo III yang lebih sedikit dan waktu yang relatif 30 runs per jam. Efek carry-over terbukti rendah dan korelasi yang tinggi dengan metode konv ensional menunjukkan sistem SIA dapat dipakai untuk analisis sampel serum. Dengan kata lain, sistem SIA yang diusulkan dapat menjadi metode pilihan untuk pemeriksaan rutin sampel klinis karena mudah dilakukan dan 0020interpretasi yang akurat pada kadar yang signifikan secara klinis.

13