PREPARAT DAN CARA PEMBUATANYA

Pengertian Sebelum dilakukan pemeriksaan mikroba secara mikroskopis maka mikroba tersebut harus dipersiapkan terlebih dahulu, agar pemeriksaannya dapat dilihat dengan jelas. Mikroba yang telah dipersiapkan in disebut Preparat. Pembuatan secara langsung Definisi Merupakan metode yang dilakukan untuk mikroba pengeringan (fiksasi) dan pengecatan (pewarnaan). Dengan catatan mikroba yang digunakan masih hidup sehinngga dapat diamati kelakuan dari mikroba, misalnya gerakannya, pembelahan sel Jenis 1. Metode basah Dengan cara mikroba disuspensikan dalam cairan kemudian ditetesi di atas kaca obyek dan ditutup dengan gelas penutup 2. Metode Tetesan Gantung Awalnya suspensi bakteri ditemukan di atas kaca penutup. Yang kemudian ditutup denagn kaca yang telah dibuat khusus, selanjutnya di balik dan siap diperiksa di mikroskop 3. Metode balok gantung mula-mula disiapkan agar-agar yang dituangkan dalam petridish ditunggu sampai dingin, agar-agar tersebut dipotong-potong dengan ukuran 6 mm2 kemudian dipindahkandi atas gelas objek yang steril. agar-agar tersebut dipotong-potong dengan ukuran 6 mm2 kemudian dipindahkandi atas gelas objek yang steril. yang tidak tahan terhadap

Mikroba yang diperiksa ditaburkan di atas gelas objek yang sudah ada agar-agarnya, kemudian ditutup dengan gelas penutp yang steril. Diinkubasikan selama beberapa menit kemudian dipindahkan dari gelas ke berlubang. Kemudian ditutup dengan parafin dan siap diperiksa di bawah mikroskop. kaca

Pembuatan secara tidak langsung Definisi pembuatan preparat dengan teknik ini sering disebut dengan pengecatan atau pewarnaan ayng digunakan untuk pemeriksaan sifat morfologi mikroba. Langkah pembuatan 1. Pembuatan lapisan film dan fiksasi Dengan jarum steril, suspensi mikroba dioleskan di atas kaca obyek hingga membentuk lapisan film. Kemudian dilakukan fiksasi dengan membakar dengan spritus alapisan film tadi beberapa kali. Atau dapat juga dilakukan dengan menambahkan zat kimia seperti campuran asam cuka dan pikrat. 2. Pewarnaan mikroba Cat Biologis Cat dibagi menjadi 3 yakni : 1. Cat basis Garam-garam cat yang ion-ion catnya adalah kation, contoh : Methylene blue, safranin,netral red dan anionnya adalah Cl, SO, asetat dll 2. Cat Asam cat yang ion catnya adalh anion-anion dan kation-kationnya Na, K,Ca, dan NH contoh : eosinat, eosin, congo red, dll

3. Cat-cat lain, seperti : Cat yang bersifat netral dan indiferan, misalnya Sudan III dan eosin Cara pewarnaan sederhana Film mikroba yang telah difiksasi kemudian direndam dalam larutan zat warna dalam waktu tertentu setelah itu dicuci dengan air mengalir yang bersih dan dikeringkan.Lama perendaman dalam zat tergantung dari jenis mikroba yang diwarnai.Cat banyak digunakan adalah methylen blue,gentian violet,basic fuchsin atau safranin. Cara pewarnaan differensial Ada 2 macam pewarna diferensial yaitu : pewarnaan gram,dan pewarnaan asam secara cepat (acid fast). 2.3.2 Pewarnaan Gram Pengecatan gram meliputi 4 tingkatan yaitu; 1.Pemberian cat utama (larutan cat kristal violet) 2.Pengintesifan cat utama dengan menambahkan larutan IKI(mordan) 3.Pencucian (dekolorisasi)denggan larutan alkohol 4.Pemberian cat penutup (cat lawan )dalam hal ini digunakan safranin yang berwarna merah. Pengecatan gram dibedakan menjadi Bakteri gram positif dan negatif. - Bakteri gram positif ialah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak dapat diwarnai oleh cat lawan safranin yang berwarna ungu. - Bakteri gram negatif ialah bakteri yang daya mengikat cat utama tidak kuat sehingga dapat di lunturkan oleh peluntur dan dapat mengika cat lawan berwarna merah. Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan 1. Fiksasi Cara fiksasi yang paling banyak yang di gunakan dalam pengecatan bakteri dengan membuat lapisan suspensi bakteri diatas gelas benda kemudian dikeringkan dengan cara dilewatkan beberapa kali diatas nyala lampu spirtus,atau dengan menggunakan reagensi kimia.

2. Substrat Berdasarkan macam cat yang diserap oleh sel , ada tiga tipe sel yaitu : a. Sel-sel yang Basofil , yaitu sel-sel yang dapet mengikat cat biasa. b. c. Sel-sel Asidofil atau oksifil, yaitu sel yang dapat mengikat cat asam . Sel-sel yang Sudanofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat cat yang dapat larut dalam minyak. 3. Peluntur cat (decolorizer) Macam-macam peluntur cat , misalnya: a. Peluntur cat yang lemah yaitu alkohol,air, minyak cengkeh ,aseton dan gliserin b. Peluntur cat asam yaitu HCl , H2SO4 ,HNO3 ,dan campuran asam-asam dengan alcohol c. d. Peluntur cat basis yaitu KOH , NaOH, sabun dan garam basa Garam- garam logam berat yaitu AgNO3 , MgSO4 .

4. Intentifikasi Pengecatan Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan sel bakteri dan dicat lebih intensif atau menyebabkan cat terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara pengecatan tanpa diberi mordan,

Ada beberapa macam mordan : a. Mordan basa yaitu mordan yang bereaksi dengan anion asam yang berwarna,misalnya alum,FeSO, kalium antimonium khlorida. b. Mordan Asam yaitu mordanyang bereaksi dengan cat-cat basa,misalnya asam tanin,asam pikrat,JKJ. 5. Cat Penutup (cat lawan) Sebagai cat penutup yang banyak digunakan ialah methylene tartrat,asetol piridinium

blue,safranin,erythrosin dan lain-lain tergantung macam pengecatannya.

Beberapa cara pengecatan 1. Pengecatan Negatif Pengecatan ini merupakan pengecatan tidak langsung,karena yang dicat adalah latar belakangnya ,sedangkan bakteri tidak mengalami pengecatan. Cat yang banyak digunakan dalam pengecatan negatif ialah nigrosin dan tinta cina. 2. Pengecatan Sederhana Pengecatan dilakukan menggunakan satu macam cat saja, sebelum mengecat dilakukan fiksasi dahulu. Pengecatan ini dipakai untuk melihat bentuk bakteri, cat yang sering digunakan methylen blue, gentian fuchsin, basic fuchsin 3. Pengecatan Gram pengecatan gram meliputi 4 tingkatan : 1. Pemberian cat utama (lar.kristal violet) 2. Pengintensifan cat utama dg menambahkan lar. Mordan (JKJ) 3. Pencucian (gekolorisasi) dengan alkhohol 4. Pemberian cat penutup (cat lawan) larutan safranin yg berwarna merah Faktor-faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan gram : a. Perubahan keasaman pH turun :bakteri gram positif akan menjadi bakteri gram negatif pH naik :bakteri gram negative akan menjadi bakteri gram positif b. Penyimpangan cara pengecatan pencucian yang terlalu lama menggunakan alkhohol dapat menyebabkan bakteri gram positif memberikan hasil seperti gram positif

c. Faktor medium bakteri gram positif yg lemah apabila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yg mudah di fermentasi dapat berubah menjadi gram negatif. d. Umur bakteri bakteri gram positif yang telah menjadi tua atau kurang nutrisi makanan dapat berubah menjadi bakteri gram negatif e. Perlakuan khusus bakteri gram positif yg bagian selnya dihilangkan dapat larut dalam air panas, eter, atau larutan ribonuklease dpt menjadi bakteri gram negatif. bakteri gram negatif yang dilarutkan dalam lar. Pekat DNA dpt berubah menjadi bakteri gram positif. Cont: E.Choli 4. Pengecatan Acid fast (pengecatan ziehl nelsen) pengecatan acid fast termasuk pengecatan differensial karena dapat membedakan bakteri yg acid fast (tahan terhadap pencucian asam) dan non acid fast (tidak tahan terhadap pencucian asam).misalnya bakteri yg bergenus Mycobacterium (M.tubercolosis, M.leprae) dan beberapa aktinomisetes apabila bakteri ini dicat dengan carbolfuchsin sambil dipanaskan 90C diatas penangas air selama 4 menit maka lapisan lilinya lunak dan cat menembus kedalam sel. Setelah dingin cat akan terikat oleh sel. Sehingga tidak luntur dg pencucian alkohol maka bakteri tersebut bersifat acid fast.