PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG
Limbah industri perkebunan merupakan salah satu penyebab pencemaran Sungai Indragiri, yang juga bisa mengendap sebagai sedimen yang diduga sebagian besar terdiri atas polimer selulosa
Selulosa dimanfaatkan oleh bakteri selulolitik sebagai sumber karbon dengan bantuan enzim selulase Selulase memiliki peran penting dalam industri dan pengolahan limbah. Pada penelitian sebelumnya bakteri selulolitik telah berhasil diisolasi dari DAS Siak di Tandun Kabupaten Rokan Hulu Produksi enzim dari mikroorganisme memiliki keuntungan.

PERUMUSAN MASALAH
Limbah industri perkebunan yang mencemari Sungai Indragiri mengandung polimer selulosa yang dimanfaatkan oleh bakteri selulolitik sebagai sumber karbon dengan bantuan enzim selulase. Sehingga perlu dilakukan isolasi dan uji aktivasi bakteri penghasil selulase dari air serta sedimen Sungai Indragiri.

TUJUAN

Mengisolasi bakteri selulolitik dari air dan sedimen Sungai Indragiri sebagai usaha ekstensifikasi mikroba galur lokal Riau

Melakukan identifikasi Gram dan uji aktivitas isolat dari air serta sedimen Sungai Indragiri

TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau selama lebih kurang enam bulan.

METODOLOGI PENELITIAN

ALAT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. UV-VIS (Thermo Scientific Model Genesys 10S) Autoclave (All American Model No. 2X) Waterbath (Grant Instrument Type SUB 28) Vortex (H-VM-300) Incubator (Memmert) Oven (Fisher Scientific Model 655F) Shaking Incubator (LabTech Model LSI-3016R Seri No. B110221102) 8. Microcentrifuge (Heraeus Instrument. Biofuge Pico D37520 Osterode) 9. Mikroskop (Optic Ivymen System No. 05141) 10.peralatan gelas laboratorium lainnya sesuai dengan prosedur

BAHAN
1. sampel air dan sedimen 2. CarboxyMethylCellulose (CMC) (Brataco Chemika J1438/4) 3. nutrient agar (Merck, No.Kat.1.05450.0500) 4. nutrient broth (Merck, No.Kat.1.05443.0500) 5. reagen Nelson-Somogyi 6. reagen arsenomolibdat 7. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah bahan tingkat analisis sesuai dengan metode kerja

RANCANGAN PENELITIAN
Sampel yang akan digunakan pada penelitian ini adalah air sungai yang diambil dari beberapa titik sampling seperti tertera pada Tabel 3.1 dan tergambar pada peta di Gambar 3.1.

Tabel 3.1. Titik pengambilan sampel

Waktu Kode Pengambilan Sampel sampel 910 05 April 2013 Jenis sampel Air Koordinat 0 18' 59.0256" LS 103 15' 47.6855" BT 0 18' 59.0256" LS 103 15' 47.6855" BT 0 8' 23.0135" LS 103 18' 31.0247" BT 0 8' 23.0135" LS 103 18' 31.0247" BT Keterangan Muara Sungai Indragiri, cerah, berangin, warna air coklat muda Muara Sungai Indragiri, cerah, berangin, warna air coklat muda Sungai Indragiri, cerah, warna air keruh Sungai Indragiri, cerah, warna air keruh

910

05 April 2013

Sedimen

914

05 April 2013

Air

914

05 April 2013

Sedimen

Gambar 3.1. Peta titik pengambilan sampel

SKEMA PENELITIAN

ISOLASI BAKTERI SELULOLITIK

Sampel 910-Air, 910-Sedimen, 914-Air, dan 914-Sedimen Pembuatan suspensi sampel pada media nutrient broth

(Diinkubasi pada T 37C, 24 jam)

Isolasi bakteri pada media padat yang mengandung 1% CMC Koloni tunggal

IDENTIFIKASI BAKTERI DAN PRODUKSI ENZIM

Isolat bakteri diremajakan pada media nutrient broth (Diinkubasi pada T 37C, 24 jam) Produksi enzim selulase pada media produksi enzim selulase dalam bufer fosfat (0,05 M, pH 7)

Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Gram

UJI AKTIVITAS
Larutan enzim

Penentuan aktivitas enzim selulase berdasarkan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Somogyi

Penentuan kadar protein enzim selulase dengan metode Lowry (FolinCiocalteau)

Uji aktivitas spesifik

SKEMA PENELITIAN

Persiapan Media
1. Komposisi Media Padat Selulase

Komposisi media MgSO4. 7H2O KNO3 K2HPO4 CaCl2.2H2O Ekstrak khamir Agar Batang CMC (1%)

Berat (gram) 0,020 0,075 0,002 0,004 0,200 1,500 1,000

17

Lanjutan

semua bahan dilarutkan dalam 100 mL aquades

dipanaskan Hingga homogen

Sterilisasi pada suhu 1210C, 15 lbs, 15 menit

didinginkan

Dituang kedalam cawan petri 20 ml

18

2. Komposisi Media Cair Produksi Selulase

Komposisi media MgSO4. 7H2O KNO3 K2HPO4 FeSO4.7H2O CaCl2.2H2O Ekstrak khamir CMC

Berat (gram) 0,00500 0,01875 0,01250 0,00050 0,00010 0,05000 0,25000

19

Lanjutan

Media siap diinokulasi apabila tidak kontaminasi setelah diinkubasi selama satu malm pada suhu kamar semua bahan dilarutkan dalam 25 mL buffer fosfat pH 7 (0,05 M)
Disterilkan pada suhu 121C,15 lbs selama 15 menit

20

Isolasi Bakteri Selulolitik

Inkubasi T 37C 24 jam

1 ml sampel air, 1 g sampel sedimen

Inokulum

9 ml media NB

Inokulasi pada media padat 1% CMC Metode Cawan Gores (Streak Plate Method)
Inkubasi T 37C 24 jam

21

Identifikasi Isolat dengan Pewarnaan Gram

4 ml media NB

Diremajakan pada media NB

Inkubasi T 37C 24 jam Inokulum

Isolat bakteri siap untuk diidentifikasi melalui uji pewarnaan Gram

23

Produksi Enzim Selulase

Diinokulasi pada media NB Inkubasi 24 jam, 370C Diukur kekeruhan sel bakteri atau optical density (OD) pada =660 nm

Isolat bakteri pada CMC 1%

Dimasukkan

Inokulum dengan OD senilai 0,5

Media cair produksi

24

Dimasukkan

inkubasi dalam shaker incubator suhu 370C ,150 rpm selama 24 jam

Isolat pada NB

Media produksi

Kultur isolat Sentrifugasi dalam keadaan dingin dengan kecepatan putaran 9500 rpm selama 10 menit uji aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Selulase dengan metode Nelson-Somogyi

Supernatan disaring

Ekstrak Kasar Enzim

25

Penentuan Aktivitas Enzim Selulase

1 mL bufer fosfat 0,05 M pH 7

1 mL lar CMC 1% dalam bufer fosfat 0,05 M pH 7 Inkubasi selama 5 menit pada 40o C tabung uji dan kontrol ditambahkan 1 mL lar enzim, inkubasi 30 menit

Uji Blanko Kontrol

Pada kontrol ditambahkan1 mL lar CMC 1% dalam bufer fosfat 0,05 M pH 7

Kerja enzim dihentikan dengan penambahan 1 mL Nelson-Somogyi

Penangas air

20 menit

Dinginkan Tambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat dan 6 mL akuades , Diamkan 30 menit

Ukur Absorbansi pada =540 nm dan hitung 26 Aktivitas Enzim

Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim Selulase

1 mL Larutan sampel protein 5 mL Reagen C homogenasi dan diamkan selama 10 menit

homogenasi dan diamkan selama 30 menit

0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau

Ukur Absorbansi pada =700 nm dan hitung Aktivitas spesifik Enzim

27

09/12/2013

28