Laporan Praktikum Mikrobiologi Topik: Pewarnaan Sel Bakteri

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Genetika Yang dibina oleh Ibu Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd

Oleh Kelompok 1 Offering B/BB: 1. Ahmad Habibul W. 2. Anisa Meida S. 3. Asti Sevita 4. Fatatus Rizka N. 5. Irma Dwi Jayanti 6. Rizky Amalia A. (100341400718) (100341404062) (100341404375) (100341404413) (100341400712) (100341404411)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI September, 2012

A. Topik: Pewarnaan Sel Bakteri B. Hari, Tanggal Praktikum: Senin, 11 September 2012 C. Tujuan 1. Memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram 2. Menentukan sifat Gram dari bakteri yang diamati D. Dasar Teori Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Waluyo, 2004). Salah satu pewarnaan bertingkat yang paling banyak dipergunakan dan sangat populer ialah pewarnaan Gram yang dikembangkan oleh Christian Gram (1884) yang kemudian lebih disempurnakan secara bertahap, sehingga menghasilkan dua kelompok besar bakteri: bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil Gram positif dan Gram negatif ini disebabkan oleh perbedaan kandungan nding sel bakteri, yaitu bahwa kandungan senyawa peptidogikan pada dinding sel bakteri Gram positif lebih tebal jika dibandingkan pada dinding sel bakteri Gram negatif (Suriawiria, 1986). Menurut Darkuni (2001) pada bakteri Gram positif ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat. Senyawa ini akan bereaksi dengan kristal-violet dan menyebabkan tidak mudah dilarutkan oleh larutan pemucat. Senyawa ini tidak ditemukan pada bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif dan positif mempunyai perbedaan yang jelas terhadap susunan komposisi dinding sel. Bakteri Gram negatif mempunyai struktur dinding yang berlapis, sedangkan pada bakteri Gram positif hanya terdiri atas satu lapis yang tebal. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan

gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Martha, 2011). Proses pewarnaan Gram memiliki beberapa tahap. Pertama, pemberian pewarna kristal violet pada bakteri yang diletakkan di atas gelas objek tadi. Pewarna kristal violet ini berguna sebagai indikator bakteri gram positif. Setelah ditetesi pewarna kristal violet, objek glas dibilas dengan air aquades, gelas objek dipegang pada posisi miring kemudian dikeringkan dengan menempelkan kertas serap yaitu kertas tissue pada bakteri tanpa mengelapnya. Kedua, pemberian Gram Iodium (lugol) yang berfungsi sebagai pembentuk kompleks ungu kristal-yodium (UK-Y), kemudian diamkan selama satu menit lalu dibilas kembali dengan air aquades dan dikeringkan seperti tadi. Ketiga, pemberian alkohol 95% untuk menghilangkan warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi ( 20 detik) lalu dibilas dan dikeringkan lagi. Keempat, pewarnaan dengan larutan safranin yang berfungsi sebagai indikator bakteri gram negatif ataupun positif selama 20 detik kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Setelah melakukan tahapan-tahapan tersebut kita akan mendapatkan warna yang khas, warna ungu kebiruan untuk bakteri Gram positif yang menyerap pewarna kristal violet dan warna kemerahan untuk bakteri Gram negatif yang menyerap larutan safranin (Martha, 2011). E. Alat dan Bahan Alat 1. Mikroskop 2. Kaca Benda 3. Mangkuk pewarna 4. Kawat penyangga 5. Pipet 6. Kawat inokulasi lancip 7. Kawat inokulasi tumpul (ujungnya membulat) 8. Lampu spiritus 9. Botol Penyemprot

Bahan 1. Aquades steril 2. Biakan murni bakteri umur 1x24 jam 3. Laruta Ammonium Oksalat Kristal Violet 4. Kertas penghisap 5. Korek api 6. Alkohol 95% 7. Lisol 8. Sabun cuci 9. Larutan Safranin 10. Larutan Iodium 11. Air kran

F. Prosedur Kerja Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu melewatkannya di atas nyala api lampu spiritus

Meneteskan satu sampai dua tetes aquades steril di atas kaca benda tersebut

Mengambil inokulum bakteri yang akan diperiksa secara aseptic, lalu meletakkan di atas tetesan aquades. Kemudian meratakan secara perlahan-lahan danmenunggunya sampai kering

Melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api spiritus dengan cepat

Meletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada di atas mangkuk pewarna. Lalu meneteskan larutan Ammonium Osalat Kristal Violet di atas sediaan tersebut.Menunggu selama satu menit

Membuag keebiha zat warna tersebut ke dalam mangkuk dan membilasnya dengan air kran

Meneteskan larutan Iodium di atas sediaan, lalu menunggu selama dua menit

Membuang kelebihan larutan Iodium ke dalam mengkuk dan membilasnya dengan air kran

Meneteskan alkohol 95% di atas sediaan, lalu membiarkannya selama satu menit

Membuang sisa alkohol ke dalam mangkuk dan membilas sediaan dengan air kran

Meneteskan larutan Safranin di atas sediaan, lalu membiarkannya selama 30 detik

Membuang kelebihan larutan Safranin ke dalam mangkuk, lalu membilasnya dengan air kran

Mengeringkan sediaan secara hati-hati dengan kertas penghisap, lalu memeriksaya di bawah mikroskop

G. Data Tabel pewarnaan secara gram No koloni

Bentuk sel

Warna sel

Sifat gram bakteri

Basil

Ungu

Gram positif

Streptobasil

Merah

Gram negative

H. Analisis Data Pewarnaan bakteri yang digunakan adalah pewarnaan secara gram. Pada proses pewarnaan ini melibatkan zat warna utama yaitu Larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet, larutan alkohol sebagai peluntur atau zat yang melunturkan

zat warna utama, larutan iodium sebagai zat yang mengintensifkan warna utama, dan larutan safranin untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan warna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Ketika akan menggunakan alat baik berupa pipet berlubang atau pinset, ujungnya perlu dipanaskan untuk sterilisasi alat, selain itu sterilisasi juga dilakukan pada bagian tepi cawan ang berisi bakteri dalam mediumnya dan pada mulut beaker glass yanng berisi aquades steril. Setiap kali akan memberikan larutan baru, maka perlu pembilasan dengan air pada sediaan. Hal ini dimaksudkan agar larutan yang tadi digunakan pada sediaan tidak tercampur dengan larutan baru. Pada praktikum ini, juga dilakukan fiksasi yang berfungsi untuk melekatkan bakteri dengan kaca benda sehingga tidak terbawa air ketika dibilas. Dalam pengamatan praktikum Pewarnaan Secara Gram, teramati dua bentuk sel bakteri yang berbeda yang keduanya diambil dari koloni bakteri yang berbeda. Pada koloni bakteri yang pertama, teramati bentuk sel bakteri berupa basil (menyerupai batang) dan berwarna ungu. Warna ungu yang diakibatkan dari serangkaian kegiatan pewarnaan (pemberian larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet, alkohol, larutan safranin, dan iodium) menandakan bahwa bakteri pada koloni pertama merupakan bakteri gram positif. Sedangkan pada koloni bakteri yang kedua, teramati bentuk sel bakteri berupa basil (menyerupai batang) dan berwarna merah. Warna merah yang diakibatkan dari serangkaian kegiatan pewarnaan menandakan bakteri pada koloni kedua merupakan bakteri gram negatif. I. Pembahasan Praktikum pewarnaan secara gram ini bertujuan untuk memperoleh ketrampilan pewarnaan sel bakteri secara gram dan untuk menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa. Pewarnaan sel bakteri secara gram merupakan suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan in disebut juga sebagai pewarnaan diferensial.

Berdasarkan analisis data, koloni pertama dengan bentuk sel basil setelah pewarnaan berwarna ungu. Hal ini berarti koloni bakteri pertama memiliki sifat gram positif. Sedangkan koloni kedua dengan bentuk sel streptobasil, setelah pewarnaan berwarna merah. Hal ini berarti koloni bakteri kedua memiliki sifat gram negatif. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Pada pewarnaan gram digunakan beberapa zat warna. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garamgaram yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam (Rudi, 2010). Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Larutan Ammonium Oksalat sebagai zat warna utama Larutan Iodin yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan

diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan selama 2 menit sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan menggunakan safranin dan dibiarkan selama 30 detik. Setelah itu dibilas dengan air mengalir dan dianginkan. Setelah itu siap untuk diamati di bawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Rudi, 2010).

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda karena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dalam jumlah besar. Sedangkan bakteri gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan namun strukturnya lebih kompleks, dimana bagian terluarnya tersusun atas lipopolisakarida (rantai karbohidrat dan lipid). Bakteri gram negatif lebih berbahaya karena lipopolisakarida bersifat racun. Dan membran terluar bakteri gram negatif nemberikan perlindungan kepada bakteri gram negatif terhadap bertahan dari sel inang (Martha, 2011). Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Dindind sel bakteri berfungsi melindungi kerusakan sel dari lingkungan bertekanan osmotik rendah dan memelihara bentuk sel. Hal ini dapat dierlihatkan melalui plasmolisis dengan mengisolasi partikel selubung sel setelah sel bakteri mengalami kerusakan secara mekanik atau dengan penghancuran oleh lisozim. Jika seluruh sel diisolasi kemudian diberi lisozim, partikel dinding sel baktei (bukan archaebacteria) dapat lisis dengan perlakuan lisozim tersebut dan membentuk protoplas (Bakteri gram positif) dan spheroplas (bakteri gram negatif). Lisozim adalah enzim yang memutuskan ikatan -1,4glikosida antara asam-N-asetil glukosamin dengan asam-N-asetil muramat pada peptidoglikan sehingga dapat merusak dinding sel bakteri. Bateri gram positif dinding selnya relatif tebal yang sensitif terhadap lisozim. Protein dan polisakarida menyokong lapisan substruktur dinding sel.Bakteri gram negatif menunjukkan tiga lapis pembungkus sel yaitu membran luar, lapisan tengah yang merupakan dinding sel (lapisan murein) dan membran plasma dalam. Menbran luar mengandung fosfolipin, lipopolisakarida yang diketahui sebagai antigen permukaan O somatik atau endotoxin, dan berbagai protein, dimana protein (porin) dan lipoprotein jumlahnya sangat banyak. Peptidoglikan bakteri gram

negatif merupakan struktur tipe A. Diikat molekul lipoprotein secara kovalen (Kusnadi, 2003). Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm) (Rudi, 2010). J. Diskusi Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri gram positif dan gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam proses pewarnaan Gram! Jawaban : Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). K. Kesimpulan Pewarnaan sel bakteri secara gram merupakan suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gramnegatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan in disebut juga sebagai pewarnaan diferensial. Dari praktikum yang telah dilakukan, diperoleh bahwa bakteri dari koloni 1 termasuk bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu melalui pewarnaan Gram. Sedangkan bakteri dari koloni 2 merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah setelah dilakukan proses pewarnaan secara Gram. L. Daftar Pustaka Darkuni. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan Mikologi). Malang: FMIPA UM Kusnadi. 2003. Common Teztbook Mikrobiologi. Malang: JICA Technical cooperation project for development of science and mathematics teaching for primary and secondary education in indonesia (IMSTEP) Martha, Fajar. 2011. Morfologi Mikroba. (Online), (http://biologipedia.blogspot.com/2011/01/morfologi-mikroba.html), diakses tanggal 13 September 2012 Rudi. 2010. Bakteri dan Pewarnaannya. (Online), (http://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/), diakses tanggal 13 September 2012 Suriawiria, Unus. 1986. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Angkasa Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang