Anda di halaman 1dari 8

TEKNIK ANALISA BILOGI MOLEKULER

Tipe Modifikasi PCR dan Resume Jurnal

Ismi Nurjannah

125130101111058

2012-D

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2014

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Pada awal perkembangannya metode PCR hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, namun kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA. Saat ini metode PCR telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Metode PCR tersebut sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Dengan menggunakan metode PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 5109 mol) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Mullis dan Fallona, 1989). Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan menggunakan komponen dalam jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan (template) yang diperlukan hanya sekitar 5 g, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini bisa dilakukan dalam volume 50 100 l. Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu: 1. DNA cetakan / DNA target Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target. 2. Primer Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu : a. Panjang primer : 15-30 pb b. Kandungan GC sekitar 50% c. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda d. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari e. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin 3. DNA Polimerase Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. 4. Buffer / Dapar Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 Yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. 5. dNTPS

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90 oC. Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu 1. Denaturasi Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94 oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan Dibuat 2. Penempelan (Annealing) Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik. 3. Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial. Sejak pertama kali diperkenalkan, teknik PCR telah berkembang sangat pesat dan diaplikasikan untuk bemacam-macam tujuan, baik untuk riset dasar maupun aplikasi praktis. Pada aspek metodologinya, teknik PCR yang pertama kali diperkenalkan memerlukan banyak kondisi khusus untuk menjamin keberhasilannya. Sebagai contoh, pada awalnya teknik PCR hanya digunakan untuk mengamplifikasi molekul DNA dengan menggunakan DNA sebagai bahan awal (starting material) yang akan digunakan sebagai cetakan. Dalam hal ini molekul DNA yang aakan diamplifikasi harus diisolasi terlebih dahulu dari sel atau jaringan. Perkembangan lebih lanjut teknik ini memungkinkan para peneliti menggunakan molekul RNA sebagai bahan awal, yaitu dengan berkembangnya teknik Reverse Trancriptase PCR (RT-PCR). Selain itu, sekarang juga dikembangkan teknik PCR yang tidak memerlukan langkah isolasi molekul DNA terlebih dahulu sebelum diamplifikasi. Dalam hal ini PCR dapat dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan sebagai bahan awal tampa harus melakukan isolasi DAN secara khusus. Dengan teknik ini, PCR dapat dilakukan di dalam sel

atau jaringan tersebut sehingga teknik ini dikenal sebagai PCR In Situ. Selain itu, teknik PCR sekarang juga dapat dilakukan secara efisien untuk amplifikasi molekul DNA yang panjang.terdapat beberapa tipe danmodifikasi dari PCR yaitu : 1. REAL-TIME PCR Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan dengan metode hibridisasi In Situ, northern blot, dot blot, atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease, atau dengan metode pengujian proteksi RNAse (RNAse protection assay). Teknik RT-PCR dikembangkan untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode PCR yang lain. RNA tidak dapat digunakan sebagai cetakan pada teknik PCR, oleh karena itu perlu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik. Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (DNA polymerase) yang bisa menggunakan molekul DNA (cDNA) sebagai cetakan untuk menyintesis molekul cDNA yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim yang bisa digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA polymerase. RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1-2 kb. Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV mempunyai aktivitas RNAse H yang akan meyebabkan terjadinya degradasi RNA dalam hybrid RNA-cDNA. Aktivitas semacam ini dapat merugikan jika berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama cDNA. Enzim RTase yang berasal dari M-MuLV mempunyai akyivitas RNase H yang lebih rendah dibanding dengan yang berasal dari AMV. Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37o C, sedangkan enzim AMV pada suhu 42o C dan Tth DAN polymerase mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60-70o C. Penggunaan enzim M-M-MuLV kurang menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn karena ion Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian, enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karena dapat digunakan untuk reaksi transkripsi balik sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi. Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam primer yaitu :

a. Oligo(dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang akna melekat pada ekor poli (A)pada ujung 3 mRNA mamalia. Primer semacam ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap. b. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian manapun. Primer semacam ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial). c. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu. 2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA. 3. Nested PCR Merupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksinested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer. Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di ke dua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan

mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama. 4. MULTIPLEX-PCR Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masingmasing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel 5. PCR-ELISA PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequentersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini jugaberguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

Resume Jurnal Judul jurnal : Identification of Meat Species by Polymerase Chain Reaction (PCR) Technique

Banyak metode yang dapat digunakan dalam identifikasi asal spesies dari daging mentah termasuk didalamnya sensor analisis, perbedaan histologi yang pada daging dapat digunakan sebagai acuan dalam identifikasi asal daging dalam hal ini yang dimaksud asal daging adalah jenis hewan ap, selain itu dapat juga menggunakan acuan jenis jaringan lemak, level glikogen dan jaringan otot yang dgunakan dalam uji elektroforesis dan DNA hibridisasi. Namun dua metode tersebut memilki kekurangan dalam spesifitas, compleksitas, biaya uji yang mahal dan beberapa syarat data dasar tentang perbedaan komposisi protein sehingga diperlukan metode yang lebih baik lagi. Dalam biologi molekular terdapat beberapa teknik ang dapat digunakan dalam identifikasi baik pada tumbuhan hewan ataupun pada bakteri diantaranya adalah PCR (polymerase chain reaction), RLFP (restriction fragment length polymorphism), dan RAPD (random amplified polymorphic DNA). Tehnik tersebut juga dapat digunakan dalam indentifikasi asal daging mentah. Dengan menggunakan metode PCR identifikasi daging dilakukan dengan menggunakan primer spesies spesifik yang menggunakan sensitifitas dari uji sehingga hasil yang didapatkan lebih akurat. Dalam melakukan uji digunakan sampel dari jaringan otot(daging) dari berbagai hewan yaitu kambing, babi, kuda,kucing, dan anjing. Yang dicampurkan pada daging sapi dengan konsentrasi yang berbeda beda. Daging sebelumnya dihaluskan dan dicampur dengan merata DNA diekstraksi dari sampel daging dengan sampel dihomogenkan dengan larutan TNES 4 ml yang mengandung 20 mM Tris dengan pH 8,0, 150 M NaCl dan 10 M. Dalam tabung poyprophilen kemudian 750 l hasil homogenisasi di mmasukan ke tabung ependorf 1,5 ml kemudian ditambahkan proteinase K dan 10 % SDS campuran itu kemudian di homogenkan lalu disimpan pada suhu 58 c selama 8 jam kemudian ditambahkan Nacl 6 M disentrifugasi kemudian lapisan teratasnya sebanyak 400 mikro liter dipindahkan ke tabung lain dan ditambah dengan 300 l phenol choloroform isoamyl alcohol dan dilanjutkan pada tahap-tahap selanjutnya hingga didapatkan ekstraksi DNA yang diinginkan. Kemudian DNA yang telah di ekstraksi digunakan dalam PCR. Dilakukan perbandingan antara DNA yang didapat dengan DNA asal masing masing hewan dan didapatkan hasil yaitu tidak ada interaksi atau terjadinya reaksi antara DNA dari masing masing jenis daging sehingga DNA dari tiap jenis daging hewan tetap terdetaksi saling memisah. Tdak ada primer yang saling bereaksi silang dengan DNA dari spesies lain. Uji ini berhasil pada pencampuran 5% 2,5% 1% dan 0,5% tapi tidak terbaca pada campuran 0,1 %.

Identifikasi asal spesies daging dan produk asal daging penting dilakukan karena sebab-sebab kesehatan, etika dan ekonomi. Jika dibandingkan dari beberapa teknik analisis yang ada diantaranya adalah immunodifusi, immunoelektroforesis, isoelectric focusing, dan hibridaisasi DNA dalam penentuan atau identifikasi spesies asal daging. Hibridisasi DNA lebih dapat diandalkan karena lebih sensitif walaupun dalam pelaksanaannya lebih rumit dan membutuhkan wakktu yang lebih lama. Selain itu biaya yang diperlukan juga cukup besar. Sedangkan dengan menggunakan teknik PCR dapat dilakukan identifikasi atau di deteksi adanya campuran daging dari spesies lain pada daging sapi dengan kadar 0,5% dengan menggunakan teknik duplex PCR. Hal ini menunjukan bahwa teknik PCR juga memiliki spesifitas yang tinggi dan dapat mendeteksi adanya campuran lain dalam daging ataupun bahan lainnya dalam jumlah kecil dan dapat digunakan dalam pemeriksaan pemalsuan bahan makanan. Dalam pengolahan daging dengan lebih dari 1 jenis spesies daging, bisa saja terjadi kontaminasi yaitu tercampurnya sebagian daging ke jenis daging lainnya karena selama proses menggunakan peralatan yang sama. Dengan alalisis PCR dapat dideteksi adanya kontaminasi atau campuran pada daging ataupun pemalsuan produk karena spesifitasnya yang tinggi maka walaupun kontaminasinya cukup rendat tetap dapat di identifikasi. Teknik PCR bisa jadi sangat berguna untuk efektifitas kontrol konsumen terhadap produk asal hewan khususnya daging dan pemalsuannya. Selain itu dapat juga digunakan untuk monitoring pakan ternak ruminansia dari bahan asal hewan yang banyak dilarang di berbagai negara karena dapat menyebabkan bovine spongiform enchephalophathy