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ALEGRA,V. NAVARRO ,M.R.

MICOLOGA MDICA

2012

PRACTICA N1 TCNICAS MICOLGICAS


Las tcnicas micolgicas son el conjunto de operaciones y observaciones de laboratorio, que Permiten el estudio morfolgico e identificacin de los hongos y de cuyo resultado se llega a la sistemtica de los hongos y de cuyo resultado se llega a la sistemtica de esos organismos. I. OBJETIVOS: 1. Conocer las caractersticas y utilidad de los materiales de uso frecuente en el laboratorio de micologa. 2. Conocer las principales tcnicas en el estudio de los hongos. II. MATERIALES: 2.1. MATERIAL DE VIDRIO Placas de Petri. Cajas cilndricas de dimetro variable; las ms usadas son las de 100 x 150 mm de dimetro; se emplean como recipientes de medios de cultivo para el aislamiento y cultivo de los hongos. Tubos Oe ensayo.- Tubos de tamao y dimetro variables; se emplean pana cultivos puros, estudios morfolgicos y bioqumicos. Existen tubos con tapas de bekelita para la mejor conservacin de los hongos. Matraces.-Recipientes de forma esfrica y base plana, de capacidad variable. Se utilizan para la preparacin de medios de cultivo' Erlenmeyer.- Frasco de forma cnica y cuello corto con capacidad variable; de utilidad similar a los matraces. Kitasato.- Frascos similar a los Erlenmeyer se caracterizan por sus paredes gruesas y una tabuladora lateral en el cuello Probetas.- Recipientes graduados de forma cilndrica y de capacidad variable. Se utiliza para medir lquidos y soluciones de cultivo Fiolas.- Recipientes aforados a medidas exactas. Se emplean en la preparacin de reactivos y soluciones de concentraciones conocidas. Pipetas.- Tubos cilndricos graduados terminados en punta; se aplica en la medicin de lquidos en Pequeos volmenes. Pipetas Pasteur.- Pipetas con porcin capolar de dimetro 0.5 - 0.8 mm.; se aplica para la toma de pequeos inoculos de siembra. Portaobjetos.- Lminas de vidrio, comn de forma rectangular; se utiliza en las preparaciones microscpicas. Cubreobjetos.- Lminas de vidrio muy delgado de forma cuadrada; se utiliza en las preparaciones en fresco, conjuntamente con el portaobjetos. Otros.- frascos de diluciones, frascos de Roux, esptula de Drigalsky, embudos, jeringas hipodrmicas, termmetros, cmara de Neubauer, perlas de vidrio, viales y varillas de vidrio.
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2.2. APARATOS Microscopio.- Aparato ptico que aumenta el tamao de los microorganismos hacindoles ms perceptibles Estereoscopio.- Aparato que permite observar tubos o cajas de Petri con cultivos, dndonos imgenes en relieve Autoclave.- Se utiliza para la esterilizacin de los medios de cultivo y otros materiales que se altean por el calor. Seco; esteriliza a 12O oC, 15 lbs., 15 minutos. Horno.- Se utiliza para someter materiales s resistentes al calor llevadas a To con fines de esterilizacin (170oC), ejemplos: placas de Petri, tubos de prueba, pipetas, frascos, jeringas, etc. Estufa.- Aparato para proporcionar temperatura adecuada para el desarrollo y multiplicacin de los microorganismos. Bao Mara.- Mantiene constante la temperatura del agua en un recipiente. Se emplea para licuar medios y en la inactivacin de sueros. Balanza.- Se utiliza para pesar sustancias componentes de bs medios de cultivo y reactivos. Centrifuga.- Se utiliza pana la separacin de slidos suspendidos en lquidos. Potencimetro.- Mide el, pH I de los medios y soluciones de cultivo. Espectrofotmetro.- Aparato para medir la turbidez de una suspensin celular, utilizando un prisma, para generar un tipo de luz incidente de banda estrecha. Cuenta colonias. Aparato destinado a facilitar el recuento de colonias bacterianas. 2.3. OTROS MATERIALES Aguja y asa de Kolle.- Varillas metlicas que llevan en su extremo alambre cuando el alambre es recto se llama aguja y cuando el alambre forma un anillo de dimetro variable en su extremo, se denomina asa de Kolle, Mechero de Bunsen.- Son metlicos con llave reguladora para medir la intensidad de la llama y de uso frecuente en la esterilizacin del asa de Kolle. Equipo de diseccin, esptulas, gradillas, rejillas de asbesto, tapones de jebe, mangueras de jebe, bandejas de fierro enlosado, ollas metlicas, papel indicador de pH, papel kraft, pabilo, portaplacas, etc. 2,4. MEDIOS DE CULTIVO Medio de de Sabouraud: Es un medio recomendable para el aislamiento e identificacin y conservacin de hongos. Frmula: Peptona 10.0 g Glucosa 40.0 g Agar 20.0 g Agua destilada 1000.0 ml pH: 5.6
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Preparacin.- Disolver los ingredientes y, regular el pH a 5.6, autoclavar a 15 lbs. de presin por 15 minutos. Repartir en placas Petri estriles y en tubos de prueba Agar Czapek Dox: Es un medio sinttico para el cultivo de hongos, en el que el nitrato es la nica fuente de nitrgeno. Frmula: Sacarosa 30.0 g Nitrato sodio 3.0 g Sulfato de potasio 1.0 g Sulfato de magnesio 0.5 g Sulfato ferroso 0.01 g Cloruro de sodio 0.5 g Agar 20.0 g Agua destilada 1000.0ml pH: 7.3 Preparacin.- Se disuelven las sales en 500 ml. de agua, se ajusta al pH a 2.3 y se aade la sacarosa, se disuelve el agar en 500 ml de agua. Se mezclan las dos soluciones, se envasa en tubos y matraces y se esteriliza en autoclave a 115oC durante 10 minutos. AGAR PAPA DEXTROSA: Este medio permite el desarrollo de la mayor parte de las especies, por lo que lo recomendamos como medio de conservacin y desarrollo de los hongos. Frmula: Papas cortadas 250,0 g Dextrosa 10,0 g Agar 20,0 g Agua destilada 1,000 g pH:5,6 Preparacin.- Peladas las papas, se cortan en pequeos trozos, se lavan y se ponen en una olla con el total del agua. Se deja hervir por 50 minutos, se decanta, se filtra por algodn y se completa a 1.0 litro. Se le agrega la glucosa y el agar. Se funde en autoclave, se filtra por algodn o por papel, se reparte en tubos y frascos, y se esteriliza durante 20 minutos a 3/4 atm. MEDIO DE WAKSMAN: Este medio se emplea pana el recuento de hongos del suelo. Frmula: Glucosa Peptona Fosfato monopotsico Sulfato de magnesio

5,0 g

10.0 g 1,0 g 0,5 g


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Agar Agua destilada

20.0 g 1,000 g pH: 4,0 Preparacin.- Disolver los ingredientes en agua caliente y esterilizar a 3/4 atm. por 20 minutos antes de utilizarlo, y a un lquido se le agrega cido sulfrico hasta un pH 3.8 a 4.0. AGAR OXGALL DE LITTMAN El medio agar Oxgall de Littman (agar con bilis de buey) con la adicin de estreptomicina, es una medio selectiva muy til pana el aislamiento primario de hongos. Frmula: Peptona 15,0 g Dextrosa 10,0 g Bilis de buey (Oxgall) 10,0 g Agar 20,0 g Cristal violeta 0,01 g Agua destilada 1,000ml pH: 7,0 Preparacin.- Se disuelven los ingredientes calentando. Se ajusta el pH a 7.0 y se aaden 10.0 ml de cristal violeta al 0.1 por ciento. Se esteriliza a 115oC durante 10 minutos. Antes de verter en placas, se enfra a 50oC y se aaden 300 - 500 . de estreptomicina/l 00 ml de medio.

AGAR MICOBIOTIC Sin: Agar Mycosel (BBL): Agar Selectivo para Hongos Patgenos (Merck). Este medio con la adicin de antibiticos (cicloheximide y cloramfenicol) faculta el aislamiento de los hongos patgenos a partir de materiales con gran flora microbiana. Frmula: Soytane (hidrolizado de soya) 10.0 g Dextrosa 10,0 g Cicloheximide (Actidione) 0.4 g Cloramfenicol (Cloromicetina) 0.05 g Agar 20,0 g Agua destilada 1,000ml pH: 6.5 MEDIO DE MARTIN: Este medio se emplea para el aislamiento de hongos del suelo. Frmula: Fosfato dipotsico 1.0 g Sulfato de magnesio 0.5 g Glucosa 10.0 g Soluc. acuosa rosa de bengala (1/3000) 100.0 ml Soluc. Acuosa de estreptomicina (30 mcg/ml 0.03 ml
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Soluc. de oligoelementos Agua destilada Agar

1,0 ml 900.0 ml 20,0 g pH 7,0 Preparacin.- Disolver las sales y aadir rosa de bengala. Distribuir en tubos y matraces y esterilizar a I 10oC por 20 minutos. Enfriar a 50oC y aadir la solucin de estreptomicina (30 . /ml de medio). AGAR INFUSION DE CEREBRO CORAZON (BHI): Se recomienda como medio selectivo slido para el cultivo de hongos patgenos aadiendo penicilina y estreptomicina al medo estril. Frmula: Infusin de cerebro de ternero 200.0 g Infusin de corazn de buey 250.0 g Proteosa-Peptona 10.0 g Dextrosa 2.0 g Cloruro sdico 5,0 g Fosfato disdico 2,5 g Agar 20.0 g Agua destilada 1000.0 ml pH 7,4 Preparacin.- Suspender 52.0 gramos de BHI agar en 1.0 l. de agua fra calentar hasta ebullicin para disolver el medio por completo. Se distribuye en tubos y frascos y se esteriliza en autoclave a 121oC por 15 minutos. Para hacer selectivo el medio se aade 20 Ul de penicilina y 4O . de estreptomicina/ml al medio estril a temperatura de 5055 oC.

AGAR SANGRE Este medio se emplea para el aislamiento de hongos patgenos dimrficos. Preparacin.- se funde el agar nutritivo y se deja enfriar a 45 oC, se agrega aspticamente 10.0 ml de sangre de conejo desfribinada, agitando hasta homogenizar y se reparte en tubos o placas de petri estriles. AGAR HARINA DE MAIZ: Se recomienda pana la produccin de clamidosporas por Candida albicans y para el cultivo de hongos fitopatgenos. Frmula: Infusin de harina de maz 50,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000.0 ml pH:6.0 Preparacin.- Se calientan 50 gramos de harina de maz amarillo en 1.0 L. de agua a 60 oC durante 1 hora. Se filtra a travs de gasa y se restaura el volumen. Se aaden 15 g de agar se calienta para disolver bien y se ajusta el pH a 6.0 envasando en matraces y esterilizando a 115oC durante 10 minutos. Puede

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aadirse glucosa al 2.0 por ciento (produce un desarrollo exuberante de algunos hongos). AGAR EXTRACTO DE MALTA: Este medio se emplea pana el cultivo de lavaduras. Frmula: Extracto de malta 4.0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0ml pH: 5,5 Preparacin: Se calienta los ingredientes hasta completa disolucin se ajusta el pH y se esteriliza a 115oC durante 10 minutos 4,0 g 15,0 g 1,0 g 0,5 g 20.0 g 1,000 ml pH:6.5 Preparacin.- Disolver las sales en 500 ml de agua; aparte disolver el almidn y el agar hasta ebullicin. Mezclar los contenidos y repartir en frascos y tubos, esterilizar a 115o por 10 minutos. AGAR JUDIAS DE LIMA: Este medio se recomienda para el cultivo de hongos fitopatgenos. Frmula: Infusin de judas de lima 62.5 g Agar 15.0 g Agua destilada 1000.0 ml pH: 5.6 Preparacin.Suspender 23 g de medio en 1.0 L. de agua destilada fra y se calienta hasta ebullicin, se distribuye en tubos y matraces y se esteriliza en autoclave a 115oC por 10 minutos. MEDIO DE GORGDKOWA: Este medio se emplea para la esporulacin de levaduras. Frmula: Peptona 10.0 g Extracto de carne 10.0 g Cloruro de sodio Glucosa 5.0g Agar 2.5 g Agua destilada 1000.0 ml pH: 6.5 Preparacin.- Disolver los ingredientes hasta completa ebullicin, ajustar el pH a 6.5 y esterilizara 115oC durante 15 minutos.
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AGAR ALMIDON EXTRACTO DE LAVADURA (YpSs) Extracto de levadura Almidn soluble Fosfato dipotsico Sulfato de magnesio 7 H2O Agar Agua destilada

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MEDIOS MISCELANEOS: Para Chytridlales.- Semillas de camo; cereales, higuerillas, girasol; hojas jvenes, celofn; papel filtro; polen y otros sustratos orgnicos. Para Queratinofilicos.- Plumas; pelos; cerdas; cuernos y otros.

2.5. REACTIVOS 2.5.1. COLORANTES: AZUL DE TRIPAN.- Se utiliza con el lacto fenol para la tincin de las estructuras de hongos. Frmula: Fenol cristalizado 20.0 ml Acido lctico 20.0ml Glicerina 40.0 ml Agua destilada 20.0 ml Preparacin.- Se disuelven los ingredientes a 70oC y aadir 0.05 g. de azul de tripn o azul de algodn. COLORANTE DE GUEGUEN Se utiliza en la coloracin de estructuras citoplasmticas de hongos Frmula: Acido lctico 100.0 g Sudan lll 0.1 g Azul 'Cotton'(C4B Poirrier) 0.1 g Soluc. Iodo alcohlica X a XXX gotas Preparacin.Se disuelve el Sudan lll en el cido lctico; por titulacin en un mortero, luego se somete a un ligero calentamiento, hasta a que tome color miza, se deja enfriar y en reposo por 24 horas: se filtra y se agrega el Azul de algodn y la solucin de iodo. (Se conseja en frascos de color caramelo). COLORANTES VITALES Colorantes de poca toxicidad que permite visualizar mejor algunas estructuras protoplasmticas de los hongos. Entre los colorantes vitales ms usados tenernos: rojo neutro, rojo de Congo, azul brillante de cresilo, azul de metileno, azul nilo, violeta de metilo y verde Janus en solucin al 1: 1000. NIGROSINA Se utiliza pana coloraciones negativas de levaduras y hongos levaduriformes. Este colorante se usa el 10 por ciento. COLORANTES ESPECIALES Son de gran utilidad en micologa principalmente cuando se trata de colorear elementos que se encuentran en el pus, exudados, esputo, etc. entre estos tenemos: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa. Tambin se utilizan para la tincin de
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preparaciones histolgicas de animales inoculados con hongos patgenos: Hematoxilina-eosina, Metenamina argntica de Gomori, Acido de Schiff (P:A.S), colorante de Gridley y el Mucicarmn. 2.5.2. MEDIOS DE MONTAIE: LACTOFENOL Es muy satisfactorio para el montaje temporal o permanente de la mayora de hongos. Frmula: Fenol cristalizado 14.0 ml cido lctico 20,0 ml Glicerina 40,0 ml Agua destilada 20,0 ml Preparacin.Se disuelven los ingredientes a 70oC y se envasa en frascos goteros de 25 ml/c/u. JALEA GLIGERINADA Es til para el montaje de los hongos. Frmula: Fenol cristalizados 14,0 g Gelatina 1,0 g Glicerina 7,0 g Agua destilada 6,0 ml Preparacin.- Se disuelven los ingredientes y se aade la gelatina licuada, se mezcla y se envasa en frascos gotero de2 5 ml c/u. MEDIO DE HOYER'S Es usado para el montaje de Myxomycetos y Ascomycetos (Dr.R.K. Benjamn). Frmula: Glicerina 50,0 g Hidrato de cloral 30,0 g Goma arbiga 20,0 g Agua destilada 20,0ml Preparacin.Remojar la goma arbiga por 24 horas, aadir el hidrato de cloral y dejar la solucin hasta que todo el material se disuelva (esto puede requerir varios das) despus aadir la glicerina y la solucin esta lista pana su uso. MEDIO DE PATTERSON Se utiliza para observaciones sobre hongos tomados de medios de cultivo. Frmula: Soluc. acetato de potasio 20% 50.0 ml Glicerina 20.0 ml Alcohol de 95o 30.0 ml Preparacin.- Disolver los ingredientes en la solucin de acetato de potasio al 20 por ciento y envasar en frascos de 50 ml c/u.
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BALSAMO DE CANADA. Se utiliza para el montaje permanente de preparaciones de hongos. GLASO Se utiliza pana el sellado de las preparaciones de los cultivos de hongos en lmina. 2.5.3 .FIJADORES SOLUCION DE BOUIN Se utiliza pana la fijacin de flagelos de hongos m inferiores Achiya spp y Saprolegna Frmula: Soluc.satur. cido picrico 300.0 ml Formalina comercial 90% 100.0 ml cido actico glacial 20.0 ml Preparacin.Mezclar los ingredientes hasta completa homogenizacin y envasar en frascos de 50 y 75 ml C/u. SOLUCION DE CHAUDINN Se utiliza pana fijar preparaciones de hongos. Frmula: Soluc. Satur. PgCl2 2.0 partes o Alcohol de 96 1.0 parte Preparacin.Mezclar las sustancias hasta completa homogenizacin y conservar en frascos caramelo de 50 y 75 ml c/u. SOLUCION DE FORMOL Es uno de los fijadores que da mejor resultado en los estudios citoplasmticos y nucleares de los hongos. Se utiliza formol neutro comercial puro o diluido al 40%. CIDO SMICO Se utiliza pana la fijacin de hongos inferiores. Se usa en preparaciones al 1 por ciento. METANOL Se utiliza para fijar preparaciones en lmina y en microcultivos. Se emplea el metanol neutro q.p.

2.5.4. OTROS REACTIVOS Hidrxido de potasio al 10 %. Se utiliza como aclarante en proporciones microscpicas de muestras patolgicas con hongos. Glicerina al 10 por ciento. Se utiliza para evitar la desecacin de los cultivos en lmina.
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Solucin sulfocrmica Se utiliza en la limpieza de material de vidrio y en la desinfeccin de material contaminado. Formula: Bicromato de potasio 100.0 g cido sulfrico 100.0 g Agua destilada 1000.0ml Preparacin.- Disolver el bicromato y aadir el cido sulfrico, repartir en cubetas y frascos de 1.0 L. de volumen c/u. Solucin acuosa de glicerina al30 %: Se usa en preparaciones en fresco Solucin de alcohol iodado: Se utiliza en la desinfeccin de mesas de trabajo y de materiales contaminados con microorganismos. Solucin salina a 0.85 %: Se usa en la preparacin de suspensiones y diluciones de diferentes muestras conteniendo hongos. Solucin de bicloruro de mercurio a l1.0 %: Se usa en la desinfeccin de mesas de trabajo y de materiales contaminados con hongos.

III. MTODOS 3.1. TOMA DE MUESTRAS Los hongos a estudiar pueden ser tomados del hbitat natural, o bien, ya desarrollados, de los medios de cultivo. El material del laboratorio empleado para la toma de muestras, el de uso comn; para el trabajo de rutina, se utiliza, en primer lugar, el asa de kolle con alambre de platino dispuesto en forma de ansa, aguja, esptula y gancho, que permite efectuar con facilidad la mayor parte de manipulaciones necesarias para la toma de muestras. Cuando el material se debe tomar de la naturaleza, como por ejemplo de vegetales parasitados, se hace uso de cualquier instrumento cortante o pinza recogiendo los trozos de inters en cajas de Petri estriles y procedindose luego a efectuar otras manipulaciones como por ejemplo: disgregaciones, tratamiento con cidos orgnicos, otros, segn la finalidad perseguida. 3.2. SIEMBRA Y AISLAMIENTO: Siembra; son las manipulaciones que se efectan con el fin llevar microorganismos a un medio de cultivo para obtener su desarrollo en forma pura. Para la siembra se utiliza el asa de kolle y agujas de platino ya citados. Cuando el material a sembrar se encuentra en medio lquido, puede reemplazarse el asa de kolle con pipetas graduadas o pipetas Pasteur. Para la siembra de levadura u hongos levaduriformes se utiliza el ansa; pana los filamentos o s se utilizan el gancho con el que se extrae un trozo de micelio. Para los hongos consistentes se puede utilizar la esptula, con la que se corta un trozo del desarrollo costroso, que es que se trasplanta al medio de cultivo elegido. Como para todas las siembras bacteriolgicas, para efectuar las micolgicas es de fundamental importancia trabajar en habitaciones cerradas, sin corrientes de aire y tratando de mantener la mayor asepsia posible para evitar las contaminaciones de las
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cepas. Si estas tareas ya son de por s o delicadas en las siembras bacteriolgicas, aun mas se acrecientan los riesgos en las siembras micolgicas, puesto que, al tomar el material, generalmente se ponen en suspensin en el aire gran cantidad de esporas que contaminan el ambiente. Para evitarlo, muchos autores recomiendan trabajar con las mesas humedecidas previamente con una solucin de HgCl2 al 1% o solucin de fenol al 5% o cubrir la mesa donde se trabaja con paos humedecidos o con naftalina. Es importante recordar que las maniobras deben realizarse con rapidez y sin brusquedad. Para realizar la siembra en tubos de ensayo con medio liquido/slido, se siguen los siguientes pasos: 1. Sostener la cepa y el tubo del medio de cultivo (izq.) cuidando que se encuentren a la misma altura y con alguna separacin. 2. Sosteniendo con la otra mano al asa de kolle, esterilizar la aguja a la llama del mechero hasta enrojecerlo. 3. Extraer los tapones al mismo tiempo con la mano derecha, flamear las bocas mientras se sostienen las torundas y el asa de kolle. 4. Enfriar la aguja en el medio de origen, introducirlo en el tubo con la tapa y tomar una pequea cantidad de material. 5. Tocar la superficie del medio o depositar en l un trocito de micelio. 6. Flamear suavemente las bocas de los tubos, colocar los tapones e incubar a 25'oC por 5 das. Cuando se desea obtener colonias gigantes de mohos y levaduras se toma una pequea cantidad de material a sembrar, y se deposita en la parte cntrica de la superficie del medio de cultivo slido dispuesto en una placa Petri, frasco o en un matraz. El crecimiento en estas condiciones es tpico pana la mayor parte de los hongos, que producen una colonia de gran tamao, conocida con el nombre de "colonia gigante. Aislamiento, los hongos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, produciendo procesos de los ms variados: rara vez se los encuentra al estado puro. Como generalmente en un mismo hbitat existen simultneamente muchas especies de microorganismos para obtener los cultivos al estado puro es preciso separar o aislar recurriendo frecuentemente a las tcnicas de aislamiento. El aislamiento puede ser 3.2.1. En medios slidos, Que pueden agruparse as. Por diluciones sucesivas: Se puede obtener colonias visibles a partir de una mezcla microbiana, diluyendo la muestra en agua estril o aislar solucin salina y utilizando un medio como Sabouraroud, agar papa dextrosa o Czapek enfriado a 45o C e incorporarlo luego sobre una placa Peti estril. TCNICAS: a. Se toman 3 o ms tubos /frascos conteniendo c/u alrededor de 15 ml de medio de cultivo; se funden a bao maria y dejarenfiiar45oC. b. Con un asa se toma el material que contiene la mezcla microbiana; guardando las condiciones de asepsia, se siembre en el primer tubo, agitando el ansa. De esta dilucin se vuelve a tomar una azada de material que se diluye en el segundo tubo, de igual modo como se hizo en el primero. c. Proceder sucesivamente y en idntica forma con los otros tubos
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d. El contenido de estos tubos se vierte en sendas placas Petri, abriendo estas lo menos posible para evitar la contaminacin. e. Agitar por rotacin para mezclar y distribuir bien el material y se dejan solidificar sobre superficie plana. f. Incubar a la temperatura adecuada por 5 a 7 das. Por agotamiento en superficie La siembra puede hacerse: a. Por extensin en superficie: Consiste en distribuir una(s) gota(s) de la suspensin por la superficie del medio de cultivo contenido en una placa Petri y empleando la esptula de drigalsky. Luego sin cargar la esptula nuevamente, se pasa por la superficie de otra placa y en la misma forma con las dems placas preparadas. b. Por estras con ansa en superficie: Se diferencia del anterior mtodo en que, en lugar de usar la esptula de drigalsky, se utiliza la aguja o el ansa cargada del material sobre la superficie de la primera a la ltima placa, o bien siguiendo con el ansa una de las tcnicas de siembra conocidas. c. Por siembra espontnea: Consiste e en colocar abiertas, en lugares apropiados y durante tiempos variables, placas de Petri conteniendo el medio de cultivo elegido. Al cabo del tiempo establecido, se cierran nuevamente las placas con su correspondiente tapa y se incuba a temperatura ambiente. Por lo comn, se emplea este mtodo Para estudiar la flora: micolgica del aire o ambiente de una localidad. 3.2.2Por mtodo electivos Por las propiedades biolgicas: Este mtodo se basa en la accin selectiva de resistencia de las esporas de hongos con respecto a la bacteriana frente a la accin de los cidos orgnicos corno el cido ctrico; permitiendo aislar algunas especies de hongos que se encuentran contaminados con bacterias. TECNICAS: a. Suspender el material conteniendo esporas de hongos en cido durante 3 a 6 horas. b. Al cabo de este tiempo, sembrar este material en medios especiales para hongos. c. Incubar a la temperatura adecuada. d. Aislar las colonias en medios especiales pana hongos. 3.2.2. 1.Por el empleo de organismos receptivos: Esta tcnica se basa en el empleo de las propiedades patgenas que poseen muchos hongos para los animales o vegetales, siendo de utilidad cuando se desea aislar determinados hongos. TECNICAS a. El material que contiene el hongo patgeno se inocula en un receptivo y dejar en una jaula metlica por espacio de 30 das. b. Sacrificar el animal y observar las lesiones caractersticas en los rganos enfermos, operando en condiciones de asepsia estricta" c. Realizar la siembra por extensin superficial de los rganos enfermos medios especiales para hongos patgenos. d. Aislar las colonias en medios para hongos.
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3.2.2.3. Por velocidad de desarrollo: Se basa en la utilizacin de un medio de cultivo apropiado para la especie donde esta desarrolle muy rpidamente; de manera que si se siembra una mezcla de microorganismos desarrollara primero el que nos interese, pudindose esperar entonces con facilidad. Muchas levaduras desarrollan con gran rapidez, por lo que pueden ser aisladas en base a esta propiedad. 3.3.POR CULTVOS MONOCELULARES Consisten en obtener un cultivo puro originado de un solo elemento del hongo. Estas tcnicas se utilizan generalmente para obtener cultivos a partir de esporas. Tambin son denominadas "monocitogenticas" tienen muchsima importancia por su aplicacin en gentica, industria o en investigaciones especiales. Los mtodos ms empleados son los siguientes: Mtodo de Lindner Mtodo de Hansen Mtodo de Burri Tcnica de Kleitt Tcnica de Georg f. Tcnica de Lambert Estos mtodos se describen con ms detalles en el Manual de Prcticas de Microbiologa industrial. IV. IDENTIFICACIN La identificacin de los hongos se hace en base a los caracteres morfolgicos microscpicos y a los caracteres macromorfolgicos del desarrollo, es por eso por lo que las tcnicas de observacin pueden ser macroscpicas y microscpicas. 4.1. Observacin Macroscpica: se toman en cuenta todos los caracteres morfolgicos de la colonia: forma, aspecto, color, consistencia, tamao, estructura, tipo de crecimiento, pigmento, desarrollo sectorial, zonas, reverso, etc. 4.2. Observacin Microscpica: Permiten estudiar los caracteres microscpicos de los hongos: micelio, esterigmas, rganos de reproduccin, rganos de fijacin, esporas, etc. Tcnicas: a. Observacin con lupa: Permite la observacin de hongos de grandes dimensiones. Es til para seguir el desarrollo, sin necesidad de manipuleos de los cultivos. b. Observacin con estereoscopio: Permite observaciones de cultivos en tubos y placas con toda facilidad, dndonos imgenes en relieve. c. Observacin con microscopio de bajo aumento in vivo y a fresco : Se incluyen en este grupo de observaciones que se efectan con material entre portaobjeto. Pueden ser: c.1. Directas. Se efectan tomando una pequea cantidad de material, la que se deposita sobre un portaobjeto. Cuando el hongo desarrolla en medio lquido, se lo toma con una pipeta Pasteur sise trata de un hongo filamentoso, se extrae con el ansa en gancho, disgregando cuidadosamente con las agujas de diseccin, con una gota de solucin acuosa de glicerina al 30% o lactofenol.
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c.2. Por coloraciones vitales. Permiten estudiar estructuras coloreadas sin provocar mayores alteraciones de los elementos a observar y se hace uso de los llamados colorantes vitales" caracterizados por su poca toxicidad para el hongo. La tcnica ms usada es a de disociar el material fngico sobre una gota de colorante muy diluido (1/1000 o ms). Colocar un cubreobjetos y observar. c.3. Cultivo en lmina. Es un procedimiento muy til para observar estructuras fngicas microscpicas, tales como: micelio, esporangios, esporas, etc. La tcnica consiste en sembrar el material fngico en las mrgenes de un bloque pequeo de agar dispuesto en el centro de una porta objeto estril. Se incuba en una placa Petri y se sostiene sobre una varilla en U y en cmara hmeda con agua glicerinada para impedir la desecacin. Se examina peridicamente con lentes de pequeo aumento (10x, 40x) y luego se; procede al montaje con azul de tripn y se observa para su identificacin. d. Observacin en fondo obscuro: El material se suspende sobre un portaobjeto utilizando cualquier diluyente, y se observa al microscopio con iluminacin para fondo obscuro (ver detalles en un Manual de Microscopa). V. CUESTIONARIO 1 Qu importancia tiene conocer los materiales y mtodos en un estudio micolgico? 2. Qu diferencias encuentra entre las tcnicas bacteriolgicas y micolgicas? S, Qu finalidad tiene el utilizar colorantes, fijadores y medios de montaje en el estudio de los hongos? 4. Qu relaciones encuentra entre los medios de cultivo utilizados en micologa con los requerimientos nutricionales de estos? 5. Qu es un cultivo puro en trminos micolgicos?

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PRCTICA N O2 TCNICA DEL MICROCULTIVO


INTRODUCCIN Con esta tcnica se obtienen las distintas fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora, formacin del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de las estructuras reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar las estructuras desde el inicio de su formacin. Esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos en los que es difcil observar la formacin de los conidios sobre los conidiforos y la forma y estructura de stos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulacin en todos sus detalles y as tener elementos morfolgicos de estructuras somticas y reproductivas completas para as poder hacer la identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los hongos como agentes causales de enfermedades. I. OBJETIVO 1. Observar los procesos de evolucin y desarrollo mediante observaciones peridicas hasta obtener una perfecta formacin de las estructuras de los hongos. 2. Adiestrar al estudiante en la prctica de esta tcnica importante en el estudio microscpico de los hongos. II. MATERALES: Placas Petri estriles con una lmina y una varilla de vidrio en U o V en su interior. Placas Petr con medio de Sabouraud. Frascos con agua destilada estril. Laminillas. Bistur, pinzas, agujas de diseccin y asa de kolle en gancho. Colorantes y reactivos: metanol neutro, lactofenol con azul de tripn y glaso (esmalte de uas). Tubos con cultivos de hongos ambientales y de suelos: - Penicillium sp. Helminthosporiun sp. - Aspergillus Sp. Fusarium sp. - Altemaria sp Rhizopus sp. - Cladosporium sp. Verticillium sp. - Stemphvlium sp. Trichoderma sp lll. PROCEDIMIENTO. 1. En condiciones estriles, y con ayuda del bistur, cortar el agar glucosado de Sabouraud en pequeos rectngulos de aproximadamente 1 x 0.5 cm y 2 - 3 mm de espesor.
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2. Colocar un bloquecito de agar sobre lmina portaobjeto. 3. Sembrar mediante el asa de kolle en gancho una pequea porcin del hongo en estudio en los extremos del pequeo rectngulo y cubrir la preparacin con un cubreobjetos. 4. Adicionar 10 a 15 ml de agua destilada estril tiene una solucin acuosa de glicerina al 10% en el interior de la placa. 5. Dejar a temperatura ambiente (18-22oC) durante 5 e 7 das. 6. Examinar peridicamente (das) al microscopio con objetivos de menor aumento (10x y 40x), hasta observar un desarrollo completo. 7. Proceder al montaje de la preparacin siguiendo la tcnica indicada a continuacin: a. Sacar el cubreobjetos y colocarlo sobre una lmina limpia con la cara inferior hacia arriba. b. Eliminar el l pequeo rectngulo de agar en un recipiente con solucin sulfocrmica. c. Colocar la lmina en la estufa por 30 minutos para permitir secar bien las estructuras fngicas. d. Adicionar unas gotas de metanol neutro sobre una lmina con h finalidad de fijar el hongo. e. Teir con lactofenol y azul de tripn durante 15 a 30 minutos. f. Secar y limpiar los bordes con papel filtro. g. Sellar con glaso o hacer un montaje permanente con blsamo de Canad. 8. Determinar los elementos y caractersticas del hongo en estudio IV. RESULTADOS: - Esquematice la tcnica del microcultivo seguida en la prctica. - Hacer un esquema de los cultivos de hongos observados al microscopio. V. CUESTONARIO: 1. Qu otra tcnica resulta til en la identificacin de los hongos? 2. Qu estructuras citoplasmticas se tien con bs colorantes vtales? 3. Cul es la finalidad de utilizar el lactofenol con el azul de tripn simultneamente en Ia atencin y montaje de preparaciones obtenidas por la tcnica del cultivo en lmina?

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PRCTICA

No 03

RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS FNGICAS


Para la identificacin o determinacin de hongos con fines de diagnstico o estudios taxonmicos es necesario observar estructuras fngicas con alta nitidez, contraste y se utilizan diversos compuestos qumicos que permitan tincin diferencial entre las paredes y citoplasma de las clulas fngicas. I. OBJETIVO: Reconocer y familiarizarse con las caractersticas microscpicas y microscpicas de los hongos. II. MATERIALES: Placas y tubos con cultivos de hongos ambientales y de suelos. Lminas porta y cubreobjetos. Agujas de diseccin y aguja de kolle. Microscopio. Colorantes y reactivos: Lactofenol, rojo neutro (1/1000), rojo de congo (1/1000) y azul, de metileno (l/1000), azul de tripn.

III. PROCEDIMIENTO: 1. Hacer el estudio macroscpico de los hongos desarrollados en tubos y placas Petri y anotar los siguientes aspectos: forma, color, consistencia, pigmento, tipo de crecimiento, etc.; y otras caractersticas en el reverso, etc. 2. Hacer preparados en fresco" entre lmina y laminilla con lactofenol y azul de tripn u otros colorantes vitales y observar al microscopio con objetivo de 10x y 40x. 3. Reconocer los elementos constituyentes del hongo, como: ranos de reproduccin, hifas, micelio, esterigmas, esporangios, rganos de fijacin, esporas, conidios, fructificaciones, etc. 4. Hacer un esquema de los hongos observados, anotando sus estructuras microscpicas. IV. RESULTADOS: Resuma en un cuadro las principales caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas de los hongos observados. V.CUESTIONARIO:

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1. Qu importancia tiene el reconocimiento, de los elementos fundamentales de los hongos? 2. Por qu es preferible utilizar el azul de tripn y no el azul de algodn en la tincin de los hongos? 3. Defina las siguientes estructuras fngicas microscpicas: a. Conidios: b. Rizoides: c. Dictiospora: d. Esporangio:

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PRCTICA N 0 4 AISLAMIENTO DE HONGOS AMBIENTALES CONTAMINANTES


INTRODUCCIN Los hongos, que se encuentran con relativa frecuencia en la naturaleza, sobre los frutos en putrefaccin, semillas, forrajes, cueros, maderas, etc. tambin se les encuentra normalmente en el suelo. Para aislarlo se tiene en cuenta su estado natural, procedimiento luego de acuerdo con las tcnicas conocidas. I. OBJETIVOS: 1. 2. 3. 4. Demostrar la existencia de hongos ambientales contaminantes. Dar una idea de su incidencia cualitativa y cuantitativa de los principales gneros. Familiarizar al estudiante con las principales estructuras fngicas Relevar la importancia de su conocimiento en micopatologa.

II. MATERALES: Placas de agar sabouraud expuestos al medio ambiente de diferentes lugares (7 das antes de las prcticas) Cultivos de hongos en tubos con agar sabouraud: Aspergillus Cladosporium Helminthosporium Rhizopus Penicillum Alternaria Lminas y laminillas. Asa de klle, agujas de diseccin, estiletes y papel filtro.

III. PROCEDIMIENTO: 1. Hacer el estudio macroscpico de lascolonias expuestas al ambiente comparando con los cultivos en tubos. Anotar bs siguientes caractersticas culturales como aspectos, tamao, color (anverso y reverso), aspecto, consistencia, pigmento, etc. 2. Hacer el estudio microscpico a base de preparados con azul de tripan y observar con objetivo de menor mayor aumento. 3. Distinguir los elementos constituyentes del hongo, tales como: hifas, micelio, rganos de reproduccin, esterigmas, esporangios, esporas, conidios, rganos de fructificacin, etc. 4. Hacer un esquema de bs hongos observados, anotando sus principales estructuras.
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IV. RESULTADOS: Resuma en un cuadro las principales caractersticas micro y macroscpicas de los hongos Observados. GNERO/ HONGO CARACTERES MACROSCPICAS CARACTERES MICROSCPICAS

V. CUESTIONARIO: 1. Qu importancia tiene el estudio de hs hongos ambientales? 2. Qu finalidad tiene la investigacin de los hongos ambientales contaminantes?

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PRACTICA N 05 AISLAMIENTO DE HONGOS QUERATINOFLICOS


INTRODUCCIN La diversidad de los hongos todos depende de los sustratos orgnicos e inorgnicos que son fuente potencial de estos organismos. El suelo constituye un buen hbitat natural para muchas especies de hongos y ha sido objeto de mltiples estudios a lo largo de dcadas en distintos lugares de todo el mundo. Tambin el aire, la superficie de hojas y tallos vivos, el guano, los insectos, el agua, la tierra y muchsimos ms. Los hongos queratfilos existen, junto a hongos con otra modalidad econutricional, en comunidades asentadas en diversos hbitats naturales o en los generados por el hombre. La composicin cualitativa y cuantitativa de las comunidades depende de una variedad de factores fsicos, qumicos y biolgicos: composicin qumica del suelo, pH, la vegetacin circundante, lo presencia de pequeos y grandes animales y factores climticos. Las especies queratinoflicas han sido divididas en tres categoras de acuerdo a sus hbitats naturales: antropoflicas, cuando el ser humano es su hospedador natural, zooflicas, cuando una variedad de animales actan como hospedadores naturales y geoflicas cuando el suelo es el hbitat natural. Estas categoras incluyen tanto los dermatofitos (especies de cualesquiera de las tres categoras que infectan el estrato crneo del hombre y los animales) como especies saprofitas. Las especies queratinolticas se definen como aquellas capaces de destruir la queratina, mientras que las queratinoflicas slo son capaces de utilizar los materiales asociados con la queratina o los que resultan despus de su degradacin. I. OBJETIVOS
1. Aislar cualitativamente las especies de hongos queratinoflicos en diferentes suelos. 2. Determinar la frecuencia y distribucin de las especies de hongos queratinoflicos.

II. MATERIALES:
Muestras de suelos de habitaciones, corrales, establos, patios escolares, otros. Placas Petri, tubos estriles. Placas Petri estriles con material para microcultivo. Medios de cultivos agar micobiotic y agar glucosado de sabouraud. Cerdas de caballo, cuernos de bovino, cerdas de sajino, plumas de aves y otros. Colorantes y reactivos: lactofenol y azul de tripn. Frascos con agua destilada estril. Lminas porta y cubreobjetos Asa de kolle, estilete, agujas y bistur estriles. Tamiz (malla N25). Pgina 21

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III. PROCEDIMIENTO: 1. Tamizar las muestras de suelos, eliminando materiales y residuos orgnicos, pajas, guijarros, etc. Mezclar y homogenizar. 2. Llenar las placas Petri estriles hasta la mitad con muestras de tierra. 3. Adicionar 15 a 20 ml de agua destilada estril a la tierra (eliminar el exceso de agua cavando pequeos hoyos en el suelo). 4. Esparcir o plantar con una pinza estril el material queratnico sobre la superficie de la 5. tierra. (p. e. 20 pelos/cerdas x placa). 6. Incubar a temperatura ambiente (18-22o C) en la obscuridad por espacio de 4 a 6 semanas. 7. Examinar peridicamente; observando directamente bajo la lente de menor aumento del microscopio, el desarrollo de las hijas a lo largo de la columna del pelo u otro material queratnico 8. Remover el material queratnico con el crecimiento fngico y colocar en placas con agar micobiotic (p.e. 2-4 pelos, x placa). 9. Incubar a25-28oC por I a 2 semanas. 10. Registrar los caracteres morfolgicos de las colonias e identificar gnero/especie mediante la tcnica del microcultivo. 11. Transferir los cultivos puros a agar glucosado de sabouraud a 2% y conservar para confirmacin posterior IV. RESULTADOS: Resuma en un cuadro las caractersticas morfolgicas macro y microscpica de los hongos queratinoflicos identificados. V. CUESTIONARIO: 1. Qu son hongos queratinoflicos e indique su importancia? 2. Qu especies son patgenos para el hombre?

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PRCTICA N06 AISLAMIENTO DE HONGOS DERMATOFITOS EN ANIMALES


INTRODUCCIN. Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonmicamente relacionados que tienen capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel, pelo y uas) del hombre y animales y producir una infeccin llamada: Dermatofitosis, o conocida comnmente como Tia. Las infecciones por dermatofitos de la piel no presentan una nica manifestacin clnica siendo muy variables, desde sntomas leves, hasta lesiones supuradas e inflamatorias intensas y su apariencia depende en gran medida de la zona del cuerpo afectado. Poseen agentes etiolgicos que se clasifican en 3 gneros: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton y pertenecen a la Familia Moniliaceae: Orden Moniliales Clase Hyphomycetes Phylum Ascomycota. GNEROS: 1- Microsporum: Macroconidios con espora predominante, voluminosos, de pared rugosa, multicelular, y fusiformes, formndose sobre los extremos de las hifas. Infectan habitualmente la piel y el cabello, pero rara vez las uas. Poseen color pardo, y se colocan "algodonosas" despus de dos a cuatro semanas de cultivo. Crecen bien en agar glucosado de Saboraud si se les cultiva a temperatura ambiente. 2- Trichophyton: Los microconidios que conforman sus esporas son lo ms predominante de ellos, aunque tambin pueden tener macroconidios con forma de lpiz, de pared lisa, con extremos romos, sin embargo, no es muy habitual. El cultivo donde las desarrollan va a depender si se pueden observar los conIdios, estos varan segn de la especie a la cual pertenecen. 3- Epidermophyton: Solo forman macroconidios en forma de mazo con una o cinco clulas, integrando colonias de color verdoso-amarillento, que muta con rapidez, formando color exagerado blanco estril. Invaden la piel y las uas, pero nunca el cabello. Por otra parte, segn la adaptacin de cada una de las especies o variedades de estos hongos a diferentes animales u otros reservorios ecolgicos, se dividen, clsicamente, en especies geoflicas, zooflicas y antropoflicas. I. OBJETIVOS: 1. Aislar cualitativamente las principales especies de hongos dermatofitos en animales domsticos 2. Determinar la incidencia de animales domsticos por hongos dermatofitos.
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II. MATERIALES: Tapices de lana de ovino con muestras de piel y pelos de animales domsticos (perros, gatos, bovinos, porcinos, equinos, aves y otros). Placas Petri con material para microcultivo estriles. Medios de cultivo: agar micobiotic, agar glucosado extracto de levadura, agar sabouraud con miel en placas y tubos. Colorantes y reactivos: lactofenol y azul de tripn. Lminas portaobjetos y cubreobjetos. Frascos de agua destilada estril. Asa de kolle, bistur, estilete y agujas de diseccin estriles.

III. PROCEDIMIENTO: 1. Frotar los tapices sobre la superficie de la piel del animal, recorriendo varias veces del tren anterior al posterior y partes laterales del cuerpo. 2. Colocar los tapices en sus estuches de papel kraft 3. Sembrar en placas con agar micobiotic por sacudimiento y suave presin. 4. Incubar a temperatura ambiente (22o C -25oC) por 7 a 15 das. 5. Registrar las colonias e identificar el gnero/especie de dermatofitos haciendo el estudio macroscpico y el cultivo en lmina para el estudio microscpico. para la identificacin auxiliar de manuales de micologa de Ajello; Vanbreuseghem y Conant. 6. Seleccionar y aislar las cepas en agar glucosado extracto de levadura para confirmacin posterior por el IMT e INS. *MT: lnstituto de Medicina Tropical Daniel A. Carrin -U.N.M.S.M. *lNS: lnstituto Nacional de Salud-MINSA IV. RESULTADOS: Resuma en un cuadro los hongos dermatofitos aislados e identificados. GNERO/ ESPECIE CARACTERES MACROSCPICAS CARACTERES DERMATOFITO MICROSCPICAS

Registre el N de colonias y anote la incidencia de animales portadores de dermatofitos X por ciento (%). V. CUESTIONARIO: 1. Qu .ventajas tiene el mtodo del tapiz (Mariat) en el aislamiento de hongos dermatofitos en animales y cul es su aplicacin en micologa mdica?
2- Seale que especies de hongos dermatofitos causan micosis superficiales en el hombre y en los animales.
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PRCTICA N 07
METODOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE HONGOS PATGENOS INTRODUCCION La investigacin de hongos patgenos puede ser practicada en procesos que afectan la piel y anexos o en cuadros sistmicos. Las tcnicas varan de acuerdo con la localizacin del proceso y en consonancia con el agente etiolgico probable. Esto significa que en gran parte los mtodos de trabajo, varan de acuerdo con los propsitos y por lo tanto: sera imposible dar una metodologa o modalidad diagnstica vlida para todas las formas clnicas de micosis. Sin embargo, puede intentarse una orientacin general sobre la base de las localizaciones ms frecuentes que adoptan las lesiones causadas por hongos patgenos. Estas consideraciones son vlidas en sus aspectos generales para cualquier campo de investigacin micolgica. 1. METODOS DIRECTOS 1. 1. TOMA DE MUESTRAS El primer paso a seguir es la toma de muestras: escamas de piel, pelos, exudados, pus, orina, materiales fecales, esputo, etc. Para obtener las escamas de piel se procede directamente aseptizar la lesin con un poco de alcohol (si es una lesin de tipo seco); se deja evaporar el alcohol y con la ayuda de un bistur o un portaobjeto, se raspa, recibiendo a las escamitas que se desprenden sobre un portaobjeto esterilizado previamente, por flameado; en caso de tratarse de una lesin hmeda, se procede a raspar con un bistur estril en forma suave, de tal manera que se evite el sangrado, y recibiendo dicho material sobre un portaobjeto estril. Cuando se trata de pelos se procede a extraerlos con una pinza estril depositndolos en un portaobjeto estril, ayudndose con un bistur se corta 1 o 2 pelos en trocitos pequeos (se utiliza para la siembra); a otros pelos se los recibe en placas Petri estriles, donde se pueden reservar para cualquier otra operacin. En el caso de pus o exudados, se puede extraer el material de acuerdo con, el tipo de lesin; en la generalidad de los casos, un hisopo estril sirve para extraer el material, desde donde se puede a su vez, tomarlo para realizar los cultivos o las observaciones directas; de acuerdo con el tipo de zona donde se encuentra la lesin, se har uso de instrumentos para ayudar a la extraccin (sonda, espculo, pinza, baja lengua, etc.). Tambin puede aislarse de materiales fecales, orina, esputo, etc. en estos casos, el material se recibe en placas Petri en recipientes estriles. 1.2. OBSERVACIN DRECTAS 1.2.1. Examen en fresco.- Cuando se trata de pus, exudado, lcera, esputo; liquido cfalo raqudeo, etc., conviene efectuar una observacin directa entre porta y cubreobjetos,
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diluyendo el material con solucin directa entre porta - cubreobjetos, diluyendo el material con solucin fisiolgica, a la que previamente se le agreg unas gotas de lactofenol o KOH al 10% . Se puede practicar una coloracin negativa con tinta china. Debe examinarse el material en busca de "grnulos de azufre grandes clulas en gemacin con capsulas, grandes clulas con endosporas. Cuando se trata de materiales crneos, como escamas de piel, trocitos de uas, pelos, es necesario proceder a aclarar el material con KOH al 40%, lo que tiene mucha importancia, pues si no se procede a efectuar las observaciones en estas condiciones, no se podr distinguir la trama miceliana en el interior de los tejidos. 1.2.2 Coloraciones diferenciales. Son de gran utilidad en micologa, principalmente cuando se trata de colorear elementos: formas ramificadas o pseudomicelios, clulas ovales o en gemacin, artrosporas, etc. Se realizan tcnicas de coloracin de Gram, Ziehl Neelsen y Giemsa (ver detalles en un Manual de Prcticas de Bacteriologa). 1.3. CULTIVOS Todos los materiales procedentes de casos sospechosos de infecciones micticas deben cultivarse en medios para hongos patgenos sin importar si existe o no clulas fngicas por examen directo. Se aconseja sembrar como mtodo sistemtico en estras en placas de agar sangre al 5% e inocular con los materiales sospechosos una superficie inclinada de agar glucosado de sabouraud con antibiticos o agar micobiotic en tubos de ensayo, incubando las placas de agar sangre a 37oC y el agar inclinado de sabouraud a temperatura ambiente. El pus, liquido cfalo raqudeo, esputo, liquido de lavado gstrico y materiales procedentes de lceras debe examinarse y cultivarse de inmediato ya que algunos hongos patgenos como H. capsulatum, rara vez pueden cultivarse a partir de muestras viejas. 1.4. INOCULACIONES Posee valor la inoculacin animal para establecer la patogenicidad de hongos como Candida albicans o Criptococcus neoformans, as como para observar la fase de tejido de una variedad de hongos como Blasfomyces dermatidis, Histoplasma capsulatum, etc. Los conejos y ratones inyectados por va intravenosa con una suspensin salina de Candida albicans, morirn con lesiones renales tpicas. Los ratones inyectados por va intraperitoneal o intracerebral con una suspensin salina C. neoformans morirn de enfermedad generalizada. Los ratones inyectados por va intraperitoneal o intravenosa con una suspensin salina de B. dermatidis (fase de levadura) morirn de enfermedad diseminada. En los cobayos inoculados intraperitonealmente con una suspensin salina de N. asteroides se comprobarn lesiones caseosas en el abdomen. Los ratones o ratas inoculadas con una suspensin salina de S. schenckii mostrarn a la muerte la fase tpica de tejido del hongo en muchos rganos. En los ratones inoculados por va intraperitoneal, intracerebral o intravenosa: con una suspensin salina de H. capsulatum (fase de lavadura) se descubrirn organismos intracelulares en el bazo, hgado y otros rganos.
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El huevo de gallina embrionado (saco vitelino) es til para el aislamiento primario de hongos patgenos y para el cultivo de las fases de tejido. 1.5. ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO El estudio histolgico de los tejidos revela reacciones caso en los animales inoculados. La mayor parte de los hongos pueden ponerse en evidencia mediante la tcnica usual de hematoxilina - eosina, debiendo examinar siempre en primer lugar los cortes as teidos, antes de aplicar colorantes especiales. La hematoxilina tie los ncleos de las clulas tisulares, y el observador puede valorar la reaccin inflamatoria celular mejor que cuando recurre a colorantes especial. Los colorantes especiales ms tiles son el Gram, metenamina argntica con cido crmico de Gomori - Grocott (GMS), el cido peridico de Schiff (PAS) y el mucicarmn de Mayer (ver detalles en coloraciones especiales pana hongos patgenos de Conant). El colorante de Gram es sobre todo til para demostrar la presencia de Nocardia en el pus y de Actinomyces en grnulos, y excelente para mostrar Histoplasma capsulatum en lesiones recientes no calcificadas. Los hongos son grampositivos. La tcnica de Gomori de la metenamina argntica y crmica, es til para identificar hongos en los tejidos. Es indispensable para poner de relieve las delicadas paredes de hongos productores de ficomicosis, como por ejemplo Rhizopus. Tie los filamentos ramificados de Actinomyces en los grnulos de actinomicosis. El cido peridico de Schiff, tie perfectamente los hongos verdaderos, y as vemos que pone bien de manifiesto a Criptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Candi da albicans y los dermatofitos. El colorante de Gridley, tiene la ventaja de teir por igual las esporas y las hifas en los tejidos y combina el PAS y el colorante de Gomori de aldehdo fucsina. El mucicarmn de Mayer, es til par Criptococcus. 1.6. INMUNOFLUORESCENCIA Puede utilizarse naranja de acridina como colorante fluorescente para poner de manifiesto hongos en cortes de tejidos, frotis y preparaciones frescas. El microscopio compuesto ordinario equipado con filtros para fluorescencia sirve para este propsito. El naranja de acridina y el KOH al20 % pueden combinarse y emplearse como mtodo fluorescente simple para la identificacin de hongos dermatofitos en piel y pelos. Se recurre a las pruebas inmunofluorescentes (directa e indirecta) para descubrir antgenos o anticuerpos de hongos en pacientes con micosis. 2. MTODOS INDIRECTOS 2. I. INTRADERMOREACCIONES Algunos hongos producen estados alrgicos en los individuos infectados, estados que se manifiestan por la aparicin de zonas eritematosas y edematosas cuando se les inyecta los filtrados de la especie correspondiente (tricofitina, coccidiadina,esporotriquina, histoplasmina, blastomicina etc. Aunque estas pruebas se consideran especificas, no son muy empleadas en el laboratorio, sino ms bien en encuestas epidemiolgicas.
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2.2. REACCIONES INMUNOLGICAS 2.2.1. Prueba de aglutinacin. Esta prueba para anticuerpos es la ms fcil de ejecutar, siempre que puedan prepararse suspensiones uniformes de antgenos a partir de cultivos de hongos. Estas suspensiones pueden prepararse desde cultivos de 24 a 48 horas de Candida albcans y C. neoformans sobre agar glucosado de sabouraud a 37oC y de un cultivo en fase de levadura de72 horas de S. schencKii, e Histoplasma capsulatum sobre agar glucosa sangre con BHI a 37oC. Deben emplearse en la prueba de aglutinacin suspensiones salinas de clulas destruidas por el calor, 1:1000 por volumen determinado por centrifugacin en tubos de Hopkin. La tcnica de la prueba es idntica a la usada en bacteriologa. El primer tubo contiene 0.5 ml del suero del paciente diluido al 1:10, y en los tubos restantes se colocan diluciones duplicadas en serie de dicho suero. A cada tubo y a otro testigo con solucin salina se aaden o mide la suspensin salina de antgeno. A continuacin se incuban los tubos en bao mara a 37oC durante una hora y se colocan en refrigeracin durante toda la noche para realizar al da siguiente la lectura. 2.2.2. Prueba de precipitacin. Se ha empleado algunos antgenos como coccidioidina en una prueba de precipitacin para coccidioidomicosis. En la prueba convencional de precipitacin para esporotricosis se han utilizado como antgenos extractos de carbohidratos procedentes de cultivos de Sporothrix schenckii y del medio de cultivo en que ha desarrollado el hongo. Tambin, se han usado extractos solubles de diversos hongos en la prueba de precipitina en gel de agar. 2.2.3 Prueba de fijacin de complemento. Esta prueba para anticuerpos se emplea antgeno fngico y todos los reactivos como complemento, amboceptor y suspensiones de glbulos rojos similar a la tcnica de Wassermann. Se han utilizado suspensiones de clulas enteras y trituradas en fase de levadura de B.dermatitidis. P. brasiliensis y H. capsulatum como antgenos para descubrir anticuerpos fijadores de complemento en los sueros de pacientes con blastomicosis par a coccidioidomicosis e histoplasmosis respectivamente. Se usan tambin en esta prueba filtrados de coccidiodina, histoplasmina y blastomicina de cultivos filamentosos. Sin embargo todos estos antgenos deben ser estandarizados; exactamente y determinar al mismo tiempo la dilucin ptima con sueros positivos y negativos. 2.3. INMUNOFLUORESCENCIA Se han recurrido asimismo a las pruebas de inmunofluorescencia para descubrir antgenos o anticuerpos de hongos en pacientes con infecciones micticas. COLORACIONES ESPECIALES PARA HONGOS PATGENOS. Las coloraciones especiales ms tiles son el Gram, metenamina argntica de Gomori, el cido peridico de Schiff y el mucicarmn de Mayer, otros coloraciones que bien vale la pena citar son el naranja de acridina, picroindigocarmn de Baker-Smith, el, de Gridley y el de cido resistencia.

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COLORACION DE GRAM. Es til para demostrar la presencia de Nocardia en el pus y de Actinomyces en grnulos, y excelente para mostrar Histoplasma capsulatum en lesiones recientes no calcificadas. l. Soluciones: Colorante de Goodpasture Fucsina bsica 0.59 g Anilina 1.0 ml Cristales de fenol 1.0 g Alcohol,30% 100.0 ml Colorante de Stirling Cristal violeta 5.0 g Alcohol absoluto 10.0 ml Anilina 2.0 ml Agua destilada 88.0 ml Solucin yodo yodurada Yodo 1.0 g Yoduro de potasio 2.0 g Agua destilada 300.0 ml LL. TCNICA: 1. Se tien los cortes durante los 10 a 30 minutos con colorante de Goodpasture. 2. Lavar en agua. 3. Diferenciar con formaldehdo durante algunos segundos, hasta que el color rojo brillante cambie a rosa claro. 4. Lavaren agua. 5. Contracoloracin en cido en una solucin acuosa de cido pcrico saturada (1-22 por 100) tres cinco minutos o menos, hasta que el corte tome color amarillo prpura. 6. Lavar enagua. 7. Diferenciar en alcohol de 95, lo que produce reaparicin del color rojo, que luego desaparece en parte con algo del color amarillo. 8. Lavaren agua. 9. Teir durante cinco minutos con solucin de cristalvioleta de Stirling. 10. Lavaren agua. 11. Sumergir en solucin yodo yodurada de Gram durante un minuto. 12. Secar, sin lavar en agua. 13. Tratar con partes iguales de anilina y xilol hasta que, no se desprenda ms color. 14. Enjuagar con dos cambios de xilol y montar en blsamo. RESULTADOS.- Los organismos gran positivos se tien de azul, y los grandes negativos de rojo; todos los dems elementos tisulares varan en cuanto al matiz de rojo a prpura. COLORACION DE GOMORI. Es un mtodo til para identificar hongos: en los tejidos, es indispensable para poner en relieve las delicadas paredes de los organismos productores
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de ficomicosis, como por ejemplo, Rhizopus. Tie los filamentos ramificados de Actinomyces en los grnulos de actinomicosis. El mtodo es como sigue: I. SOLUCIONES: 1. Solucin acuosa de cido crmico al 5 por ciento (trixido de cromo, CrO3) 2. Solucin de nitrato de plata -metenamina: aadir 5 ml de nitrato de plata al 5% 100 ml de metenamina al 3 %, el Farmacopea USA (CH2)6 N4 Se forma un precipitado blanco que se disuelve de inmediato al agitar. La solucin clara permanece estable durante meses a temperatura de refrigeracin. 3. Solucin acuosa de metabisulfito sdico al 1% (Na2S2O5) 4. Solucin acuosa de brax al 5 %, de la Farmacopea USA -(Na2B4O7.10 H2O), 5. Solucin acuosa de cloruro de oro a un dcimo por 100 (AuC12HCI 3 H2O). Puede usarse reiteradamente. 6. Solucin acuosa de tiosulfato de sodio al2 % Na2SO3 5 H2O II. TECNICA: 1. Desparafinizar cortes y llevar a agua destilada. Tratar los portaobjetos con colodin y colocar en alcohol de 95o. 2. Los cortes hidratados y los frotis se oxidan con cido crmico al 5 por ciento durante 1 hora, se lavan despus en agua corriente 10 minutos, para tratarse con bisulfito sdico 1 minuto con el objeto de eliminar todo residuo de cido crmico. A continuacin se lavan de nuevo en agua corriente durante 5 minutos y finalmente en agua destilada 3 veces seguidas. 3. Blanquear a 45 a 50oC en una solucin preparada por adicin de 25 ml de nitrato de plata-metenamina a una porcin igual de agua destilada que contenga 1 a 2 ml de brax al 5 %. Los hongos y la mucina comenzaran a teirse al cabo de 25 a 30 minutos debiendo observarse en este momento al microscopio. Cuando la tincin es ptima los portaobjetos se lavan en agua destilada 2 o 3 veces 4. Tratar con cloruro de oro al 0.1 por 100 durante 5 minutos lo cual blanquear tambin el fondo. Enjuagar en agua destilada. 5. Eliminar la plata no reducida por tratamiento con tiosulfato sdico al 2 % durante 1 a 2 minutos, y, despus lavar cuidadosamente, y contracolorear si se considera necesario, con safranina si se desea teir de rojo los ncleos, o con una combinacin de hematoxilina-eosina cuando interesa poner de manifiesto los detalles en los tejidos. Tambin es buena la contracoloracin con verde cido 5 del Cl, o azul claro al 0.2 %. 6. Deshidratar, aclarar y montar. NOTA: Toda el agua debe ser destilada. RESULTADOS: Los resultados son netamente delineados en negro con las partes interiores de los micelios e hijas teidas de color rosado como consecuencia del matiz que presta el oro. La mucina tambin toma color rojo rosado debida a dicha matizacin. COLORACION DE SCHIFF (PAS Y PASH) El cido peridico de Schiff tie perfectamente los hongos verdaderos, y as vemos que pone bien de manifiesto a Criptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum.
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Blastomyces dermatitidis; Candida albicans y los dermatofitos. Es aplicable tambin a raspaduras de piel o uas, y proporciona magnficas preparaciones, pero requiere ms tiempo para su consumacin que el mtodo del hidrxido de potasio Fijacin: Formaldehdo al 10% o solucin de formol-Zenker. TECNICA: Cortes en parafina a 6 micras. Reactivo de Schiff: Pesar 1g de fucsina y 1.9 g de metabisulfito sdico (Na2S2O5). Disolver en 100 ml de cido O clorhdrico 0.15 N. Pan2 g de fucsina, usar 0.25 N HCI y duplicar el Na2S2O5 . Agitar la solucin a intervalos o con un agitador mecnico durante 2 horas. La solucin se halla ahora clara y de color amarillo o pardo. Aadir 500 mg de carbn activado fresco; agitar 1 o 2 minutos. Filtrar en un cilindro graduado, lavar el residuo con agua destilada y restablecer el volumen original de 100 ml. Solucin cido peridico al 1.0 % Cristales de cido peridico 1.0 g Agua destilada 100.0 ml Solucin normal de cido clorhdrico: Acido clorhdrico concentrado 1 .19 g 83.5 ml Agua destilada 916.5 ml Contra coloracin con verde claro cido 5 al 0.2 %: Cristales de verde claro cido 5 0.2 g Agua destilada 100.0 ml Acido actico glacial 0.2 ml Solucin de verde claro cido 5: Verde claro cido 5 solucin madre 10.0ml Agua destilada 50.0 ml Alambre hematoxilina: Diastasa 0.1 g Agua destilada estril 100. ml Almacenar en refrigerador Utilizable durante 1 semana Mtodo de coloracin 1. Xilol 2. Alcohol absoluto 3. Alcohol de 95 % 4. Si se fija con solucin de Zenker, eliminar el mercurio precipitado en iodo, lavar en agua y decorar en hipo solucin 5. Lavar en agua destilada 6. Solucin cido peridico durante 5 minutos 7. Lavar con tres cambios de agua destilada. 8. Colocar en reactivo de Schiff durante 15 minutos.
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9. Lavar con solucin de metabisulfito al 0.5 %, tres cambios de 2' c/u. conservar bajo agua corriente durante 10 minutos. 10. Contra coloracin ligera con alumbre hematoxilina para teir los ncleos de azul, con verde claro cido diluido para el citoplasma, o ambos. Omitir los pasos 11 a 15 si se usa verde claro cido. 11. Enjuagar en agua corriente 12. Diferenciar en alcohol cido. 13. Lavar con agua corriente. 14. Sumergir en agua amoniacal para cortes azules. 15. Lavar con agua corriente durante 10 minutos 16. Alcohol de 95 por ciento. I 7. Alcohol absoluto; dos cambios. 18. Xilol; dos cambios. 19. Montaren Permount. RESULTADOS: Pueden mostrar reaccin positivo y tomar color rosado a rojo purpreo, el glucgeno, almidn, mucinas, cartlago, reticulina, fibrina de trombos, gotitas de coloide, depsitos hialinos en arteriosclerosis, y glomrulos, membranas basales, coloides de tallos - hipofisiarios y tiroides, infiltracin amiloide, y otros elementos. Los ncleos se tien de azul (con hematoxilina). Los hongos se tien de rojo. El fondo torna color verde plido, con contracoloracin a base de color verde claro. Si desea reaccin de PAS con digestin, colocar los cortes en diastasa al 0.1% durante 20' si falla la diastasa, puede utilizarse saliva filtrada. Probar la diastasa con material quo contenga glucgeno, p.e. hgado para asegurase de que todava es activa. COLORACION DE GRIDLEY El colorante de Gridley tie por igual las esporas y las hifas en los tejidos y combina el PAS y el colorante de Gomori de aldehdo fucsina en la forma siguiente: 1. Hacer cortes de 6 micras de un tejido incluido en parafina, bien fijado, y colocar en portaobjetos con albmina de huevo de Mayer secar. 2. Desparafinar con agua destilada. 3. Oxidar con cido crmico al 4 % durante 1 hora. 4. Lavar con agua corriente 5 minutos. 5. Colocar en reactivo de Schiff durante 15 minutos. 6. Enjuagar con tres cambios de cido sulfuroso, 2 minutos cada vez. Metabisulfito sdico 6.0 ml cido clorhdrico normal 5.0 ml Agua destilada 100.0 ml 7. Lavar durante 15 minutos con agua corriente. 8. Colocar los portaobjetos en una solucin de aldehdo fucsina durante 15 a 20 minutos. Fucsina bsica 1.0 g Alcohol etlico 200.0 ml Paraaldehido 2.0 ml Acido clorhdrico 2.0 ml
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Dejar en reposo a temperaturas ambiente durante 3 das hasta que la solucin tome color azul intenso. Conservar en refrigerador. 9. Lavar el exceso de colorante con alcohol de 95. 10. Lavar bien en agua. 11. Contracoloracin con solucin de amarillo de metanilo durante 2 a 5 minutos. Amarillo de metilo 0,25 g Acido actico glacial 0.25 ml Agua destilada 100ml 12. Lavar con agua 13-.Deshidratar, aclarar y montar en Permount RESULTADOS: Las hifas se tien de azul intenso; los conidios de rosa a prpura; el fondo da amarillo, El tejido elstico y la mucina se tien tamb de azul obscuro. Los elementos del hongo teidos por el mtodo arriba bosquejado aparecen de color purpreo azulado obscuro y se ven fcilmente contra el fondo amarillo claro. COIORACION ACIDORRESISTENTE DE NOCARDIA Nocardia no es acidorresistente ante el colorante normal de carbol fucsina empleado para la identificacin de bacilos tuberculosos. La tcnica acidorresistente de Fite-Faraco. pone de manifiesto ciertas cepas de Nocardia en forma de estructuras rojas, delgadas, y largas sobre fondo azul plido. El mtodo es como sigue: SOLUCIONES: Solucin de Xilol-aceite de cacahuete: Aceite de cacahuete 1 parte Xilol 2Partes Solucin acuosa de cido sulfrico al 1%: Acido sulfrico 1.0 ml Agua corriente 99.0 ml Solucin de fucsina fenicada (Ziehl-Neelsen): Cristales de fenol fundido 2,5ml Alcohol absoluto 5.0 ml Fucsina bsica 0.5 g Agua destilada c.s.c. 50.0 ml Solucin de azul de metileno: Azul de metileno 0.5 g Acido actico glacial 0.5 ml Agua corriente 100.0 ml Mtodo de coloracin: 1. Desparifinizar los cortes con una mezcla de xilol y aceite de cacahuete; 2 cambios de 12 minutos c/u. 2. Drenar, eliminar el exceso de aceite y secar. El aceite residual ayuda a impedir la retraccin y dao de los cortes.
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3. Teir con fucsina fenicada tan solo 10 minutos y no ms. Este detalle posee importancia decisiva. 4. Lavar en agua corriente durante 1 a 2 minutos. 5. Diferenciacin en solucin. acuosa de cido sulfrico al 1 % durante 5 a 10'. Comprobar la diferenciacin al microscopio. Agitar para mover el fondo tan rpidamente como sea posible, 6. ya que esto conserva el enrojecimiento del organismo. El color global ser rosado purpreo. 7. Lavar con agua corriente. 8. Contracoloracin con solucin de azul de metileno. 9. Enjuagar el exceso de azul de metileno con alcohol isoproplico 99% 10. Montar directamente en Permount. RESULTADOS: Nocardia se tie de rojo; el fondo de azul claro.

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PRCTICA N08 AGENTES DE MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS


INTRODUCCIN. La micosis superficiales se limitan a las capas ms externas de la piel y el pelo (capa crnea), las micosis cutneas afectan capas ms profundas de la epidermis y sus anejos, los pelos y las uas; y las micosis subcutneas implican la dermis, los tejidos subcutneos, el msculo y la fascia. El hongo puede limitarse a la piel, pelo o uas con escasa respuesta inflamatoria y provocando un problema fundamentalmente esttico o bien puede en otras ocasiones ocasionar una respuesta inflamatoria, aguda o crnica, ms o menos importante. Adems a veces se producen reacciones alrgicas a los hongos provocando una lesin a distancia del lugar inicial de la infeccin. Las manifestaciones clnicas pueden ser caractersticas y fcilmente reconocibles por el mdico o ser difciles de distinguir de otras enfermedades dermatolgicas para cuyo diagnstico es necesario hacer un examen de laboratorio. CLASIFICACIN Dentro de estas micosis tenemos las que afectan epidermis y las que afectan pelos: 1. Afecciones a la piel Levaduras lipoflicas (Pityrosporum ovale, orbiculare) Pitiriasis versicolor (Malassezia spp) Foliculitis (Pityrosporum spp) Dermatitis seborreica Papilomatosis recurrente confluente (Sndrome de Gougerot-Carteaud) Psoriasis Tinea nigra (Exophiala werneckii) 2. Afeccin al pelo Piedra negra (Piedraia hortai) Piedra blanca (Trichosporon beigelii) I. OBJETIVOS 1. Iniciar al estudiante en el conocimiento de las infecciones micticas de la piel y anexos. 2. Familiarizarlo con los principales agentes etiolgicos. 3. Adiestrarlo en el diagnstico de laboratorio. II. MATERIALES: Muestras clnicas: pelos, uas, escamas de piel, plantas de pies. Tubos con agar micobiotic y agar glucosado de sabouraud. Colorantes y reactivos: KOH 10%, lactofenol y azul de tripn.
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Tubos con cultivos de: Microsporum canis Trichophyton rubrum Microsporum gypseum

Trichophyton mentagrophytes Epidermophyton flocossum Candida alb'rcans

Lminas con preparados permanentes de: Trichosporum beigelli - Microsporum gypseum Microsporum canis - Epidemophyton flocossum Trichophyton mentagrophytes - Clamidosponas de C. albican Lminas porta y cubreobjetos. Asa de kolle, estilete, bistur, pinzas, tijeras estriles.

III. PROCEDIMIENTO: 1. Observar en fresco con KOH al 10 %las muestras de pelos, uas, escamas de piel, plantas de pies; y anotar la presencia de hifas y/o conidios. 2. Realizar la siembra de las muestnas proporcionadas en los tubos con agar micobiotic y agar sabouraud. 3. Hacer el estudio macroscpico de los cultivos presentados y observar las caractersticas microscpicas de los mismos. Hacer un esquema. 4. Observar las lminas con preparados permanentes y distinguir las estructuras caractersticas de cada uno de los gneros y especies estudiados IV. RESULTADOS Hacer un cuadro comparativo de los hongos observados: GNERO/ESPECIE HONGO CARACTERES MACROSCPICAS CARACTERES MICROSCPICAS

V. CUESTONARIO 1. Qu estructura permite dar el diagnstico de especie en el gnero Microsporum? 2. Qu estructuras microscpicas observa Usted, en un caso de candidiasis? Qu coloracin utilizara? 3. Qu mtodo de eleccin se emplea en la pitiriasis versicolor y que estructuras dan el diagnstico?

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PRCTICA N 0 9

AGENTES DE MICOSIS SUBCUTNEA

INTRODUCCIN Las micosis subcutneas son aquellas causadas por hongos saprfitos del suelo cuyas estructuras penetran en el husped por implantacin traumtica cuyos esporos o fragmentos penetran en el husped por implantacin traumtica en la piel, dando lugar a lesiones que asientan en piel y tejido celular subcutneo. La condicin de poseer una temperatura inferior a la de los tejidos profundos, hace de ste un lugar ideal para el desarrollo de varias especies de hongos. Estos originan lesiones crnicas que evolucionan por meses o aos, y estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, principalmente en el suelo, vegetales en descomposicin, madera, etc., en regiones tropicales y subtropicales. El diagnstico comprende en el estudio micolgico, que incluye: toma de muestra de abscesos y biopsia de lesiones, transporte en frasco con formol al 10% para estudio histopatolgico y otro con penicilina para observacin y cultivo (el pus va en frasco con penicilina), la observacin directa del material de biopsia con hematoxilina eosina y del pus con KOH al 20%, con 400 aumento. El cultivo se realiza en medios comunes (Sabouraud, Czapek, agar miel), con agregado de antibiticos a 28-37 C, por 3 a 4 semanas y se identifican las colonias aisladas por sus caractersticas macro y microscpicas. La serologa no es de uso frecuente en estos casos pero se han demostrado anticuerpos circulantes en varias oportunidades, que pueden ser detectados por reacciones de fijacin de complemento, inmunodifusin en gel e inmunofluorescencia indirecta, mientras que las intradermorreacciones tienen valor epidemiolgico y pronstico en ciertos casos. I. OBJETIVOS: Ampliar los sealados en la prctica anterior, enfatizando en los aspectos de diagnstico etiolgico y en su importancia en el conocimiento de la patologa regional. II. MATERALES: Lminas con preparados permanentes de examen directo en casos de: Esporotricosis (esporas en cavidad abdominal de ratn) Cromomicosis (corte histolgico) Tubos con cultivos de: Sporothix schenckii Phialophora verrucosa Fonsecaea pedrosoi Lminas con preparados permanentes de cultivos de:
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Sporothix schenckii Phialophora verrucosa Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compactium Microscopio Colorantes y reactivos Lactofenol con azul de tripn. Lminas porta y cubreobjetos. Asa de kolle y estiletes.

III. PROCEDIMIENTO 1. Observar los preparados permanentes en examen directo de esporotricosis y cromomicosis. Anotar sus caractersticas. Esquemas. 2. Observar el aspecto macroscpico de los cultivos presentados. 3. Estudiar microscpicamente los preparados permanentes. Observar caractersticas y hacer esquemas. IV. RESULTADOS: Hacer un cuadro resumen comparativo de las especies observadas

las

ESPECIE

CARACTERES MACROSCPICAS

CARACTERES MICROSCPICAS

V. CUESTIONARIO 1. Cul es el procedimiento de trabajo ms til pana el diagnstico de esporotricosis? 2. Cules la importancia del estudio anatomopatolgico de la cromomicosis? 3. Es posible identificar especies por el aspecto de los cuerpos pardos obscuros?

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PRACTICA N 10 AGENTES DE MICOSIS PROFUNDAS


I. OBJETIVOS 1. Dar a conocer a los estudiantes, dos de los principales agentes de micosis infeccin y micosis - enfermedad. 2. Hacer conocer las estructuras de los hongos agentes de micosis profundas. 3. Dar entrenamiento bsico, en la diferenciacin por el laboratorio entre los principales agentes etiolgicos de micosis profundas. II. MATERIALES Lminas con preparados permanentes de Parcoccidioides brasiliensis (pus procedente de inoculacin experimental). Laminas con preparados permanentes coloreadas de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis Tubos con cultivos de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis. III. PROCEDIMIENTO 1. Hacer el estudio macroscpico de los cultivos presentados. Hacer esquemas. 2. Hacer el estudio microscpico de los preparados permanentes. Hacer esquemas. IV. RESULTADOS: Hacer un esquema comparativo de H. capsulatum y P. brasiliensis: Especie Examen macroscpico Examen microscpico Temp. Amb. 37oC Temp. Amb. 37oC H.capsulatum P.brasiliensis 1. Aparte de la observacin en prctica. Qu otro procedimiento de diagnstico conoce? 2. Cul es el significado del hallazgo en un examen directo de la estructura caracterstica de P. brasiliensis? 3. Para el diagnstico de Histoplasma capsulatum recomendara la inoculacin en ratones? Por qu? 4. Qu estructuras caractersticas permiten el diagnstico de Hstoplasmosis y Paracoccidioidomicosis? 5. Qu tipo de respuesta inmunitaria producen los hongos estudiados?

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PRCTICA N 11
AGENTES DE MICOSIS OPORTUNISTAS INTRODUCCIN Las micosis oportunistas son afecciones producidas por hongos que se comportan como saprfitos o comensales del hombre, formando parte de su flora normal de piel, mucosas, tracto digestivo o respiratorio, o bien, por aquellos que integran la mictica ambiental (suelo, agua, aire). Estos hongos ante determinadas oportunidades que les ofrece el hospedador, al disminuir su capacidad defensiva, pueden colonizar, infectar y producir enfermedad. En ocasiones y segn el estado inmunitario pueden invadir tejidos y producir alteraciones que pueden llevar a la muerte. Dentro de las micosis oportunistas se encuadran:
Candidiasis Las de mayor Aspergillosis Hialohifomicosis frecuencia Zigomicosis Infecciones por otros hongos levaduriformes

I. OBJETIVOS: 1. Hacer que los estudiantes conozcan los aspectos fundamentales de la morfologa y patologa de algunos hongos patgenos oportunistas. 2. Hacer conocer las estructuras de los hongos agentes de micosis oportunistas. II. MATERIALES: Tubos con cultivos: - Candida albicans, - Criptocrccus neoformans - Geotrichum candidum. Tubos con cultivos de Aspergillus fumigatum Tubos con preparados permanentes : Candida albicans, Criptococcus neoformans Geotrichum candidum. Laminas con preparados permanentes : - Asperqillus fumigafum - ficomceto tejido.

III. PROCEDIMIENTO: 3. Observacin macroscpica de los cultivos presentados. Hacer esquemas.


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4. Hacer la observacin microscpica de los preparados permanentes de Candida albicans, Criptocrcus neoformans Geotrrchum candidum y Aspergillus fumigatum. 5. Observacin microscpica de cultivo de Candida albicans en preparaciones con lactofenol y azul de tripn 6. Observacin microscpica de cultivo de Criptococus neoformans, en preparados con tinta china. Hacer esquemas. 7. Observacin microscpica de cultivo de Geotrichum candidum en preparados con lactofenol y azul de tripn y tinta china. 8. Observacin microscpica de cultivo de Aspergillus fumigatum en peparados de lactofenol y azul de tripn. IV. RESULTADOS: Hacer un cuadro resumen comparativo de los hongos presentados: ' ESPECIE CARACTERES MACROSCPICAS CARACTERES MICROSCPICAS

V. CUESTIONARIO: 1- Es suficiente el estudio macroscpico para el diagnstico de criptococcosis? 2. Qu estructuras fngicas hacen el diagnstico de Cndida albicans? 3. Es suficiente el aislamiento espordico de un hongo para asignarle rol patgeno? por qu?

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PRCTTCA N12 AGENTES DE ACTINOMICOSIS


INTRODUCCIN La actinomicosis es una enfermedad causada por una bacteria anaerobia, llamada Actinomyces israelii, la cual es un organismo comn, que normalmente no causa enfermedad (no patgeno) y que se encuentra en la nariz y en la garganta. Dada la localizacin normal de la bacteria en la nariz y en la garganta, la actinomicosis aparece ms comnmente en la cara y el cuello. La infeccin no es contagiosa. Los sntomas ocurren cuando la bacteria entra en los tejidos faciales debido a traumatismo, ciruga o infeccin. Una causa comn es el absceso dental o la ciruga oral. Una vez que se ha localizado en el tejido, forma un absceso, produciendo un abultamiento de color rojo intenso a rojo prpura, a menudo en la mandbula, de donde proviene su nombre comn de "mandbula abultada". Afeccin crnica, localizada con mayor frecuencia en la mandbula, el trax y el abdomen; puede ocurrir una propagacin septicmica con afeccin generalizada. El diagnostico se confirma con la demostracin de ramificaciones de hifas grampositivas de 0,5-1,0 micrn de dimetro en un grnulo. Los resultados clnicos y de los cultivos permiten distinguir entre la actinomicosis y la actinomicetona.

I. OBJETIVOS: 1. Hacer que los estudiantes conozcan los aspectos fundamentales de la morfologa y fisiologa de algunos actinomicetos patgenos para el hombre. 2. Que los estudiantes conozcan las principales diferencias entre los gneros Actinomyces y Nocardia
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II. MATERIALES: - Tubos con cultivos de Nocardia asteroides. - Lminas con preparados permanentes de cortes histolgicos de grnulo actinomicsico. - Lminas con preparados permanentes de Nocardia (lesiones). - Juego de coloracin de Ziehl- Neelsen. III. PROCEDIMIENTO: 1. Observacin microscpica de los cultivos presentados. Hacer esquemas. 2. Hacer la observacin microscpica de los preparados permanentes. 3. Coloracin por procedimiento de Ziehl-Neelsen del cultivo de Nocardia asteroides. Hacer esquemas. 4. Observacin de las lminas coloreadas. IV. RESULTADOS: Hacer un cuadro resumen comparativo de los hongos presentados:

ESPECIE

CARACTERES MACROSCPICAS

CARACTERES MICROSCPICAS

V. CUESTIONARIO: 1. Caractersticas microscpica del grnulo actinomicsico. Diferencia con el maduromicsico. 2. Qu diferencias tintoriales y culturales puede sealar entre el gnero Actinomyces y Nocardia? 3. Por qu estos agentes son considerados dentro del estudio de los micetos?

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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HONGOS CONTAMINANTES Y OPORTUNISTA

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TIPO DE HIFAS

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Macroconidia de Microsporum canis

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