FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE CIENCIAS QUMICAS

ESCUELA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUMICA PRCTICA N: 06

DATOS GENERALES

ALUMNOS:

ALEJANDRA BANEGAS MARIA JOSE PAREDES PAOLA ARCOS ALEXIS PUMAGUALLI

1.- TEMA: CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE DOS ENZIMAS (CATALASA Y AMILASA) 2.- OBJETIVOS: 2.1.- Objetivo General: Caracterizar cualitativamente dos enzimas 2.2.- Objetivos Especficos: Determinar la presencia de la enzima catalasa en una muestra de hgado animal. Comprobar la visualizacin de la desnaturalizacin de una enzima mediante la accin de la temperatura. Comprobar la accin hidroltica de la amilasa. 3.- MARCO TERICO RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula txica que es el perxido de hidrgeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxgeno, por lo que se soluciona el problema. (1) La reaccin de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente: 2 H2O2 2 H2O + O2

Esta funcin la efecta esta enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno. Adems la catalasa se usa en la industria textil para la eliminacin del perxido de hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de hidrgeno.(2) El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun as la reaccin qumica se produce en dos etapas (1) H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)-E H2O2 + O=Fe(IV)-E H2O + Fe(III)-E + O2 Donde Fe-E representa el ncleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actan como cofactores. (1) La enzima se presenta en forma de homotetrmero y se localiza en los peroxisomas. (1)

Esta enzima puede actuar como una per oxidasa para muchas sustancias orgnicas, especialmente para el etanol que acta como donante de hidrgeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y per oxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas. (1) La deficiencia en catalasa produce acatalasia. Esta enfermedad est caracterizada por la ausencia de actividad de la catalasa en los glbulos rojos y se asocia con las lesiones orales ulcerantes. (1) Reaccin A La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patgenas son anaerobias (no pueden vivir con oxgeno), mueren con el desprendimiento de oxgeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada. DESNATURALIZACION Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de protenas, que es la desnaturalizacin. Ya que la catalasa qumicamente es una protena, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. (3) AMILASA La amilasa, denominada tambin sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilosa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia). Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de "diastasa".(4)

Clasificacin -Amilasa (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa) Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos,

descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2. -Amilasa (Nombres alternativos: 1,4--D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarognica) Otra forma de amilasa, la -amilasa es tambin sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Acta desde el extremo no reductor de la cadena, catalizando la hidrlisis del segundo enlace -1,4, rompiendo dos unidades de glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduracin de la fruta la -amilasa rompe el almidn en azcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la produccin de malta. Muchos microorganismos tambin producen amilasa para degradar el almidn extracelular. Los tejidos animales no contienen -amilasa, aunque puede estar presente en microorganismos saprfitos del tracto gastrointestinal. Tiene un pH ptimo de 12. (4) -Amilasa (Nombres alternativos: Glucano 1,4--glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4--glucosidasa; glucoamilasa; -glucosidasa lisosmica; 1,4--D-glucano glucohidrolasa) Adems de romper el ltimo enlace (1-4) glicosdico en el extremo no reductor de la cadena de amilosa y amilopectina, liberando glucosa, la -amilasa puede romper los enlaces glicosdicos (1-6). A diferencia de las otras amilasas esta forma es ms eficaz en medios cidos y su pH ptimo es de 3. (4) Usos Sirve en el diagnstico de enfermedades determinando sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un dao a las clulas productoras de la enzima en el pncreas, o bien, por una deficiencia renal (excrecin reducida) o tambin por paperas. (4) Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin (especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos. (4) Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. En la maduracin de frutas la amilasa es sintetizada en la maduracin, degradando el almidn de las frutas en azcar, y volvindolas ms dulces. (4)

4.- MATERIALES Y REACTIVOS Materiales Gradilla Reactivos

Trozos de hgado de pollo 5 Tubos de Ensayo Agua oxigenada Vaso de Precipitacin de Sol. Diluida de almidn 25 ml Reverbero Reactivo de Benedict Termmetro Reactivo de Lugol. Pipeta de 10ml Pera de succin 5.- GRFICOS RECOCIMIENTO DE LA CATALAZA HIDRLISIS DEL ALMIDON

DESNATURALIZACION

PRUEBAS CON FEHLING

REACCION DEL ALMIDON CON EL LUGOL

6.- PROCEDIMIENTO: A. RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA

Se coloca en un tubo de ensayo unos trocitos de hgado Se aade 5 ml de agua oxigenada. Se observa un intenso burbujeo debido al desprendimiento de Oxigeno.

B. DESNATURALIZACION

Se coloca en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado

Se aade agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos

Despus de este tiempo, se retira el agua sobrante

Se aade el agua oxigenada

HIDRLISIS DEL ALMIDON

Se toman 4 tubos de ensayo, numerados del 1 al 4

Se aade a cada tubo 5ml de una solucin diluida de almidn

A los tubos 3 y 4 se aade una pequea cantidad de saliva.

TUBO 1
Se realiza la Reaccin de Benedict

TUBO 2

Se realiza la Reaccin de Lugol

TUBO 3 Y 4
PONEMOS EN UN VASO DE PRESIPITACION A BAO MARIA

contiene almidon y saliva

CONTROLAMOS LA TEMPERATURA A 37 C dEJAMOS POR UNOS 15 MINUTOS

A continuacin se realiza las siguientes reacciones:

Tubo 3 Reaccin de Benedict.

Tubo 4

Prueba de Lugol

7.- REACCIONES

Hidrlisis de la catalasa

2 H2O2

2 H2O + O2

8.-OBSERVACIONES RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA: Al aadir al hgado agua oxigenada se desprende de el oxigeno e hidrogeno En el hgado exista la presencia de catalasa ya que las burbujas nos indicaron la presencia de oxigeno. La catalasa se encuentra en el hgado

DESNATURALIZACIN: *Ausencia de catalasa (se inactiva la catalasa)

HIDRLISIS DEL ALMIDN *En el tubo 1, la Reaccin de Benedict da negativa por que no existe cambio de colores.

*En el tubo 2, la Reaccin de Lugol da positiva porque su color negro.

*En el tubo 3, la reaccin de Benedict, da positiva y su coloracin cambia de azul a un verde medio amarillo .

En el tubo 4, la prueba de lugol, da negativo, no se produjo cambio de coloracin. Se queda del color del lugol mismo.

Tubos 1, 2, 3, 4,5

9.- CONCLUSIONES Se caracteriz cualitativamente las dos enzimas ocupadas en la prctica realizada y se puede concluir que ambas enzimas son de naturaleza distinta, la amilasa es una hidrolasa, esto quiere decir que descompondr por hidrlisis enlaces 1-4 del componente -Amilasa al digerir el almidn para formar azcares simples, mientras que la catalasa es una enzima de naturaleza oxidorreductasa, que mediante procesos REDOX descompone el perxido de hidrgeno en agua y en oxgeno molecular. Se pude determinar la presencia de la enzima catalasa en una muestra de hgado de gallina, y se lleg a la conclusin de que la catalasa se encuentra en alto contenido en la superficie del tejido liso que conforma este rgano vital para el animal, esta afirmacin se la fundamenta con el intenso y prolongado burbujeo que existi al momento de colocar una pequea cantidad de perxido de hidrgeno en la muestra de hgado.

 Comprobar la accin hidroltica de la amilasa. Se comprob la visualizacin de la desnaturalizacin de una enzima, especficamente de la catalasa en la muestra de hgado, mediante la accin de la temperatura, teniendo en cuenta como conclusin que la temperatura es un factor importante y decisivo al momento en que las enzimas cumplen sus funciones, ya que si la misma no se considera dentro de un proceso metablico dentro del laboratorio, no se pueden obtener los resultados esperados por el mal funcionamiento del enzima. Se comprob la accin hidroltica de la amilasa y se concluye que la misma posee una gran capacidad catalizadora al hidrolizar polisacridos como el almidn y el glucgeno, en monmeros ms sencillos.

10.- CUESTIONARIO: 1. Describa la Catalasa La catalasa EC 1.11.1.6 es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua.(1) El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una funcin protectora contra microorganismos patgenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rpidamente en compuestos menos peligrosos. Esta funcin la efecta esta enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno. Adems la catalasa se usa en la industria textil para la eliminacin del perxido de hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de hidrgeno. La ausencia congnita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta con severas infecciones gangrenosas de la cavidad bucal, pudiendo producir la prdida de los dientes y graves destrucciones de loa maxilares y regiones blandas que los cubre. Enfermedad congnita del Japon (2 de 100.00 habitantes sufren de este trastorno).(1) 2. Describa la amilasa Amilasa salival humana. Un in Calcio es visible en color amarillo.La amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de diastasa. (2)

3. Indique que factores afectan la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima

La temperatura: es importante porque cambia la actividad enzima por dos razones(4) Si se aplica calor: al calentarse las molculas adquieren mayor energa trmica, presenta mayor energa cintica (mayor velocidad), si aumenta la velocidad del sustrato y el enzima, facilita el encuentro de los dos (el calor puede ser en un principio beneficioso ya que aumenta la velocidad y facilita el encuentro), pero si se aplica demasiada calor

puede provocar la desnaturalizacin de la protena (decae la actividad cataltica), desnaturalizacin del enzima. (4) Pero si disminuye la temperatura, disminuye la velocidad, la energa cintica, no se van a encontrar con tanta velocidad, su posterior unin y su posterior formacin. Si se disminuye tanto la temperatura, puede ocurrir la desnaturalizacin de la protena del enzima. (4) Se desnaturaliza antes si se aplica demasiada temperatura que si se disminuye demasiado la temperatura. Todos los enzimas van a tener una temperatura optima, para que la actividad de los enzimas sea perfecta, trabajan mejor que nunca (la de los seres humanos es la de 36.5) (4) El pH: las enzimas tiene que trabajar en unas concentraciones de pH concreta (como protenas que son) si se salen de esas condiciones de pH se pone al enzima en condiciones desfavorables y se puede producir la desnaturalizacin del enzima. Es malo tanto el pH bsico como el pH cido. Nuestros enzimas tienen un pH ptimo de trabajo, sobre pH 7. (4) Inhibidores: disminuyen la actividad enzimatica e incluso la pueden llegar a anular. Son sustancias perjudiciales pero tambin beneficiosas: (4) Inhibidores Irreversibles: anula para siempre la actividad enzimatica, alteran el centro activo del enzima de manera que esta alteracin queda permanente, se conocen como venenos y seran inhibidores perjudiciales para el individuo. (4) Inhibidores Reversibles: inutilizan temporalmente al enzima, en funcin del mecanismo que empleen para inutilizarlos se clasifica: (4) Competitivos: sustancias que se caracterizan por tener una forma muy parecida a la del sustrato especifico de ese enzima, y por lo tanto compite con ese sustrato para instalarse en el centro activo, el hecho de que posean la misma forma, permiten a los organismos disminuir la accin del inhibidor aumentando la concentracin de sustrato. Este es un mecanismo beneficioso en algunas ocasiones y es el que hace que el enzima no est siempre trabajando. (4) Acompetitivos: no suelen unirse nunca al centro del enzima por lo tanto no va a tener una forma parecida al sustrato. Este se une a uno de los muchos huecos que tiene en su superficie el enzima pero no va a ser el centro activo. Provoca un impedimento fisco para la actuacin del enzima, o bien, el inhibidor se coloca antes de que lo haga el sustrato en el centro activo e impide la unin sustrato-enzima porque va a estar tapando el centro activo, o bien, se coloca despus de que se hayan unido enzimasustrato e impide su separacin. La mayora son perjudiciales. (4)

4. Indique el significado de la constante de Michaelis Menten La cintica de Michaelis-Menten describe la velocidad de reaccin de muchas reacciones enzimticas. Su nombre es en honor a Leonor Michaelis y Maud Menten. Este modelo slo es vlido cuando la concentracin del sustrato es mayor que la concentracin de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, o sea que la concentracin del complejo enzima-sustrato es constante(3) Para determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. Esa es la velocidad mxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con sustrato.(3)

Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten. 12.-BIBLIOGRAFA MARCO TEORICO RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA: (1)http://es.scribd.com/doc/17469299/Informe-N9-laboratorio-de-BioquimicaI 14/06/12 http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa 14/06/12 (2)http://www.foroswebgratis.com/mensajereconocimiento_y_desnaturalizacion_de_la_catalasa-103635-2242874-1-6020868.htm 14/06/12 *Enciclopedia Virtual Microsoft Encarta 2002, Microsoft Corporation 1993 - 2001.

DESNATURALIZACION (3) http://jose-canel.blogspot.com/p/presencia-y-desnaturalizacion-de-la.html 14/06/12 AMILA SA (4) http://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa 14/06/12 CUESTIONARIO 1.http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa 14/06/12 2.http://es.wikipedia.org/wiki/Amila 14/06/12 3.http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C%A9tica_de_Michaelis-Menten 14/06/12 4.http://html.rincondelvago.com/enzimas_12.html 14/06/12