Tujuan : SGN - 35 adalah konjugat antibodi-obat ( ADC ) yang berisi ampuh antimitotik obat , monomethylauristatin E ( MMAE ) , terkait dengan

anti - CD30 antibodi monoklonal , cAC10 . Seperti sebelumnya menunjukkan , SGN - 35 pengobatan regresi dan obat didirikan limfoma Hodgkin dan limfoma anaplastik sel besar xenografts . Baru-baru ini , ADC telah terbukti memiliki aktivitas diucapkan dalam uji klinis . Di sini , kami menyelidiki dasar molekuler untuk kegiatan SGN - 35 dengan menentukan tingkat sasaran rilis intraseluler obat dan retensi , dan kegiatan penonton . Desain Eksperimental : SGN - 35 dipersiapkan dengan 14 C - berlabel MMAE . ADC aktivasi intraseluler pada CD30 + Diterbitkan OnlineFirst 19 Januari 2010 ; DOI : 10.1158/1078-0432.CCR-092069 dan baris sel negatif ditentukan dengan menggunakan kombinasi radiometrik dan cair chromatograhpy / massa tes berbasis spektrometri . Kegiatan pengamat dari SGN - 35 ditentukan dengan menggunakan campuran kultur sel tumor yang terdiri dari CD30 Hasil : SGN - 35 pengobatan CD30 + + dan CD30 - baris . sel menyebabkan pelepasan intraseluler efisien tidak dimodifikasi secara kimia MMAE , dengan konsentrasi intraseluler dari MMAE di kisaran 500 nmol / L. Hal ini disebabkan ADC spesifik mengikat, serapan , retensi MMAE , dan daur ulang reseptor atau resynthesis . rekening MMAE untuk total terdeteksi dirilis obat dari CD30 + sel , dan memiliki paruh retensi 15 sampai 20 jam. Studi Sitotoksisitas dengan campuran CD30 + dan CD30 - baris sel menunjukkan bahwa diffusible dirilis MMAE dari CD30 + sel mampu membunuh CD30 cocultivated - sel . Kesimpulan : MMAE secara efisien dilepaskan dari SGN - 35 dalam CD30 + sel-sel kanker dan , karena yang permeabilitas membran , mampu mengerahkan aktivitas sitotoksik pada sel pengamat . Ini menyediakan mekanistik wawasan diucapkan kegiatan antitumor praklinis dan klinis diamati dengan SGN - 35 . Kanker Clin Bahan dan Metode Obat radiolabeled dan ADC. 14 C-berlabel MMAE dan vc-MMAE disusun melalui sintesis kustom dengan Perkin-Elmer ( 14 C-MMAE dan 14 C-vc-MMAE). MMAE dan vc-MMAE diberi label pada valin kedua (universal 14 C-label, 270 mCi / mmol MMAE dan 276 mCi / mmol vc-MMAE; Gambar. 1). cAC10-14 C-vc-MMAE disiapkan dengan metode yang sama dengan yang dijelaskan sebelumnya menggunakan pengurangan parsial dengan DTT (26). Sisanya yang tidak bereaksi DTT telah dihapus oleh ukuran PD10 pengecualian chroma-tography (GE Healthcare) dan kelebihan 14 C-vc-MMAE adalah ditambahkan ke konjugat pada 0 C. Setiap linker obat bereaksi adalah dipadamkan dengan sistein dan konjugasi dimurnikan dari unconjugated molekul kecil oleh PD10. spesifik aktivitas ADC ditentukan dengan UV / terlihat spektroskopi dan cairan sintilasi menghitung (LSC). spesifik aktivitas linker obat unconjugated digunakan untuk menghitung ADC obat pemuatan (7,9 pCi / mg, 4,4 obat / antibodi). Kultur sel . Garis sel CD30 - positif Karpas299 ( anaplastik limfoma sel besar ) dan garis - CD30 negatif WSU - NHL ( limfoma non -Hodgkin ) diperoleh dari und Deutsche Sammlung von Mikroorganism Zellkulturen GmbH . Garis - CD30 negatif Ramos adalah diperoleh dari American Type Culture Collection . itu Garis sel CD30 - positif L540cy , turunan dari garis HL L540 disesuaikan dengan pertumbuhan xenograft , diberikan oleh Dr Philip Thorpe ( University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas , TX ) . Sel ditumbuhkan dalam kultur suspensi di RPMI 1640 dilengkapi dengan baik 10 % janin serum bovine ( FBS , Invitrogen , Carlsbad , Karpas299 , WSU - NHL , dan Ramos ) atau 20 % FBS ( L540cy ) dalam dilembabkanlingkungan 5 % CO pada 37 C. Peentuan volume sel . Volume sel yang menghalangi -2 ditambang dengan estimasi diameter sel hidup rata-rata menggunakan Vi -Cell

viabilitas sel XR2.03 analyzer ( Beckman Coulter ) yang menyediakan ukuran sel rata-rata dalam mikron . Perhitungan Volume diasumsikan sel bulat tanpa koreksi dibuat untuk volume nuklir .ADC katabolisme dan distribusi obat ( paparan konstan ) . Sel yang diunggulkan di 5 105 Dirilis Obat dari SGN 35 sel / mL . Budaya diperiksadalam rangkap tiga dan budaya khas volume adalah 30 mL .Pada setiap hari dari 72 -h percobaan , kepadatan sel dan viabilitas ditentukan dengan pengecualian tripan biru . radioaktif SGN - 35 telah ditambahkan ke budaya masing-masing pada akhir konsentrasi ~ 200 ng / mL ( obat 6 nmol / L setara) . Flaskswereswirledtomixandaliquotswereremoved dari masing-masing labu sebagai referensi untuk jumlah total radioaktivitas ditambahkan ke budaya . Kultur diinkubasi pada 37 C dalam dilembabkan 5 % CO 2Clin Kanker Res , 16 ( 3 ) 1 Februari 2010www.aacrjournals.org 889 pada tanggal 12 Maret 2014. Asosiasi Amerika 2010 untuk Cancerclincancerres.aacrjournals.org Didownload dari Penelitian .atmosfer . pada titik waktu yang ditunjukkan , budaya dicampur dan 4 mL aliquot telah dihapus dan overlay pada FBS bantal ( 27 ) di 15 - mL tabung centrifuge . Sampel disentrifugasi pada 390 g selama 5 menit pada suhu kamar . Dari dipisahkansampel , sebuah aliquot dari fase menengah atas telah dihapus untuk analisis lebih lanjut ( lihat di bawah ) . Sisa supernatan hati-hati dihapus . Pelet itu resuspended dalam 4 mL dingin PBS dan 1 mL dihapus karena LSC kuantitasi terkait sel radioaktivitas total . sisanya 3 mL sel pellet dan diresuspensi dalam 0,5 mL proteinase K ( 5 ug / mL; Promega ) di PBS untuk menghapus permukaan - terikat ADC . Setelah inkubasi pada 37 C selama 10 menit , enzim tersebut dipadamkan dengan pengenceran dengan 1 mL FBScontaining media . Seluruh sampel overlay pada bantal FBS ( 27 ) dan disentrifugasi pada 390 xg selama 5 menit . Pelet diresuspensi dalam 100 uL medium lengkap dan kemudian diobati dengan 900 uL metanol es dingin untukendapan protein dan permeabolize sel . sebuah alikuot ini suspensi sel presipitasi ( 400 uL ) telah dihapus dan diperiksa oleh LSC menduga jumlah total intraseluler radioaktivitas . Suspensi yang tersisa disimpan pada -20 C selama 30 menit . Sampel kemudian disentrifugasi pada 16.000 g selama 5 menit . Supernatan diklarifikasi ( 500 uL ) diperiksa oleh LSC menduga jumlah total intraseluler molekul kecil radioaktif . Sebuah contoh dari media kultur dari masing-masing titik waktu diencerkan dengan sembilan volume metanol dingin . itu suspensi dihasilkan disimpan pada suhu -20 C selama 30 menit . Sampel kemudian disentrifugasi pada 16.000 g selama 5 menit dan supernatan dihitung oleh LSC untuk kuantisasi dari nonprotein terkait radioaktivitas hadir dalam medium kultur . Semua sampel yang digunakan untuk LSC dicampur dengan 4 mL Ecoscint Sebuah cairan kilau dan vortexed . L540cy sel diperlakukan dengan chloroquine ( Sigma ) yang Gambar . 1 . Struktur SGN - 35 . * , Lokasi preincubated dengan 100 umol / L klorokuin pada 37 C 1 jam diikuti oleh 5 jam inkubasi dengan radiolabeled SGN - 35 dan pengolahan selanjutnya seperti dijelaskan di atas . ADC katabolisme dan distribusi obat ( paparan terbatas ) . Untuk menguji ADC katabolisme dan distribusi obat dalam sel dengan paparan ADC terbatas , budaya dibuat seperti yang dijelaskan di atas menggunakan media kultur dingin dan ditempatkan di atas es sebelum penambahan ADC . Setelah inkubasi pada es untuk ~ 15 menit , 14 C - SGN - 35 ditambahkan pada ~ 200 ng / mL dan budaya yang terus es untuk tambahan 30 menit . Budaya kemudian disentrifugasi pada 390 xg selama 5 menit dan dicuci dengan es - dingin PBS diikuti oleh resuspension dalam , medium kultur hangat segar . Kultur ditempatkan pada 37 C dalam dilembabkan 5 % CO atmosfer dan sampel telah dihapus pada 24 jam dan diproses seperti yang dijelaskan dalam Metode paparan konstan . 2 Retensi obat gratis . Untuk MMAE percobaan retensi , 25 10 6 sel yang berbiji di 5 10 5 sel / mL . setiap sel Jenis dirawat dalam rangkap tiga dengan konsentrasi radio - aktif MMAE bertekad untuk memberikan intraseluler yang sama konsentrasi untuk jenis sel setelah 3 jam inkubasi pada 37 C. Sel-sel dicuci dua kali dalam volume yang samamedia segar . Setiap budaya dicuci dibagi m enjadi tiga

15 - mL tabung centrifuge . Aliquots Satu - mililiter telah dihapus segera dari setiap tabung untuk LSC dan kedua 1 - mL aliquot berlapis lebih dari 2 ml FBS dalam 15 mL tabung centrifuge , disentrifugasi pada 390 xg selama 5 menit pada ruang suhu . Dari sampel terpisah , 0,5 mL dari atas fase menengah telah dihapus untuk LSC . sisanya Bagian dari masing-masing sampel beku dalam bak es kering dan bagian bawah tabung berisi pelet sel dipotong ke dalam botol kilau yang mengandung 0,5 mL PBS . Sampel vortexed ; Ecoscint A cairan sintilasi ( 4 mL; Diagnostik Nasional ) ditambahkan diikuti oleh pusaran kedua , dan sampel dihitung oleh LSC ( Beckman LS6000IC , Beckman Coulter ) . aliquots lanjut ( 1 mL ) diproses lebih FBS , seperti yang dijelaskan , pada diindikasikan titik waktu . Untuk perhitungan obat intraseluler konsentrasi , kepadatan sel yang ditentukan ulang oleh tripanpengecualian setelah mencuci ke dalam media yang mengandung nondrug dan lagi setelah 24 jam . Perhitungan radioaktivitas. Perhitungan dilakukan setelah mengurangkan latar belakang dari semua disintegrasi per nilai kedua. The rangkap tiga background- dikoreksi disintegrasi per detik pembacaan dirata-rata dan SD untuk nilai-nilai dihitung menggunakan fungsi STDEVPA di Microsoft Excel . Rata-rata per disintegrasi nilai-nilai kedua dikonversi ke pCi dan selanjutnya untuk pmole obat menggunakan aktivitas spesifik radioaktif obat atau linker obat yang digunakan dalam percobaan . Untuk setiap matematika manipulasi , propagasi perhitungan error dilakukan dengan menggunakan propagasi standar formula kesalahan untuk propagasi nilai SD . Obat intraseluler konsentrasi-trations di nmol dihitung dengan menggunakan estimasi vol -ume dari 1 10 6 Diterbitkan OnlineFirst 19 Januari 2010 ; DOI : 10.1158/1078-0432.CCR-09-2069 sel . Spektrometri massa kuantisasi obat . ampel rangkap tiga sel dicuci ke mediumat segar ~ 5 10 sel / mL . ADC ditambahkan ( 200 ng / mL ) dan budaya diinkubasipada 37 C dalam 5 % CO . Untuk kuantisasi obat intraseluler , pada 24 jam , sel-sel dicacah oleh biru tripan pengecualian dan volume dikenal sel dipanen oleh sentrifugasi ( 360 g rpm , 5 menit , 4 C ) . Sel-sel yang dicuci dengan volume yang sama dingin PBS ( 360 g , 5 menit ) , repelleted , dan diresuspensi dalam budaya lengkap media untuk memberikan volume akhir 150 uL . dua volume metanol dingin ditambahkan dan sampel disimpan pada suhu -20 C selama 30 menit . Untuk kuantisasi obat dirilis dalam media kultur , sel disusun dalam cara yang sama , namun , aliquots telah dihapus lebih dari 3 d . Medium kultur itu ditemukan oleh sentrifugasi sederhana sampel dan penghapusan supernatan , mengambil perawatan tidak mengganggu pelet . Sampel medium kultur ( 150 uL ) dicampur dengan 150 uL dari 50-ng/mL intern standar dalam medium kultur yang sama . Tersebut diendapkan dengan dua volume asetonitril dingin . sampel mediumand pelet sel tidak diobati dengan ADC digunakan untuk kurva standar dan siap mengikuti curah hujan yang sama prosedur . Delapan - titik kurva standar yang dibuat dengan menggunakan berbagai jumlah MMAE ditambah konstan internal yang standar dalam matriks yang tidak diobati . Semua sampel disentrifugasi pada kecepatan tinggi untuk menghilangkan protein , dan supernatan yang dihapus dan dikeringkan dalam evaporator sentrifugal . 2 Sampel dilarutkan dalam 33 % asetonitril dan diperiksa oleh LC / MS menggunakan ekstraksi fase padat secara online . Untuk menurunkan persamaan untuk kuantisasi dirilis obat dalam sampel yang tidak diketahui eksperimental , daerah puncak untuk setiap standar obat dibagi oleh daerah puncak yang diperoleh untuk standar internal. Daerah puncak yang dihasilkan rasio yang diplot sebagai fungsi standar konsentrasi- trations dan titik-titik data tersebut cocok dengan kurva menggunakan regresi linear . Rasio luas puncak yang diperoleh untuk dirilis obat untuk standar internal di eksperimental sam 5 prinsip keuangan diubah menjadi konsentrasi obat dengan menggunakan persamaan diturunkan . Budaya ADC - diperlakukan bioassay menengah AC . sampel media kultur dihabiskan dari SGN - 35 diperlakukan sel ditambahkan ke kultur sel CD30 Ramos - negatif dalam enam pengenceran yang berbeda . Secara paralel , sel Ramos diinkubasi dengan delapan konsentrasi MMAE sebagai standar

sitotoksisitas . Setelah inkubasi 96 - jam pada 37 C , budaya Ramos yang dikembangkan menggunakan resazurin ( Sigma , relatif fluoresensi , eksitasi = 530-560 nmol / L , emisi = 590 nmol / L ) . Menggunakan unit rata-rata fluoresensi relatif ( RFU ) pengukuran untuk sel Ramos diinkubasi dengan standar MMAE , persentase sel yang layak dibandingkan dengan yang tidak diobati Sel Ramos ( % diobati ) diplot sebagai fungsi dari Konsentrasi MMAE ( nmol / L ) . Sebuah kurva empat parameter cocok digunakan untuk menghasilkan persamaan untuk kuantisasi yang dari MMAE dirilis dalam sampel budaya dihabiskan . sel viabilitas pengukuran pengenceran budaya yang dihabiskan berubah menjadi konsentrasi MMAE (dengan asumsi cyto - toksisitas disebabkan semata-mata untuk MMAE ) menggunakan persamaan ini . Hanya pengukuran viabilitas sel jatuh antara 15 % dan 85 % dari sel-sel yang tidak diobati Ramos digunakan untuk menghitung konsentrasi MMAE . Percobaan kokultur . Karpas299 , L540cy , atau Ramos sel dalam kultur tunggal yang diunggulkan di 2,5 10 sel / mL dalam volume budaya 1,5 mL , sedangkan cocultures dari Pasang CD30 - positif dan CD30 negatif terdiri dari 1,25 10 5 sel / mL dari setiap jenis sel dalam 1,5 mL budaya menengah (1:1 campuran sel , RPMI 1640 + 10-15 % FBS ) . Media kultur yang digunakan dalam percobaan kokultur memadai mendukung pertumbuhan dari ketiga jenis sel . budaya diobati dengan kontrol kendaraan , 1 mg / mL SGN - 35 , atau IgG - vc - MMAE mengikat kontrol. Setelah 72 - jam inkubasi , budaya diberi makan dengan media 60 % mengandung Jenis pengobatan yang diperlukan . Budaya diperiksa untuk sel menghitung dan viabilitas ( Vi -Cell sel XR2.03 analyzer viabilitas , Beckman Coulter ) setelah 120 jam dan sel-sel yang masih hidup diwarnai dengan anti - CD30 - phycoerythrin ( BD Biosciences ) dan anti - CD19 - FITC ( BD Biosciences ) antibodi untuk menentukan distribusi setiap jenis sel dalam budaya yang masih hidup . Pewarnaan ini dilakukan dengan memanen sel dengan sentrifugasi pada 1.200 rpm selama 5 menit , plating ~ 5 10 5 sel per sumur dalam piring 96 - baik dalam 20 uL fluores - pemilahan sel Direktorat Perbenihan Tanaman Hutan - diaktifkan ( FACS ) penyangga ( PBS yang mengandung 2 % FBS ) , dan menambahkan antibodi berlabel dengan yang diinginkan sumur tanpa pengenceran ( 5 uL / baik ) . Piring diinkubasi di atas es selama 30 menit sebelum sentrifugasi pada 1.500 rpm untuk 5 menit dan sebelum penghapusan supernatan dengan menekan piring . Sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS ( 200 uL ) sebelum melarutkan dalam 250 uL FACS penyangga dan sebelum penyimpanan pada 4 C untuk analisis berikutnya oleh aliran cytometry pada instrumen BD FACScan . hasil Dirilis Obat dari SGN 35 Pelepasan obat dari SGN - 35 . Kinetika SGN - 35 internalisasi , pelepasan obat , dan tingkat intraseluler , dirilis retensi obat ditentukan dengan radiolabeled a versi ADC disusun dengan menggunakan 14C - MMAE terkonjugasi untuk cAC10 menggunakan linker mc - valin - citrulline - PABC ditampilkan pada Gambar . 1 . ADC yang dihasilkan memiliki rata-rata 4,4 MMAE molekul melekat merantaikan disulfida seperti sebelumnya dijelaskan ( 18 , 26 ) . Nasib SGN - 35 pada kultur sel diperiksa oleh inkubasi sel dengan radiolabeled SGN - 35 dan penentuan fraksi ADCin yang mediumversus terkait dengan sel . ADC terikat ke permukaan sel telah dihapus oleh proteinase K untuk membedakan dari intraseluler ADC . Untuk media dan intraseluler fraksi , terkonjugasi MMAE dibedakan dari dirilis MMAE oleh curah hujan dalam pelarut organik . CD30 - positif L540cy HL dan Karpas299 anaplastik sel-sel limfoma sel besar diobati dengan paparan konstan dari 14 C berlabel SGN - 35 pada ~ 200 kali IC konsentrasi .Jumlah total obat terkait sel dan obat intraseluler ditunjukkan pada Gambar . 2A . Awalnya , sebagian besar obat dikaitkan dengan membran , tetapi intraseluler terikat dan dirilis obat dibangun selamauji . Di luar titik waktu awal , sebagian besar 50

obat intraseluler bebas , menunjukkan bahwa pada internalisasi , pelepasan obat dari SGN - 35 cukup lancar . Konsentrasi intraseluler dan ekstraseluler dirilis obat dalam baris sel diobati dengan SGN - 35 paparan konstan ditunjukkan pada Gambar . 2B . WSU sel - NHL adalah CD30 negatif dan idak melepaskan tingkat terdeteksi obat melalui kursus 3 hari seluruh pengujian tersebut. Sebaliknya kedua saluran sel CD30 - positif yang dihasilkan obat dirilis , dengan konsentrasi intraseluler tinggi ( > 400 nmol / L ) ditempuh dalam waktu 24 jam pengobatan . Hal ini menunjukkan tidak hanya itu SGN - 35 diproses dalam sel CD30 - positif , tetapi bahwa obat dirilis akumulasi dan dipertahankan dalam sel-sel pada konsentrasi yang lebih tinggi daripada perlakuan konsentrasi ADC awal 6 nmol / L. Penampilan obat bebas di dalam dan di luar sel L540cy adalah sangat berkurang pada suhu 4 C atau ketika sel diobati dengan chloroquine sebelum paparan ADC (Gambar 2C ) . chloroquine meningkatkan pH lisosomal dan mengurangi aktivitas lisosomal protease yang memiliki aktivitas optimal pada kondisi asam ( 28 ) . Secara keseluruhan, hasil ini konsisten dengan generasi obat ntracellular oleh CD30 - dimediasi internalisasi dari SGN - 35 , dan akumulasi obat ekstraseluler dalam media kultur melalui melarikan diri karena melekat permeabilitas membran MMAE ( 29 , 30 ) . Intraseluler dan ekstraseluler gabungan dirilis obat selama 72 jam inkubasi paparan konstan enyediakan dasar untuk memperkirakan jumlah SGN 35 molekul yang diinternalisasi oleh sel dan catabolized . Jumlah ini dapat dibandingkan dengan jumlah Reseptor CD30 hadir dalam kultur sel pada 72 jam dan maka memberikan perkiraan omset CD30 di setiap garis sel ( Tabel 1 ) . Jumlah tersebut dihitung dari ADC diinternalisasi dan catabolized adalah 2.5 dan 3.4 ADC per reseptor untuk Karpas299 dan L540cy sel , masing-masing , menunjukkan bahwa selama 72 jam SGN - 35 inkubasi , ada baik daur ulang CD30 pada permukaan sel atau sintesis reseptor baru . Hal ini didukung oleh jumlah ADC yang diserahkan ketika sel-sel diperlakukan dengan eksposur terbatas pada ADC , di mana sel-sel es dingin awalnya diobati dengan 200 kali IC 14 50 konsentrasi C - SGN - 35 seperti pada percobaan paparan konstan , tetapi kemudian dicuci untuk menghilangkan terikat ADC , menyediakan kondisi pengobatan dimulai dengan hanya CD30bound 14C - SGN - 35 . Dalam kondisi seperti ini , kira-kira salah satu ADC hadir per reseptor . Pada 24 jam , 0,5 dan 0,3 ADC diserahkan per reseptor di L540cy dan Karpas299 sel , masing-masing, dibandingkan dengan 1,2 dan 1,1 ADC per reseptor pada sel yang sama di bawah kondisi eksposur konstan ( Tabel 1 ) . Sintesis atau daur ulang reseptor akan diperlukan untuk mendapatkan peningkatan jumlah ADC catabolized setelah 24 jam di konstan dibandingkan terbatas kondisi eksposur . Temuan ini menunjukkan potensi untuk Tabel 1 . Katabolisme SGN - 35 oleh sel CD30 positif 1 10 6 Limited, daur ulang reseptor atau resynthesis dalam massa tumor selama kursus perawatan , sehingga memberikan situs mengikat baru untuk sisa SGN - 35 hadir dalam sirkulasi . perpaduan reseptor baru atau daur ulang membantu menjelaskan berkelanjutan konsentrasi MMAE diamati pada sel CD30 positif budaya dalam terang fakta bahwa MMAE diamati untuk mengumpulkan dalam media kultur (Gambar 2B ) . Identifikasi obat dirilis . Untuk menentukan apakah identitasobat dirilis secara eksklusif MMAE , bio assay dan studi pektrometri massa yang dilakukan pada molekul kecil larut yang dihasilkan dari CD30 positif sel diperlakukan dengan SGN - 35 . Data dibandingkan dengan total metanol - larut radioaktivitas berasal dari Sel-sel seperti yang ditunjukkan pada Gambar . 3A dan B. Dalam bioassay , antigennegative Sel Ramos diobati dengan budaya yang dihabiskan menengah dari SGN - 35 diperlakukan sel antigen - positif . menggunakan sitotoksisitas sel Ramos otentik MMAE standar , konsentrasi MMAE efektif dalam dihabiskan sampel kultur dihitung . Seiring waktu , ada peningkatan konsentrasi cytotoxin antigen independen yang tumpang tindih dengan konsentrasi MMAE diduga dari LSC (Gambar 3A ) . Selanjutnya , spektrometri massa kuantitatif analisis obat dirilis pada supernatan kultur sel , maupun di dalam sel (Gambar 3A dan B ) , diindikasikan bahwa spesies

dibedakan dari MMAE massa dan waktu retensi hadir dalam konsentrasi yang juga tumpang tindih dengan konsentrasi MMAE diduga dari LSC . Penghabisan seluler MMAE . Karena keluarnya dirilis obat dari sel antigen - positif dapat mempengaruhi keberhasilan terapi , kita lanjut menetapkan bahwa jenis perilaku dapat diamati dengan sel sarat dengan gratis MMAE dengan mengukur hilangnya obat intraseluler selama 24 jam, di mana waktu sel mempertahankan kelangsungan hidup mereka. Untuk mencapai hal ini, L540cy dan Karpas299 sel diobati dengan memadai 14 C-MMAE untuk mencapai konsentrasi intraseluler sekitar 3 sampai 4 umol / Landtherateofdruglosswas diukur, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3C. Untuk kedua baris sel, 50% dari awal intraseluler MMAE dipertahankan sekitar 16 sampai 22 jam, dan bahan yang tersisa adalah ditemukan dalam supernatan kultur. Menampilkan L540cy terbatas penghabisan dari rhodamine pewarna sedangkan Karpas299 tidak (Tambahan Gambar. S1), menunjukkan bahwa mantan tapi tidak kedua mengekspresikan protein resistensi multidrug tak dikenal . Meskipun perbedaan ini, penghabisan MMAE dari dua baris sel sangat mirip (Gambar 3C ) , yang menunjukkan bahwa MMAE dapat menyebar dari sel yang layak terlepas dari apakah protein resistensi multidrug hadir . karena MMAE hanya diamati dalam media kultur sel SGN - 35 diperlakukan sel CD30 - positif dan penampilan dihambat oleh penghambatan protease lisosomal , pengamatan bahwa MMAE perlahan-lahan dapat berdifusi keluar dari sel guling hipotesis bahwa ekstraseluler bebas obat yang ditemukan di SGN - 35 medium kultur diperlakukan berasal dari pengolahan intraseluler ADC , diikuti oleh berikutnya pasif atau penghabisan obat aktif . Efek pengamat . Setelah menunjukkan bahwa obat dirilis dari SGN - 35 adalah MMAE , bahwa obat ini dapat menyebar slowlyoutofthecellfromwhichitwasderived (Gambar 2B dan 3C ) , dan bahwa SGN - 35 adalah stabil di bawah ini kondisi budaya tanpa generasi MMAE dari antigen -negatif baris sel (Gambar 2B ) , kami meneliti apakah ADC memunculkan aktivitas pengamat di cocultures dengan CD30 -

baris sel CD30 positif dan negatif . Kami sebelumnya telah ditunjukkan ( 17 ) bahwa sel-sel limfoma Burkitt Ramos adalah CD30 negatif dan sensitif terhadap gratis MMAE ( IC , 0,04 nmol / L ) sebagai Karpas299 ( IC 0,07 nmol / L ) dan L540cy ( IC 50 50 , , 0,21 nmol / L ) sel , dengan IC nilai-nilai yang mewakili sensitivitas sel kanker MMAE . Menjadi CD30 negatif , sel Ramos relatif sensitif terhadap SGN - 35 ( IC 50 50 , 3.300 ng / mL dengan delapan obat per mAb ) dibandingkan dengan Karpas299 ( IC , 1.3ng/mL dengan delapan obat per mAb ) dan L540cy ( IC 50 , 9,9 ng / mL dengan delapan obat per mAb ) sel ( 17 ) . Analisis FACS dari cocultures dari L540cy dan Ramos sel menunjukkan bahwa perlakuan dengan 1 mg / mL SGN - 35 dieliminasi kedua populasi sel sama baiknya , sedangkan sel campuran sama diperlakukan populasi dengan kontrol ADC tidak mengikat yang tidak terpengaruh

(Gambar 4A dan B ) . Perlakuan yang sama dari Karpas299 / Campuran sel ramos dengan 1 mg / mL SGN - 35 menghasilkan hasil yang sama (Gambar 4C dan D ) . Hasil ini menunjukkan efek sitotoksik antigen - independen pada CD30 - negatif Sel-sel yang kemungkinan disebabkan oleh dibebaskan dari MMAE dengan CD30 -positif cocultured sel . Sebuah ADC 5 kali lipat lebih rendah dosis juga diperiksa di bawah kondisi yang sama dan ditampilkan pengurangan kurang kuat dari CD30 - negatif sel ( data tidak ditampilkan ) , menunjukkan bahwa jumlah molekul kecil agen sitotoksik yang dihasilkan tergantung pada jumlah SGN - 35 ditambahkan ke budaya . Dengan demikian , SGN - 35 memiliki aktivitas pengamat kuat pada tetangga sel antigen - negatif dalam budaya . diskusi 50 Kemajuan terbaru dalam penelitian ADC telah menyebabkan pengembangan dari SGN - 35 , seorang agen yang telah menunjukkan cukup aktivitas , baik dalam model praklinis dan klinis pada awal uji coba ( 7 , 10 , 13-16 , 18 ) . Molekul ini menggabungkan payload yang sangat ampuh , teknologi linker yang jauh lebih stabil daripada hydrazone generasi sebelumnya dan linker disulfida ( 7 , 8 , 31 , 32 ) , dan konjugasi