Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI MOLEKULER EKSPRESI GEN -GALAKTOSIDASE

PRIYANTO DWI NUGROHO G351130301

PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PENDAHULUAN Salah satu rekayasa genetika menggunakan teknik biomolekular yakni kloning gen. Kloning gen merupakan penyisipan gen ke dalam sel inang menggunakan vektor. Salah satu sel inang yang dapat digunakan yakni E. coli galur K-12 yang telah dimodifikasi kromosomnya sehingga bisa menjadi galur E. coli DH5. E. coli digunakan sebagai salah satu inang karena peta genomnya telah lengkap dan telah banyak data base mengenai karakter E. coli. Vektor dapat digunakan apabila memiliki origin of replication supaya gen yang disisipkan ke dalam vektor bisa ikut memperbanyak jumlahnya, memiliki marker untuk memberi tanda bahwa gen yang disisipkan pada vektor telah berhasil masuk ke dalam sel inang, memiliki situs retriksi, serta memiliki DNA non esensial yang sedikit. Vektor yang sering digunakan salah satunya adalah plasmid. Plasmid dan DNA dapat masuk melalui proses transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan. Tidak semua bakteri secara alami mampu melakukan transformasi, oleh karena itu sel bakteri dibuat kompeten supaya mampu melakukan transformasi. Transformasi berhasil apabila gen dari plasmid dapat diperbanyak atau diekspresikan pada sel inang. Tujuan praktikum ini untuk menyiapkan sel menjadi kompeten yang mampu melakukan transformasi. METODE Waktu dan tempat praktikum Praktikum dilakukan selama 2 (dua) hari dari tanggal 5-6 Maret 2014 di laboratorium Biorin Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB). Bahan Biakan 24 jam Escherichia coli DH5, plasmid pET 14b Lac Z-sense, pET 14b Lac Z-antisense, dan pGLO Penyiapan E. coli DH5 Kompeten Biakan E. coli DH5 sejumlah 100 L ditambah 10 mL media LB (Luria Bertani) lalu diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2-3 jam. Kemudian diukur optical density (OD) ( 580 nm dan serapan 0.400-0.500). Kemudian disentrifugasi (8000 rpm, 3 menit) dan dibuang supernatannya. Pelet ditambahkan dengan 495 L Standard Transformation Buffer (TFB) dan diinkubasi menggunakan ice box selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada suhu 4 0C (6000 rpm, 10 menit) dan dibuang supernatannya. Pelet dicampur dengan 125 L TFB dan 8.8 L Dimethylsulfoxide (DMSO) lalu diinkubasi menggunakan ice box selama 10 menit. Transformasi Masing-masing 10 L pET 14b Lac Z-sense, 10 L pET 14b Lac Z-antisense dan 5 L pGLO dimasukkan ke dalam 50 L sel kompeten E. coli DH5 dan diresuspensi perlahan kemudian diinkubasi menggunakan ice box selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan renjatan panas (42 0C, 45-60 detik) dan segera dipindahkan ke dalam ice box selama 5 menit. Ditambahkan 100 L media 2YT (Yeast Tripthone broth) dan diinkubasi (37 0C, 30-60 menit, 100 rpm) menggunakan inkubator bergoyang. Kemudian ditambahkan 10 L Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dan 5 L x-gal, serta 5 L arabinosa (khusus untuk pGLO). Selanjutnya

diinokulasi menggunakan cara spread plate pada media LA yang telah ditambahkan 50 g/ml ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kontrol dilakukan tanpa penambahan plasmid. Koloni sel transforman yang mengandung pET 14b Lac Z-sense akan berwarna biru, sedangkan Koloni sel transforman yang mengandung pET 14b Lac Z-antisense akan berwarna putih. Koloni sel transforman yang mengandung pGLO akan berpendar hijau kebiruan di bawah sinar ultra violet (uv).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 1 Pertumbuhan bakteri transforman yang membawa pET 14b-sense (a), Pertumbuhan bakteri transforman yang membawa pET 14b-antisense (b), kontrol negatif (c), kontrol positif (d), Pertumbuhan bakteri transforman yang membawa pGLO (e)

Salah satu cara untuk memindahkan DNA atau plasmid rekombinan ke sel inang yaitu melalui transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan (Dale dan Park 2004). Tidak semua bakteri secara alami mampu melakukan transformasi, salah satunya E. coli DH5. Bakteri mengambil DNA dari lingkungan apabila dinding sel telah kompeten. Sel bakteri yang akan dibuat kompeten berada pada fase pertumbuhan eksponensial/log, karena pada saat fase tersebut sel aktif membelah sehingga dinding sel dalam kondisi fragil. Beberapa cara untuk membuat sel kompeten yakni menggunakan CaCl2 dengan teknik renjatan panas (heat shock) dan elektroporasi menggunakan aliran listrik bertegangan tinggi. Prinsip dari penggunaan CaCl2, yakni bahwa setiap sel membutuhkan 100-200 nM ion Ca2+ , sehingga apabila diberikan konsentrasi ion Ca2+ lebih dari 200 nM yang terkandung di dalam larutan TFB, maka muatan negatif dari DNA yang berikatan dengan muatan positif dari ion Ca2+ dapat masuk melalui protein integral di membran sel yang pori-porinya sedang membuka karena renjatan panas pada suhu 42 0 C. Renjatan panas pada suhu 42 0C selama 45-60 detik dan inkubasi selama 15 menit mampu membuat dinding sel E. coli DH5 kompeten (Singh et al. 2010). Fosfolipid merupakan penyusun utama membran sel, sehingga apabila keseimbangan elektrik fosfolipid yang bermuatan negatif terganggu maka terjadi perubahan konformasi dari hidrofob menjadi hidrofil yang mengakibatkan molekulmolekul dari luar termasuk DNA dan plasmid dapat masuk (Gambar 2). Elektroporasi merupakan cara yang lebih efisien membuat sel kompeten, karena memanfaatkan arus listrik untuk mengganggu keseimbangan elektrik fosfolipid yang bermuatan negatif (Sambrook dan Russell 2001).

Gambar 2 Perubahan membran sel saat elektroporasi

Vektor pET 14b telah dikonstruksi mengandung penanda gen Lac Z sense atau antisense serta gen resisten ampisilin. pET 14b sense apabila berhasil masuk ke-

dalam sel inang E. coli DH5 akan menghasilkan koloni biru pada media yang mengandung ampisilin, sedangkan pET 14b antisense apabila berhasil masuk ke dalam sel inang E. coli DH5 akan menghasilkan koloni putih. Apabila pET 14b tidak berhasil masuk ke dalam sel E. coli DH5, maka sel sel E. coli DH5 tidak dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin tersebut. mRNA sense mampu mentranslasikan kode genetik menjadi protein, sedangkan mRNA antisense tidak mampu mentranslasikan kode genetik menjadi protein (gambar 3). Kemampuan mRNA sense mentranslasikan protein pada praktikum ini ditunjukkan dengan dihasilkannya enzim -galaktosidase yang berperan dalam pembentukkan warna biru pada koloni, sedangkan mRNA antisense tidak mampu mentranslasikan -galaktosidase sehingga koloni berwarna putih.

Gambar 3 Translasi protein oleh mRNA sense (a) dan mRNA antisense

Pertumbuhan koloni biru menunjukkan gen Lac Z yang diinduksi isoprophylthio--D-galactoside (IPTG) menjadi tetap aktif sehingga tetap mampu mentranskripsikan gen lac Z untuk menyandi enzim . -galaktosidase menguraikan substrat kromogenik X-gal (5-chloro-4-bromo-3-indolyl--D galaktopiranoside) dengan cara memutuskan ikatan -glikosida sehingga menghasilkan galaktosa dan 5bromo-4-chloro-3-hydroxyindole yang selanjutnya teroksidasi menjadi 5-5dibromo-4,4-dichloro indigo yang berwarna biru sehingga koloni terlihat berwarna biru. Pertumbuhan koloni putih menunjukkan pET 14b antisense berhasil masuk ke dalam sel E. coli DH5 . Lac Z menjadi tetap tidak aktif karena mRNA antisense tidak mampu mentranskripsikan gen lac Z untuk menyandi enzim -galaktosidase. Ketiadaan -galaktosidase menyebabkan substrat kromogenik X-gal (5-chloro-4bromo-3-indolyl--D galaktopiranoside) tidak terurai. (Wahyudi 1997). Mekanisme terbentuknya koloni putih-biru ditunjukkan pada gambar 4. Vektor pGLO mengandung marker (penanda), yakni gen Bla yang menyandi resisten -lactam (antibiotik golongan ampisilin), gen araC (menyandi protein regulator pada operon ara) dan gen GFP. Peta pGLO dapat dilihat pada gambar 5. Vektor pGLO apabila berhasil masuk ke dalam sel inang E. coli DH5 yang ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampisilin dan arabinosa akan menghasilkan koloni yang berfloresensi hijau menggunakan sinar UV pada 254 nm dan 365 nm. Warna floresensi hijau terbentuk karena adanya induksi arabinosa sehingga promotor ara juga mentranskripsikan gen Green Fluorescence Protein

(GFP). Apabila pGLO tidak berhasil masuk ke dalam sel E. coli DH5, maka sel sel E. coli DH5 tidak dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin tersebut. Hasil kontrol negatif pada praktikum ini menunjukkan tidak ada pertumbuhan bakteri pada media agar yang ditambahkan antibiotik. Tidak adanya pertumbuhan bakteri pada kontrol negatif karena bakteri yang ditumbuhkan tidak mengandung gen resisten antibiotik ampisilin pada kromosom dan juga tidak membawa plasmid pET 14b-sense yang mengandung gen resisten ampisilin. Hasil kontrol positif pada praktikum ini menunjukkan bahwa bakteri yang ditumbuhkan membawa gen resisten antibiotik ampisilin pada plasmid pET 14b-sense sehingga mampu tumbuh pada media yang mengandung antibiotik ampisilin. Seluruh hasil percobaan terangkum pada tabel 1.

X-gal

5-bromo-4-chloro3-hydroxyindole

5-5-dibromo-4,4dichloro indigo (berwarna biru)

Gambar 4 Mekanisme terbentuknya koloni putih-biru

Tabel 1 Pertumbuhan bakteri pada masing-masing perlakuan Perlakuan Transformasi pET 14b-sense Transformasi pET 14b-antisense Kontrol negatif pET 14b Kontrol positf pET 14b Transformasi pGLO Pertumbuhan bakteri Tumbuh Tumbuh Tidak tumbuh Tumbuh Tumbuh Warna koloni Biru Putih Putih Hijau kebiruan di bawah sinar uv

Gambar 5 Peta pGLO

KESIMPULAN 1. Sel E. coli DH5 berhasil dibuat menjadi kompeten. 2. pET 14b sense dan pET 14b antisense serta pGLO berhasil masuk ke dalam sel E. coli DH5 melalui transformasi.

PUSTAKA Dale JW, Park SF. 2004. Molecular Genetics of Bacteria. West Sussex (GB): John Wiley & Sons. Sambrook J, Russel DW. 2001. Moelcular Cloning: A Laboratory Manual vol.1 3ed. New York (US). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Singh M, Yadav A, Ma X, Amoah E. 2010. Plasmid DNA transformation in escherichia coli: effect of heat shock temperature, duration, and cold incubation of CaCl2 treated cells. J Biotech and Biochem. 6(4): 561-568. Wahyudi AT. 1997. Gen penanda molekuler pada bakteri [Ulasan]. Hayati. 4(1): 2729.

Pengantar Praktikum biologi molekuler pada mahasiswa pascasarjana mikrobiologi memberikan pengetahuan yang sangat bermanfaat. Penelitian saat ini di bidang mikrobiologi telah banyak menggunakan teknik molekuler. Salah satu teknik molekuler yang wajib dipelajari adalah kloning gen. Secara ringkas kloning gen merupakan penyisipan gen dari suatu organisme ke dalam organisme lain (sel inang). Penyisipan gen ke organisme lain menggunakan vektor, antara lain plasmid. Plasmid yang membawa gen target atau sering disebut plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam sel bakteri melalui proses transformasi. Sel bakteri tidak semuanya secara alami mampu menerima atau mengambil DNA dari lingkungannya. Beberapa perlakuan diberikan ke sel bakteri supaya menjadi sel yang dapat menerima atau mengambil DNA dari lingkungannya. Heat shock dengan CaCl2 merupakan salah satu cara yang banyak digunakan untuk membuat sel bakteri kompeten. Sel bakteri yang menerima plasmid rekombinan disebut bakteri transforman. Screening secara cepat untuk mengetahui apakah bakteri telah mengalami transformasi dapat menggunakan seleksi koloni biru-putih dan seleksi menggunakan plasmid yang membawa gen reporter GFP sehingga koloni bakteri transforman akan berpendar di bawah sinar UV. Konfirmasi berikutnya menggunakan PCR koloni dan isolasi plasmid rekombinan serta dilakukan restriksi. Gen target yang telah terdapat di dalam sel inang selanjutnya di analisis ekspresinya. Ekspresi gen antara lain protein. Protein yang merupakan hasil ekspresi gen target dianalisis menggunakan SDS PAGE untuk mengetahui bobot molekulnya. Ekspresi gen yang berupa enzim juga diamati dari kemampuannya merubah substrat spesifik menjadi produk. Praktikum yang telah selesai dilakukan dan telah dibuatkan laporannya ini merupakan rangkaian kegiatan untuk mengetahui ekspresi gen -galaktosidase yang telah disisipkan ke sel inang E. coli DH5 menggunakan vektor pET-14b. Tahapan praktikum ekspresi gen -galaktosidase sebagai berikut :

PCR

Isolasi Plasmid dan Restriksi

Isolasi Enzim dan Analisis Protein Uji Aktivitasnya menggunakan SDS PAGE

Koloni Penyiapan sel kompeten danTransformasi

Penyiapan sel kompeten & Transformasi

PCR Koloni

Isolasi Plasmid & Restriksi

Analisis Total Protein, Isolasi Enzim, dan Uji Aktivitas Enzim

Anda mungkin juga menyukai