BAB VII.

BIOANALISIS SECARA FISIKA-KIMIAWI Sampel-sampel biologos dari suatu uji harus segera mendapatkan penanganan yang tepat supaya diperoleh hasil yang baik dan valid. Apabila penanganan sampel terlambat atau tidak tepat, kemungkinan besar sampel akan mengalami kerusakan atau perubahan yang tentunya akan mempengaruhi hasil analisanya atau penetapan kadarnya. Bila hal ini terjadi tentu saja akan berakibat fatal, karena jelas akan mempengaruhi hasil evaluasi yang mana kesimpulan yang diambil akan dijadikan dasar pijakan untuk membuat kebijakan. Sebagai contoh penetapan kadar obat jantung dalam darah seorang pasien untuk suatu uji farmakokinetika. Dari uji ini akan diperoleh kadar obat dalam darah pada berbagai waktu, kemudian akan dihitung harga parameter-parameter farmakokinetika obat tersebut. Selanjutnya akan dievaluasi berdasarkan harga parameter farmakokinetika yang dipero!eh apakah penlu dilkukan perubahan dosis untuk si pasien. Apabila terjadi kesalahan dalam penetapan kadar obat tentunya akan terjadi kesalahan pula dalam pengambilan keputusan tersebut, hal mana akan sangat menentukan kelangsungan hidup jiwa pasien karena penetapan dosis yang salah bisa mengakibatkan kematian pasien. Penanganan sampel awal seharusnya memenuhi cara penanganan sampel yang baik, sehingga diharapkan dapat meminimalkan kesalahan. Penanganan ini meliputi saat pengumpulan atau pengambilan,penyimpanan dan pengangkutan sampel serta pengembangan metode analisis yang sesuai. Sebagai contoh metriphonate dan dichiorvos dalam sampel darah dapat mengalami kerusakan yang cepat, hal ini bisa dicegah lewat pengasaman langsung dengan penambahan asam phosphor. Terjadinya dekomposisi diamorphine dalam plasma juga harus menjadi perhatian. Obat ini juga akan mengalami deasetilasi dalam larutan basa membentuk 6-monoacetilmorphine dan selanjutnya membentuk morphine. Untuk mencegah degradasi tersebut disarankan agar sampel disimpan pada suhu 4 C, pembekuan sampel plasma sesegera mungkin dan esktraksi cair-cair untuk mencegah kesalahan analisis selanjutnya dalam studi pharmakokinetik heroin. A. Penanganan awal sampel-sampel biologis 1. Denaturasi protein Obat dalam sampel biologis berada bersama-sama dengan senyawa lain terutama protein, karena obat akan berikatan dengan protein plasma untuk didmstribusikan, sehingga harus dilakukan pemisahan. Proses pemisahan bisa

dilakukan dengan cara denaturasi protein, bisa dengan penambahan asam, misalnya TCA 10% (trichloro acetic acid) atau dengan pemanasan pada suhu tertentu. Perlu diperhatikan adalah pengaruh bahan yang digunakan atau pemanasan terhadap obatnya, karena bisa mengakibatkan perubahan struktur kimia atau kerusakan. Jadi harus dipifih bahan yang cocok atau metode denaturasi yang sesuai. Denaturasi protein bisa dilakukan dengan mengatur pH medium, misalnya menggunakan asetonitril. Setelah plasma dicampur dengan asetonitril dengan volume yang sebanding, larutan dijenuhkan dengan sodium bisulfate atau sodium kiorida, maka protein akan mengendap dan obat terpisah berada dalam fase atas. Bisa juga dilakukan dengan enzim proteolitik yang sesuai. Misalnya enzim subtilisin bisa mendenaturasi protein plasma dengan baik. 2. Ekstraksi pelarut untuk senyawa hidrofobik Senyawa hidrofobik merupakan senyawa tidak suka air, sehingga harus dipertimbangkan bagaimana sifat senyawa pengekstraksi, apakah berupa pelarut organic atau anorganik. Apalagi jika pelarut yang digunakan untuk ekstraksi lebih dan satu, maka harus dipilih kombinasi yang tepat sehingga dihasilkan komposisi pelarut yang dapat mengekatraksi secara efektif dan efisien. Artinya jumlah pelarut sesedikit mungkin, tetapi dapat menghasilkan senyawa terekstraksi sebanyak mungkin. 3. Liofillsasi Kestabilan senyawa kimia sangat dipengaruhi oleh sifat fisikakimianya, apalagi jika berada dalam sampel biologis, oleh sebab itu diperlukan penanganan tepat agar tidak terjadi kerusakan. Salah satu upayanya adalah dengan melakukan liofilisasi (pembekuan), yaitu dengan menyimpan sampel pada suhu dibawah 0 C lazimnya -20 C , -70 C atau dalam nitrogen cair. Suhu yang dipilih biasanya tergantung jenis sampel dan lama penyimpanan yang diinginkan. 4. Hidrolisis konjugat Hidrolisis konjugat diperlukan bila senyawa yang akan kita analisis dalam bentuk terkonjugasi dengan senyawa lain. Macam senyawa penghidrolisis bisa berupa enzim atau senyawa kimia biasa, hal ini sangat tergantung pada jenis ikatan konjugasi dan proses pembentukannya. 5. Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan ekstraksi

Proses derivatisasi diperlukan jika senyawa sulit untuk diisolasi, tetapi akan lebih mudah bila berada dalam bentuk derivatnya. Untuk memebntuk derivatnya tentu diperlukan suatu senyawa spesifik yang harus ditambahkan sehingga bereaksi dan dapat mengubah struktur kimia senyawa awal menjadi derivatnya. Pemilihan senyawa apa yang harus ditambahkan dan kondisi bagaimana yang harus dipenuhi, tentunya diperlukan pengetahuan khusus dan juga pengalaman untuk mengerjakanya. Harus pula diketahui proses reaksi dan mekanismenya, sehingga tidak keliru membentuk senyawa lain. B. Prosedur ekstraksi dan prinsip pengukuran untuk obat dan metabolitnya 1. Ekstraksi padat-cair dan cair-cair 2. Metode kromatografi, spektroskopi dan radiokimia dalam bioanalisis kualitatif dan kuantitatif (review) 3. Aplikasi untuk sampel biologis