Anda di halaman 1dari 53

TPC, MPN, Uji Bonterey

TPC, MPN,

UJI BONTEREY

Disusun Oleh :

KELOMPOK

SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN NEGERI 13 BANDUNG PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA DAN TEKNIK KOMPUTER JARINGAN
Jl. Soek !no"H ## K$. 1% Tel&'( ). *%++, -31./0% 1 2%+.0 E"$ il 3 s$kn134567.8en#!in.ne#.i6 +%%.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

K # Pen7 n# !
Puji serta syukur kami panjatkan atas rahmat dan karunia-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan penuh rasa tanggung jawab dan tepat waktu dalam pengumpulannya. Tujuan disusunnya makalah ini adalah untuk memenuhi salah satu tugas mata pelajaran mikrobiologi, khususnya mengenai masalah pembelajaran praktikum di semester 5 ini, mengenai TPC, #lmu biologi$mikrobiologi. %ami juga ingin mengu&apkan terima kasih kepada semua pihak-pihak yang telah membantu kami dalam penyusunan makalah ini. 'emoga makalah ini dapat berman(aat bagi kami khususnya selaku penyusun dan bagi siapa saja yang telah memba&anya pada umumnya. )khir kata tiada gading yang tak retak, demikian pula dengan makalah ini yang masih jauh dari sempurna. Tak lupa kritik dan saran sangat kami harapkan demi penyempurnaan di masa yang akan datang.
"andung, )gustus *++,

PN, dan !ji "onterey dalam

metode analisa yang dilakukan, serta untuk menambah pengetahuan mengenai

Pen9usun

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

D :# ! Isi
K # Pen7 n# ! .. i D :# ! Isi .... BAB I PENDAHULUAN -.-. .atar "elakang . -.* Tujuan .. BAB II PEMBAHASAN *.-. Perhitungan ikroba dengan TPC ... 5 , --5 -5 -1 **2 *5 *7 22 44 *.-.- Pengenalan dasar Praktikum TPC. *.-.* Praktikum TPC /)ngka .empeng Total0.. *.* )nalisis etode PN . PN PN se&ara umum.. *.*.- )nalisis koli(orm metode *.*.* Praktikum ii

*.*.2 Pengujian 3s&heri&hia &oli *.*.4 )nalisis kualitas dan sanitasi air... *.2 !ji "onterey .. *.2.- 6ermentasi karbohidrat. *.2.* !ji # 8#C. *.2.2 Penggunaan &itrat.. BAB III PENUTUP 2.-. %esimpulan .. 2.*. 'aran ............ D :# ! Pus# k ........ LAMPIRAN ......

47 47 41 4,

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

BAB I PENDAHULUAN
1.1 L # ! Bel k n7 Pengukuran kuantitati( populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai ma&am penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai ma&am &ara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi se&ara mendasar, ada dua &ara yaitu se&ara langsung dan se&ara tidak langsung. )da beberapa &ara perhitungan se&ara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan /preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai0 dan penggunaan ruang hitung /counting chamber0. 'edangkan perhitungan &ara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja /viabel count0. 9alam pelaksanaannya, ada beberapa &ara yaitu : perhitungan pada &awan petri /total plate count $ TPC0, perhitungan melalui pengen&eran, perhitungan jumlah terke&il atau terdekat /MPN metode0, dan kalorimeter /&ara kekeruhan atau turbidimetri0. Tujuan dari analisa ini adalah agar siswa$pratikan mampu melakukan uji bakteriologis terhadap air minum dengan metode PN /Most Probable Number0. Pengujian bakteri koli(orm yang berasal dari &emaran tinja /faecal koliform0 se&ara serentak dengan uji penegasan yang menggunakan media ":.", maka dilakukan juga hal yang sama yaitu - ose kultur yang positi( dari .'T "roth atau .", dipindahkan ke dalam tabung 3C medium yang baru. 'emua tabung C medium yang telah diinokulasikan oleh kultur dari .'T-"roth, kemudian diinkubasikan pada suhu 45,5;C selama *4 jam dan hasil pembentukan gas di&atat. %erapatan bakteri faecal koliform diperkirakan dengan tabel 9i(erensiasi bakteri koliform dapat diarahkan ke dalam reaksi # 8#C. "erbagai ma&am uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi uji kuantitati( mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitati( bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan PN.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai (aktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan, &ara pengepakan dan penyimpanan serta komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai (aktor lainnya , To# l Pl #e ;oun# *TP;, TPC /Total Plate Count0 atau ).T /Angka Lempeng Total0 dan sering disebut juga sebagai P.T /Perhitungan Lempeng Total0, digunakan dan dipakai untuk uji &emaran mikro di #ndustri baik, itu industri makanan, kosmetik terutama untuk bahan-bahan sampel yang berwujud padat dan &air, baik sampel alami atau pun yang ada di dalam kemasan dari suatu produk. 'e&ara umum tujuan untuk dilakukan TPC ini adalah untuk menentukan total mikroba yang ada pada suatu sampel /baik padat ataupun &air0 dengan metode pengen&eran serial dan &awan tuang, dimana pengen&eran serial ini merupakan proses pengen&eran yang dilakukan dalam beberapa tahap kali pengen&erannya, sedangkan setelah dilakukan proses pengen&eran, maka akan dituangkan ke dalam &awan petri untuk dilakukan proses analisa lebih lanjut, yaitu tahap inkubasi dan proses perhitungan jumlah mikroba. Penghitungan jumlah mikroorganisme dengan &ara viable count atau disebut juga sebagai standar plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme yang hidup di dalam suspensi, akan tumbuh menjadi - /satu0 koloni setelah diinkubasikan di dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. 'etelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Penghitungan jumlah mikroorganisme hidup /viable count0 adalah jumlah minimum mikroorganisme. <al ini disebabkan oleh koloni yang tumbuh pada lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak di dalam media dan suhu inkubasi tertentu. 'ebagai &ontoh, sampel tanah mungkin mengandung bakteri yang bersi(at aerobik dan anaerobik. =ika suspensi yang berasal dari sampel tanah ini ditumbuhkan dalam keadaan aerob, maka hanya mikroorganisme yang bersi(at aerob dan aerob (akultati( saja yang dapat tumbuh, sedangkan mikroorganisme anaerob tidak dapat tumbuh. "ila media

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

biakan tidak mengandung biotin, maka hanyalah mikroorganisme yang tidak memerlukan biotin saja yang dapat tumbuh, sedangkan mikoorganisme yang memerlukan biotin sebagai (aktor pertumbuhan tidak dapat tumbuh. "erdasarkan hal tersebut, media biakan dan lingkungan pertumbuhan dapat diatur sehingga hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat tumbuh. spesimen penyakit-penyakit tertentu. 5, Mos# P!o5 5le Nu$5e! *MPN, etode PN / ost Probable Number0 untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan kelompok koli(orm sebagai indikator. %elompok koli(orm men&akup bakteri yang bersi(at aerobik dan anaerobik (akultati(, batang :ram negati(, dan tidak membentuk spora. etode PN ini digunakan untuk menguji kualitas air yang dianalisis di dalam suatu langkah pengerjaan metode analisa, dengan proses perhitungan total bakteri yang melibatkan bakteri Esherichia coli, sampel yang digunakan adalah sampel air yang diujikan, dan apabila terdapat bakteri E.coli di dalam sampel air tersebut, maka dapat dinyatakan bahwa sampel air tersebut telah terkontaminasi oleh bakteri E.coli, yang berasal dari kotoran, baik itu kotoran yang berasal dari kotoran manusia, maupun hewan. Pada dasarnya PN ini didasarkan pada ada tidaknya bakteri Escherichia coli dalam suatu sampel air yang kita analisa. )pabila tedapat bakteri Escherichia coli. 9an jenis koli(orm lainnya maka dapat disimpulkan bahwa air tersebut telah terkontaminasi oleh bakteri E.coli yang mungkin saja berasal dari kotoran-kotoran yang dikeluarkan oleh manusia atau pun hewan dari hasil pen&ernaan yang dilakukan oleh tubuhnya. 8, U<i Bon#e!e9 'e&ara garis besar dan umum, uji bonterey dapat diartikan sebagai proses uji ada tidaknya akti?itas yang ditimbulkan oleh suatu mikroba melalui etode seleksi ini la>im digunakan untuk mengisolasikan mikroba patogen di dalam air, makanan, dan

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

penguraian suatu >at oleh akti?itas mikroba$bakteri yang dikenal dengan nama reaksi (ermentasi dari suatu sampel. Terdapat beberapa uji biokimiawi dan mikrobiologi yang diperlukan untuk proses identi(ikasi suatu mikroorganisme, baik yang dikenal maupun yang tidak dikenal, diantaranya adalah : -0 !ji # 8#C / #ndol @ ethyl-red @ 8oges-Praskuaer @ Citrate0.

*0 !ji 6ermentasi %arbohidrat 20 !ji Aksidase dan uji katalase 40 <idrolisis urea Proses pengujian yang dilakukan ini pada dasarnya adalah untuk menganalisis ada tidak akti?itas mikroba di dalamnya. <al ini yang menunjukna layak tidaknya suatu bahan, baik itu makanan atau minuman, bahkan bahan-bahan yang lain untuk dapat diproduksi dan dipasarkan, karena tidak semua bahan-bahan yang telah terdapat di masyarakat berkualitas baik. !ji-uji yang dilakukan didasarkan pada metode analisa dasar mikroorganisme melalui kegiatan praktikum mikrobiologi dan analisa terhadap suatu bahan, baik dengan menggunakan alat-alat instrumen maupun dengan menggunakan alat-alat analisa seadanya dengan proses pengerjaan yang aseptis sebelumnya. etode dasar yang digunakan ini umumnya sama halnya dengan praktikum uji dari suatu bahan di lab-lab klinis, dengan mengetengahkan pengadaan mikroba dalam lingkungan masyarakat. 1.+ Tu<u n -. ampu memenuhi salah satu tugas mata pelajaran mikrobiologi, yakni pembuatan makalah tentang TPC /Total Plate Count0, Probable Number0, dan !ji "onterey /!ji #denti(ikasi waktu dalam pengumpulannya. *. Pemahaman tentang pola pengajaran di dalam praktikum dengan re(erensi yang tepat, dalam pelaksanaannya PN / ost ikroba0, tepat

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

BAB II PEMBAHASAN

+.1 Perhitungan Mikroba dengan TPC 9alam proses penentuan pertumbuhan dari suatu mikroba, yaitu baik dalam pembuatan kur?a prtumbuhan atau pun dalam penyajian yang lain, sebelumnya dilakukan dahulu proses perhitungan. Cara perhitungan yang paling umum dilakukan didalam metode praktikum mikrobiologi ini adalah dengan &ara proses pengen&eran. Proses analisa yang dilakukan tentu saja dengan metode pengerjaan yang aseptis, karena yang dibutuhkan hanyalah pertumbuhan dari suatu mikroba, dari dalam sampel yang kita preparasikan untuk kegiatan praktikum bukan dari luar bahan yang kita siapkan. Metode Pengencerannya : 9engan pengen&eran, disiapkan beberapa buah tabung yang berisi aBua-des steril sebanyak , m.. %epada masing-masing tabung kemudian ditambahkan m. sampel yang mau diperiksa se&ara bertahap, yaitu : a0 - m. sampel ke dalam tabung pertama, hingga konsentrasi larutan di dalam tabung pertama menjadi -+--. b0 - m. dari tabung pertama dimasukan ke dalam tabung kedua, hingga konsentrasi larutan di dalam tabung kedua menjadi -+-*. 9an seterusnya sampai men&apai larutan dengan konsentrasi terendah, hal ini dimaksudakan untuk proses pengen&eran dari suatu sampel, sehingga nanti tidak akan menyulitkan di dalam proses pengamatan mikroba dari sampel yang sedang kita analisis. %arena pada dasarnya sampel yang kita analisis ini, belum tentu memiliki jumlah mikroba yang sedikit pada awalnya, tetapi hampir dipastikan dan diyakini, bahwa pada awal preparasinya, suatu sampel akan membawa jumlah mikroba yang &enderung memiliki jumlah yang banyak, apalagi

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

jika sampel yang kita bawa dari bahan alami, yaitu jenis sampel terbuka, berbeda dengan sampel tertutup, karena hal ini pasti dibedakan tergantung dari jenis sampel yang sedang kita analisis. 9ari tiap-tiap tabung kemudian diambil - m. larutan dan ditanamkan ke dalam &awan petri berisi media pdat. Pertumbuhan koloni yang timbul pada tiaptiap &awan, dihitung. 9i dalam &awan petri ini harus diperhitungkan (aktor kerapatan pertumbuhan koloni. %arena kalau pertumbuhan terlalu rapat, biasanya sulit untuk dipertanggung-jawabkan hasil yang telah di dapat. =uga untuk pertumbuhan yang terlalu jarang, sehingga diperlukan adanya pemilihan &awan yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemungkinannya untuk dihitung. 9an hal yang perlu di&atat pengen&eran ini dilakukan untuk mempermudah proses pengamatannya juga, karena semakin en&er sampel suatu larutannya, maka kemungkinan untuk tumbuhnya pun semakin besar, dan mikroba yang tampak pun akan semakin sedikit. 9ari gambaran di bawah ini terlihat jelas bahwa &awan yang paling memungkinkan untuk dihitung adalah &awan yang diisi pengen&eran -+-2 /-$-.+++0 yang menghasilkan jumlah koloni -5, sel. 'ehingga perhitungan menjadi : -5, C -+2 D -,5, C -+5 sel$m. dimana, -5, D jumlah koloni pada &awan tersebut. -+2 D pengen&aran yang dihitung. Cara pemgen&eran berikutnya lebih diperjelas, sehingga pertumbuhan koloni mana yang dapat dipergunakan untuk perhitugan dan mana yang tidak digunakan, juga dengan jelas akan menjadi nampak. Proses yang dilakukan se&ara aseptis ini bertujuan agar semua mikroba yang kita analisis, kerena bisa saja apabila analisis dan proses pengerjaannya tidak dilakukan dengan langkah pengerjaan yang aseptis, mikroba yang akan ter&ampurkan akan terambil dari mana saja, di luar dari sampel yang kita ujikan.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

/Gambar. Cara perhitungan jumlah mikroba dengan pengen&eran0

adapun metode yang lain dan dapat digunakan :

G $5 !. &ara perhitungan dengan pengen&eran sederhana

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

!ntuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa &ara pengerjaan : -0 =umlah bakteri se&ara keseluruhan /total cell count0. Pada &ara ini dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun yang mati. *0 =umlah bakteri yang hidup /viable count0. Cara ini hanya menggambarkan jumlah sel yang hidup, sehingga lebih tepat bila dibandingkan teknik pada total &ell Count. Perhitungan bakteri secara keseluruhan. . Men7hi#un7 L n7sun7 se8 ! Mik!osko&ik Pada &ara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat ke&il. !ntuk ini digunakan ka&a obyek khusus yang bergaris /Petroff- auser0 berbentuk bujur sangkar. =umlah &airan yang terdapat antara ka&a obyek dan ka&a penutup mempunyai ?olume tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Pembesaran yang digunakan untuk melihat bakteri membatasi ?olume &airan yang sedang diperiksa. <anya &airan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi yang dapat menggunakan &ara seperti ini. 'elain menghitung se&ara langsung dengan mata, dapat pula digunakan alat penghitung elektronik Coulter Counter. 9engan alat ini dihitung semua benda yang memiliki ukuran diameter 2+ Em, sehingga &airan yang akan dihitung jumlah bakterinya haruslah benarbenar hanya mengandung bakteri. 5. Men7hi#un7 6en7 n 8 ! keke!uh n Cara ini menggunakan spektro(otometer atau ne(elometer. 9asar teknik ini adalah banyaknya &ahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu. Cara ini dilakukan untuk mengaplikasikan segala ma&am keterampilan yang dimiliki dalam metoda penghitungan jumlah mikroba yang hidup di dalam suatu sampel yang sedang kita analisis, tetapi juga haruslah hati-hati di dalam proses pengerjaannya, alangkah lebih berman(aatnya jika dilakukan di dalam tahap pengerjaan yang baik.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.1.1 Pengenalan dasar praktiku

TPC !Total Plate Count"

%egiatan praktikum TPC ini bertujuan untuk menentukan total mikroba yang ada pada suatu sampel /baik sampel yang padat maupun yang &air0 dengan metode pengen&eran serial dan &awan tuang. 9imana pengen&eran serial ini dimaksudkan agar proses pengamatan lebih mudah, karena koloninya lebih sedikit dalam &awan petri yang diamati. =uga hal ini bertujuan untuk memenuhi syarat perhitungan dalam data statistik yang telah ditetapkan se&ara pasti. !imana s"arat perhitungann"a adalah : =umlah koloni yang masuk ke dalam perhitungan adalah koloni dengan jumlah anatara 2+ @ 2++ koloni mikroba dari sampel. <al ini dimaksudkan agar sesuatu dengan data statistik. a. =enis-jenis sampel untuk TPC -0 'ampel &airan /&o : sirup, susu, ma&am minuman0 *0 'ampel serbuk /&o : susu bubuk0 20 'ampel kental /&o : ke&ap0 40 'ampel padat /&o : biskuit0 50 'ampel beku /&o : daging beku0
; # : pada sampel padat preparasi yang dilakukan adalah darus ditimbang terlebih dahulu, baru dilakukan proses pelarutan dengan bantuan pemanasan.

b. Pelarut yang digunakan -0 )ir steril *0 Peptone water /Pw0 20 "u((ered Peptone Fater /"pw0 40 "u((ered 9istilled Fater /"9w0 50 Phosphat "u((ered 9istilled Fater /P"9w0
; # : hal yang harus dilakukan adalah gunakan pelarut baik yang dapat melarutkan sampel, tetapi apabila sampel tidak dapat larut baik, maka &ukup dilarutkan menjadi suspensinya saja.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

&. Pengen&er dan media yang digunakan -0 Pengen&ernya adalah air steril sebanyak , m. di dalam tabung-tabung reaksi yang dipersiapkan untuk proses pengen&eran.
; # : =umlah pengen&er ini dipengaruhi oleh asal atau jenis sampel ada * ma&am asal sampel, yaitu : a0 'ampel yang kontaminasinya besar yaitu bahan-bahan alami, dan berasal dari tempat terbuka, &ontoh : gorengan, buah-buahan di pinggir jalan, makanan terbuka. Pengen&eran yang dilakukan dari -++ s$d -+-7 atau lebih. b0 'ampel yang kontaminasi sedikit, berasal dari bahan-bahan yang sudah dikemas dan pastinya tertutup.&ontoh : makanan dalam kemasan dan bermerk, (rutang, air aBua. Pengen&eran dilakukan sampai -+-4 atau -+-5.

*0

edia yang digunakan adalah media PC) /Plate Count )gar0 Tahapan pembuatannya :
-. *. 2. 4. 5. 5. 7. enghitung kebutuhan massa enimbang massa media padat elarutkan /bantuan pemanasan0 enge&ek p< media dalam larutan engukur kebutuhan media embungkus media dalam larutan 'terilisasi media.

d. Preparasi sampel untuk TPC Preparasi yang dilakukan baik sampel padat maupun &air adalah dengan alat-alat yang steril tentunya. Preparasi untuk sampel &air
-0 *0 20 40 50 50 ensterilkan seluruh permukaan kemasan dari bahan atau sampel dengan menggunakan kapas beralkohol di lap. elakukan sampling se&ara aseptis dengan wadah steril. esterilkan wadah atau kemasan. enghomogenkan sampel /supaya mikroba rata di semua sampel bahannya0 emipet se&ara aseptis. elakukan tahapan pengerjaan selanjutnya.

Preparasi untuk sampel padat /berlaku juga untuk yang kental0

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

-0 *0 20 40 50 50 70 10 ,0

enyediakan kertas alumunium (oil untuk sampling. embungkus sampel atau bahan padat dengan kertas )6. elakukan sampling se&ara aseptis. ensterilkan wadah atau kemasan yang diperlukan. enghomogenkan atau menghaluskan se&ara aseptis yaitu dengan &ara blender atau menumbuknya0. enimbang se&ara aseptis sampel yang telah dipreparasikan. elarutkan se&ara aseptis /dekat api, dan jika perlu lakukan proes pemanasan0. emipet sampel se&ara aseptis. elakukan langkah pengerjaan analisis praktikum selanjutnya.

Catatan penting : Pada langkah pengerjaan praktikum TPC hal yang paling utama dilaksanakan adalah melakukan semua pekerjaan se&ara aseptis dan menyelesaikan semua metode pemipetan dari botol sampel ke tabung-tabung, dan ke dalam &awan petri setelah itu daru menambahakan -5 m. PC) suhu 45GC - 5+GC.

+.1.+ Praktiku

TPC !#ngka $e peng Total" n

P!insi& Pen7e!<

Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob /psikro(ilik, meso(ilik dan termo(ilik0 setelah &ontoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 25;C H -;C selama *4 jam 41 jam H - jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung. Penentuan )ngka .empeng Total dapat dilakukan dengan dua &ara. Pertama, metoda &awan agar tuang$pour plate yaitu dengan menanamkan &ontoh ke dalam &awan Petri terlebih dahulu kemudian ditambahkan media agar. %edua, metode &awan agar sebar$ spread plate yaitu dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam &awan petri kemudian &ontoh diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok. Al # 6 n B h n ..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

1. Pe! l # n a0 Timbangan dengan ketelitian +,+++- gI b0 AutoclaveI &0 #nkubator 25 ;C H -;C d0 Anaerobic #arI e0 Cawan petri -5 mm C ,+ mmI (0 "otol pengen&er *+mlI g0 )lat penghitung koloniI h0 "lender beserta $ar yang dapat disterilisasi atau stoma&herI i0 "atang gelas bengkok diameter 2 mm@4 mm, dengan panjang tangkai -5 &m-*+&mI j0 Pipet gelas atau pipetor : +,- ml, - ml, 5 ml dan -+ ml. +. B h n a0 'ampel susu murni b0 PC) /Plate Count )gar0 dalam tabung sebanyak *+ m.. &0 .arutan pengen&er P!ose6u! HARI PERTAMA 3 Metoda cawan agar tuang/pour plate method a0 Pipet -ml dari setiap pengen&eran -+--,-+-*, dst dan masukkan ke dalam &awan Petri steril. .akukan se&ara duplo untuk setiap pengen&eran. b0 Tambahkan -* ml - -5 ml PC) yang sudah didinginkan dalam %aterbath hingga men&apai suhu 45;C H -;C ke dalam masing-masing &awan yang sudah berisi &ontoh. 'upaya &ontoh dan media PC) ter&ampur sempurna lakukan pemutaran &awan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.

;ATATAN 3 !ntuk pengujian bakteri termo(ilik, penambahan media PC) kedalam &awan sebanyak 4+ ml - 5+ ml.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

&0 'etelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi &awan-&awan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 41 jam H* jam pada suhu **;C H-;C /psikro(ilik0I 25;C /meso(ilik0I 45;C /termo(ilik0. d0 !ntuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi &awan-&awan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam inkubator selama 41 jam H * jam pada suhu ** ;C H-;C /psikro(ilik0I 25;C /meso(ilik0I 45;C /termo(ilik0. Metoda cawan agar sebar /spread plate method a0 Tuang -* ml @ -5 ml PC) ke dalam &awan-&awan petri steril dan dinginkan. Pipet +,- ml dari setiap pengen&eran /-+--,-+-*, dst0 ke dalam &awan petri yang telah berisi media PC) diatas dan ratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok. .akukan se&ara duplo untuk setiap pengen&eran. b0 'etelah &ontoh meresap kedalam agar /diamkan sekurang-kurangnya jam0I !ntuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi &awan-&awan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 41 jam H * jam pada suhu **;C H-;C /psikro(ilik0I 25;C /meso(ilik0I 45;C /termo(ilik0. !ntuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi &awan-&awan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam inkubator selama 41 jam H * jam pada suhu **;C H -;C /psikro(ilik0I 25;C /meso(ilik0I 45;C /termo(ilik0. &0 .akukan kontrol tanpa &ontoh dengan men&ampur larutan pengen&er dengan PC)media PC). HARI KEDUA 3 -. enghitung jumlah koloni pada lempengan agar. :unakan lempengan agar yang mempunyai 2+ @ 2++ koloni. "ila tidak ada lempengan yang mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut, gunakan lempengan agar yang mempunyai koloni sekitar 2++. 9an apabila tidak terdapat jumlah koloni

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

yang ditetapkan sebelumnya, maka hal yang harus dilakukan adalah melakukan pengulangan dalam proses pengambilan sampel dan kemudian berlanjut dengan penambahan proses pengen&eran, misal asalnya proses pengen&eran hanya sampai tahap -+-4 akan menjadi -+-5, jadi ditambahkan agar tidak terlalu menyulitkan dalam proses pengamatannya nanti. *. enentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan &ara mengalikan jumlah koloni dengan (aktor pengen&eran. 9an langkah terakhir yang perlu untuk dilakukan adalah melaporkan hasil pengamatan dan perhitungan yang telah dilakukan dalam pengerjaan analisis mikrobiologi.
(o!$ # L &o! n To# l Pl #e ;oun#
Pengenceran sampel -+-* -+-2 -+-4 Volume* yang digunakan Jumlah koloni CF /m!

J8olume suspensi yang dimasukan ke dalam &awan.

/a0 penghitungan jumlah hidup, la>imnya dilakukan dengan &ara memasukkan ?olume suspensi tertentu dalam &awan Petri. .empengan agar diinkubasikan, kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi. "ila kandungan mikroorganisme dalam sampel terlampau banyak, artinya berkisar dalam jumlah yang tinggi, maka sampel harus dien&erkan.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.+ #nalisis Metode MPN !Most Probable Number" "erbagai mikroba patogen seringkali ditularkan melalui air yang ter&emar sehingga dapat menimbulkan penyakit pada manusia maupun hewan. ikroba ini bisanya terdapat dalam saluran pen&ernaan dan men&emari air melalui tinja. 'elain itu air yang ter&emar dapat pula menyebabkan penyakit kulit dan mata, atau pun berbagai jenis penyakit-penyakit pada organ-organ tubuh yang lainnya. ikroba asal tinja ini yang sering menyebabkan penyakit yang ditularkan melalui air /%ater-bone disease0 men&akup &almonella t"pi, &higella spp, &almonella parat"phi, dan 'ibrio cholerae. 9isentri yang disebabkan oleh Camp"lobacter #e#uni dan Escherichia coli dapat pula ditularkan melalui air. "akteri, ?irus dan proto>oa dapat juga men&emari air melalui tinja sehingga menimbulkan penyakit. 8irus yang dapat men&emari air melalui tinja adalah ?irus hepatitis ) dan polio. %eragaman mikroba yang dapat menimbulkan penyakit ini menyebabkan para ahli men&ari indikator untuk menunjukkan adanya mikroba patogen sehingga dapat diketahui kualitas mikrobiologi atau sanitasi air. 'ehingga indikator banyak digunakan kelompok koli(orm, meskipun dapat digunakan indikator lainnya. )nalisis mikrobiologi yang lengkap ditulis di dalam K &tandard Methods for the E(amination of )ater and )aste%aterL /)meri&an Publi& <ealth )so&iation0. +.+.1 #nalisis %oli&or etode 'engan MPN

PN ini merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan

pertumbuhan koli(orm sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koli(orm dalam sampel yang sedang diujikan atau dianalisis. =umlah koli(orm ini bukan penghitungan yang tepat namun merupakan angka yang mendekati jumlah dalam keadaan yang sebenarnya. !ji ini diawali dengan memasukkan -+ m. &airan dari sampel ke dalam .auryl tryptose broth. !ji awal ini disebut uji duga /presumptive test0. 9alam uji duga, setiap tabung yang menghasilkan gas dalam masa inkubasi diduga mengandung bakteri koli(orm. !ji dinyatakan positi(, bila terlihat gas dalam tabung 9urham.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

%oli(orm mem(ermentasikan laktosa dengan pembentukan asam dan gas dalam waktu 41 jam pada suhu 25GC. kelompok koli(orm dipilahkan menjadi koli(orm asal tinja dan bukan-tinja /misalnya tanah0. %oli(orm asal tinja mampu menghasilkan gas di dalam kaldu 3.C dalam waktu *4 jam, pada suhu 44,5 GC. indikator ini dimaksudkan untuk menge&ek antara sanitasi dari suatu bahan yang umumnya adalah air yang digunakan sebagai sampel. Tabung yang memperlihatkan pembentukan gas diuji lebih lanjut dengan uji peneguhan dan bila diperlukan dilakukan uji koli(orm asal-tinja. !ji peneguhan dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman koli(orm dan bukan disebabkan oleh kerja sama beberapa spesies sehingga menghasilkan gas. !ji koli(orm asal-tinja dilakukan apabila ingin diketahui bahwa kuman koli(orm yang diperoleh termasuk koli(orm yang diperoleh termasuk koli(orm asal-tinja. !ntuk uji peneguhan digunakan *rilliant +reen *ile Lactose *roth /":".0 yang diinokulasikan dengan satu mata ose media, yang memperlihatkan hasil positi( pada uji duga. %aldu ":". diinkubasikan pada suhu 25GC selam 41 jam. !ntuk koli(orm asal-tinja, inokulasi dilakukan pada media E.coli yang diinkubasi pada suhu 44.5GC selam *4 jam. Pembentukkan gas di dalam tabung menunjukkan hasil yang positi(. edia dan suhu inkubasi menyuburkan kuman PN yang diseleksi, baik dalam uji peneguhan maupun uji koli(orm asal-tinja. !ji positi( ini menghasilkan angka indeks angka ini disesuaikan dengan tabel untuk menentukan jumlah koli(orm dalam sampel. )pabila diperlukan dapat dilakukan uji lengkap dengan menggunakan media yang menunjukkan hasil positi( pada uji peneguhan. Proses pengujian pada metode PN /Most Probable Number0 ini tidak lain hanyalah untuk menunjukkan adanya indikasi dan tanda-tanda dari suatu sampel apakah di dalamnya mengandung$memiliki mikroba yang dapat merugikan bagi pihak penggunanya. 9i samping !ji peneguhan, adapun !ji .engkap, !ji %oli(orm tinja, dan yang paling awal dilakukan adalah !ji Pendugaan. "eberapa uji ini digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan analisa koli(orm pada suatu sampel air, apakah ter&emar atau pun tidak oleh E.coli.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Cara penger#aan u#i lengkap terlihat pada gambar di ba%ah ini.

Gambar" Metode MP# Tahapan uji duga, uji peneguhan dan uji lengkap pada uji dari tabung yang menunjukkan hasil positi(. PN. #ndeks PN ditentukan

etode

PN /Most Probable Number0 untuk uji kualitas mikrobiologi air

dalam praktikum digunakan kelompok %oli(orm sebagai indikator. %elompok %oli(orm men&akup bakteri yang bersi(at aerobik dan anaeorobik (akultati(, batang gram negati( dan tidak membentuk spora. %oli(orm mem(ermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 41 jam pada suhu 25;C. 9alam metode PN digunakan medium &air, berbeda dengan metode &awan yang menggunakan medium padat /)gar0. Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positi(, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positi( dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.+.+ Praktikum MPN secara umum : , Pen7e!< n An lisis koli:o!$ 6en7 n $e#o6e MPN *ahan "ang diperlukan : 'ampel air minum yang akan diuji .auryl Tryptose "roth /*C0 "rilliant :reen "ile .a&tose "roth /".":0 3.&oli broth 3osin methylene "lue agar /3 :0 Nutrient agar /agar miring0 "iakan Escherichia coli Cara menger#akan : Hari pertama -. *. 2. emipet -+ m. sampel air dalam 5 tabung lauryl tryptose broth konsentrasi *C. elakukan proses inokulasi lauryl tryptose broth dengan biakan E,coli. "iakan ini merupakan &ontrol positi(. enginkubasi deretan tabung ini pada suhu 25GC selama 41 jamM

Hari kedua -. engamati tabung lauryl tryptose broth *C. media ini merupakan media penyubur bagi kelompok koli(orm. hasil yang positi(. *. enyediakan tabung kaldu ":". dan tabung E.coli. kaldu ":". menyuburkan koli(orm, sedangkan kaldu E.coli serta suhu inkubasi menyuburkan koli(orm asal-tinja. 2. enginokulasi kaldu ":". dan E.coli dengan - mata ose lauryl tryptose broth yang menunjukkan hasil positi(. %emudian menyediakan kontrol positi( dengan menginokulasikan kedua media tersebut dengan E.coli. enyimpan tabung yang menunjukkan

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

4. 5.

enginkubasi kaldu ":". yaitu pada suhu 25GC selama 41 jam. %emudian mengamati pembentukan gasM enginkubasi kaldu E.coli dalam penangas air tepatnya pada suhu 44.5GC selam *4 jam. emperhatikan pembentukan gas yang mun&ul.

Hari ketiga -. 9ari tabung ":". yang menunjukkan hasil positi(, gores lempengan agar 3 ". #nkubasi pada suhu 25GC selama *4 jam. *. embandingkan angka indeks yang diperoleh dari tabung ":". dengan tabel PN untuk koli(ormM

2. %emudian lakukan hal yang sama untuk tabung E.coli untuk koli(orm asal-tinja.
(o!$ # l &o! n &en7e!< n n lisis i! $e#o6e MPN $abung *4 jam !ji duga .auryl tryptose broth 41 jam *4 jam !ji peneguhan /":". broth0 41 jam *4 jam %oli(orm asal-tinja 3.&oli broth 41 jam % & ' ( )

Tuliskan hasil sebagai berikut : /N0 : pembentukan gas /td0: tidak diuji /-0 : tidak ada pembentukan gas

U<i Len7k & =umlah kolo(orm : )sal-tinja : PN$-++m. PN$-++m.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

#ndeks

PN metode 5 tabung
$abung yang MP#/%**m! $abung yang memperlihatkan gas 4-*-+ 4-*-4-2-+ 4-2-4-4-+ 5-+-+ 5-+-5-+-* 5---+ 5---5---* 5-*-+ 5-*-5-*-* 5-2-+ 5-2-5-2-* 5-2-2 5-4-+ 5-4-5-4-* 5-4-2 5-4-4 5-5-+ 5-5-5-5-* 5-5-2 5-5-4 5-5-5 MP#/%**m!

memperlihatkan gas +-+-+ +-+-+---+ +-*-+ --+-+ --+-----+ ------*-+ *-+-+ *-+-*---+ *---*-*-+ *-2-+ 2-+-+ 2-+-2---+ 2---2-*-+ 2-*-4-+-+ 4-+-4---+ 4---4---*

O* * * 4 * 4 4 5 5 5 7 7 , , -* 1 ---4 -4 -7 -2 -7 -7 **5

** *5 *7 22 24 *2 242 22 45 52 4, 7+ ,4 7, --+ -4+ -1+ -2+ -7+ **+ *1+ 25+ *4+ 25+ 54+ ,*+ -.5++ P *.4++

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.+.3 Pengu(ian Es)heri)hia )oli* E. coli merupakan bakteri gram negati(, berbentuk batang, uji indole positi( dan mampu mem(ermentasi berbagai karbohidrat seperti glukosa, laktosa, manitol dan arabinosa. Media +osin Methylene ,lue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan ber(ungsi untuk memilah mikroba yang mem(ermentasi laktosa seperti E. coli dengan mikroba yang tidak mem(ermentasikan laktosa seperti &. aureus- P. aeruginosa dan &almonella. ikroba yang mem(ermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam, sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. )danya eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian jika media ini digunakan pada tahap awal, karena kuman lain juga tumbuh terutama P. aeruginosa dan &almonella sp dapat menimbulkan keraguan. "agaimanapun media ini sangat baik untuk mengkon(irmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Media MacConkey -gar mempunyai keistimewaan memilah bakteri enterik gram negati( yang mem(ermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa, cr"stal violet dan neutral red bile salt. %emampuan E. coli mem(ermentasi laktosa menyebabkan penurunan p<, sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile$ empedu diendapkan. %oloni lain .&. aureus- P. aeruginosa dan &almonella/, bila tumbuh tidak akan berwarna karena tidak mampu mem(ermentasi laktosa. Aerobacter- Enterococcus. Media MacConkey ,roth, walaupun tidak ter&antum di 6#-#8, sebenarnya media ini berman(aat sekali dalam memilah E. coli dari mikroba lain terutama &. aureus, P. aeruginosa dan &almonella. )danya ACgall dalam media berperanan dalam menghambat bakteri gram positip lain seperti &. aureus. %andungan laktosa sangat penting untuk memilah E. coli dari mikroba lain yang tidak mem(ermentasi laktosa, terutama P. aeruginosa dan &almonella. 6ermentasi laktosa oleh E. coli menyebabkan p< turun. %ondisi asam akan menyebabkan bromo cresol purple /media berwarna ungu0 berubah menjadi kuning /media berwarna kuning0 dan ikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter- Proteus- &almonella- &higella,

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

adanya pembentukan gas yang dapat diamati pada tabung durham. 'edangkan &almonella dan P. aeruginosa tidak dapat mengubah warna media karena tidak mem(ermentasi laktosa, sedangkan mikroba lain yang mampu mem(ermetasi laktosa dan mempunyai ekspresi pada media seperti E. coli adalah Enterobacter aerogenes. )dapun &ara memilah E. aerogenes antara lain dengan reaksi indole. E. coli mempunyai reaksi positi(, sedang E. aerogenes bereaksi negati(. 9engan si(at tersebut media ini sangat baik untuk memilah E. coli dari mikroba lain pada tahap awal terutama P. aeroginosa- &. aureus dan &almonella.

/Gambar" "akteri 3s&heri&hia &oli sebagai penyebab kontaminasi utama dalam air minum0

Escherichia coli merupakan bakteri yang memiliki bentuk batang lurus, -,- @ -,5 Em C *,+ @ 5,+ Em, motil dengan (lagelum peritrikus atau nonmotil. erupakan kelompok bakteri :ram negati(. 9apat tumbuh dengan mudah pada medium nutrient sederhana. 9engan laktosa yang di(ermentasikan oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas. %andungan :NC 9N) adalah 5+ sampai dengan 5- mol Q. Escherichia coli merupakan penghuni normal saluran pen&ernaan manusia dan hewan berdarah panas. "iasanya tidak patogenik. )nggota lain kelompok koli(orm ialah 0lebsiella pneumoniae, yang tersebar luas di alamI terdapat dalam tanah, air dan padi-padian, dan juga dalam saluran pen&ernaan manusia dan hewan. 9alam melakukan analisa untuk uji dari suatu &emaran yang dilakukan dapat digunakan beberapa spesies atau kelompok bakteri telah die?aluasi untuk menentukan sesuai tidaknya untuk organisme indikator. 9i antara organismeorganisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu organisme indikator yang ideal adalah Escherichia coli dan kelompok bakteri &oli lainnya yang dianggap sebagai indikator polusi tinja.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.+.2 #nalisis %ualitas dan +anitasi #ir #stilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan. "akteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah ter&emar oleh kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman dikonsumsi. "akteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang la>im terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri patogen lain yang berbahaya. )da tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli, kelompok &treptococcus .Enterococcus/ fecal, dan Clostridium perfringens. Pengadaan air bersih untuk kepentingan rumah tangga diantaranya adalah untuk air minum, air mandi, dan keperluan sehari-hari. %eadaan air ini haruslah memenuhi peryaratan yang sudah ditentukan sesuai dengan peraturan internasional dari F<A dan )P<) ataupun peraturan nasional setempat. 9alam hal ini kualitas air bersih di #ndonesia harus memenuhi persyaratan yang tertuang di dalam peraturan enteri %esehatan R# No. -72$ en. %es$Per$8###$77 dimana setiap komponen yang diperkenankan berada di dalamnya harus sesuai. %ualitas )ir "erdasarkan Nilai #P" /#ndeks Pen&emar "iologis0
Nil i IPB +@1 , @ *+ *- @ 5+ 5+ @ -++ K li# s i! "ersih, jernih Ter&emar ringan Ter&emar sedang Ter&emar berat

Perhitungan mikroba untuk keperluan nilai #P" harus dilakukan se&ara langsung, misalnya dengan menggunakan ruang penghitung /&ounting &hamber0, jadi tidak melalui &ara yang tidak langsung. Pemeriksaaan air se&ara mikrobiologis untuk coli dilakukan tiga tahap pengerjaan yaitu Tes presumti( /tes perkiraan0, Tes kon(irmati( /tes penentuan0, Tes lengkap.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

=ika dikaji lebih lanjut, suatu badan air, disini misalnya kolam ikan, dimasuki buangan organik, misalnya yang berasal dari manusia dan kegiatan di dalam rumahnya akan menyebabkan terjadinya gejolak kehidupan berbentuk siklus yang dinamakan &iklus *iologis dinamis Saitu : -0 anusia menghasilkan buangan berbebtuk urin, tinja, dan sampah ke dalam perairan /kolam ikan misalnya0. *0 Aleh bakteri buangan tersebut akan diuraikan menjadi ion-ion tertentu yang sesuai dengan benda asalnya. 20 <asil uraian akan digunakan oleh bakteri itu sendiri dan mikroalge untuk pertumbuhan biomassa-sel, juga akan merupakan sumber nutrient untuk tanaman air /misalnya kangkung, e&eng, genjer, dsb0. 40 )kibat dari adanya biomassa-mikroalge, proses (otosintesis akan terjadi dengan menghasilkan oksigen yang dibutuhkan oleh bakteri menguraikan$ mengoksidasikan buangan. 50 =uga biomassa-mikroalge merupakan makanan utama dari Tooplankton, >ooplankton merupakan sumber utama makanan ikan$hewan ke&il, serta ikan$hewan air ke&il merupakan sumber utama makanan ikan besar, serta akhirnya ikan merupakan suber protein, lemak, dan karbohidrat bagi manusia. 50 =uga tanaman air, akhirnya akan merupakan sumber karbohidrat, lemak, ?itamin dan protein bagi manusia. 'e&ara umum pengukuran coli hanya dilakukan sampai Tes Presumti( /perkiraan0 saja, yang hasilnya di&o&okan dengan table =PT analisa dari badan statistik. "erdasarkan kepada hasil tes perkiraan, maka jumlah bakteri Coli sudah dapat ditentukan berdasarkan tabel tadi /=umlah Perkiraan Terdekat0 atau dengan PN / ost Probable Number0 per -++ m..

9engan adanya siklus biologis ini kita dapat memperkirakan berbagai kemungkinan yang dapat dilakukan se&ara lengkap.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

/G $5 !. 'iklus "iologis-dinamis di dalam perairan0

Mikroorganisme sebagai indikator kualitas air Pada pemeriksaan mikrobiologis yang rutin terhadap air untuk menentukan aman tidaknya untuk diminum, tidaklah &ukup jika mendasarkan uji-uji yang digunakan hanya terdapat adanya /terisolasinya0 mikroorganisme patogenik karena alasan sebagai berikut : -0 %emungkinan besar patogen masuk ke dalam air se&ara sporadis. *0 "ila terdapat dalam jumlah amat sedikit, maka si(at patogen tidak terdeteksi. 20 <ail pemeriksaan laboratorium dapat dikethaui setelah *4 jam atau lebih. Ciri mikroorganisme indikator -0 Terdapat di alam ter&emar. *0 Terdapat dalam air bila ada patogen. 20 =umlah mikroorganisme indikator berkolerasi dengan kadar polusi 40 50 emiliki kemampuan bertahan hidup lebih besar dari yang patogen. empunyai si(at seragam dan mantap

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.3 UJI BONTERE= UJI UNTUK IDENTIFIKASI MIKROBA ikroorganisme tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai bahan yang terdapat di berbagai lingkungan, baik lingkungan yang lembab, basah, maupun lingkungan yang kering, sehingga mikroorganisme ini dapat hidup di berbagai jenis lingkungan, tetapi tentu saja tergantung dari jenis mikroorganisme tersebut. Tat hara yang terdapat di lingkungan sekelilingnya ini terdiri dari molekul-molekul sederhana seperti <*' dan N<4N, atau terdapat senyawa atau molekul-molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida. ikroba mengoksidasikan >at hara ini untuk memperoleh energi dan senyawa pemula untuk sintesis dinding sel, membran dan (lagela. Penggunaan >at hara ini tergantung dari akti?itas metabolisme mikroba. etabokisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identi(ikasi suatu mikroorganisme. Pembahasan dari suatu analisis ini dimaksudkan untuk mengetahui berbagai ma&am identi(ikasi yang dilakukan untuk mengetahui jenisnya ini. <al ini men&akup berbagai uji untuk mengetahui akti?itas mikroorganisme. Pengamatan akti?itas metabolisme metabolisme suatu ini diketahui dari

kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti >at pati, lemak, protein dan asam nukleat. 'elain itu pengamatan ini juga dilakukan pada molekul-molekul yang sederhana seperti asam amino dan sakarida. <asil dari berbagai uji ini digunakan untuk pen&irian dan identi(ikasi suatu mikroorganisme. "erbgai ma&am identi(ikasi yang dilakukan baik itu se&ara langsung terhadap bakterinya maupun dalam keadaan tidak langsung, akan memeberikan hasil yang berbeda tentunya. 9ari berbagai uji-uji identi(ikasi tersebut akan dapat memudahkan keter&apaian suatu analisa dengan mengetengahkan tentang pentingnya, bahkan kerugian yang ditimbulkan oleh suatu mikroorganisme ini. Pada dasarnya kita tentu tahu bahwa mikroba ada yang bersi(at patogen dan ada yang tidak, sehingga kita harus mampu untuk mengenali dan memilih mana saja bakteri yang diidenti(ikasikan patogen.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

+.3.1 ,ERMENT#+I %#RBO-I'R#T %emampuan mem(ermentasikan berbagai karbohidrat dan produk (ermentasi yang dihasilkan merupakan &iri yang sangat berguna dalam identi(ikasi dari suatu mikroorganisme. <asil akhir (ermentasi karbohidrat ditentukan oleh si(at mikroba, media biakan yang digunakan, serta (aktor lingkungan, antara lain suhu dan p<. (ermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan edia dan

di(ermentasikan oleh mikroorganisme. :lukosa termasuk senyawa yang paling sering dan penting untuk digunakan oleh mikroorganisme dalam proses (ermentasi. !ntuk menentukan adanya (ermentasi, di laboratorium digunakan media kaldu karbohidrat dan media R-8P. Pembentukan asam dapat diketahui dengan menanamkan indikator ke dalam suatu media. %aldu karbohidrat digunakan untuk uji pembentukan asam dan gas. Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung &mith atau tabung !urham. Tabung 'mith digunakan bila jumlah dan ma&am gas yang dihasilkan harus ditentukan. 'edangkan tabung 9urham ini digunakan bila tidak diketahui ma&am dan jumlah gas yang dihasilkan. "ila terbentuk gas, maka gas masuk ke dalam tabung 9urham dan mendesak &airan dalam tabung iniI gas ini terlihat sebagai gelembung udara yang terperangkap dalam tabung 9urham. %aldu karbohidrat ini mengandung +,5 @ - Q karbohidrat. %arbohidrat yang sering dipakai adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa. 'elain karbohidrat ke dalam media ditambahkan juga bee( eCtra&t dan peptone sebagai sumber nitrogen, ?itamin dan mineral. !ntuk mengetahui pembentukan asam, ke dalam media ditambahkan indikator. "ila dalam proses (ermentasi, bakteri atau mikroba ditumbuhkan dalam biakan dalam &air yang mengandung glukosa, maka hasil proses (ermentasi dapat berupa asam. )sam yang dihasilkan akan menurunkan p< media biakan yang telah dibuat. #ndikator yang sering digunakan adalah merah fenol dan bromcresol purple. "ila dalam media biakan ditambahkan indikator p< seperti misalnya brom-&resol-purple atau merah (enol, maka

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning. Pada p< U 7.+, merah (enol berwarna merah sedangkan bromo&resol purple berwarna ungu.

Gambar" Re ksi (e!$en# si K !5ohi6! # /a0 Tabung &ontrol, /b0 6ermentasi )sam laktat, /&0 6ermentasi asam &ampuran, /d0 6ermentasi alkohol

Pada pengamatan di atas kita dapat mengetahui hal yang paling mendasar dari reaksi (ermentasi kabohidrat di dalam tabung 9urham. Perbandingan yang diperoleh antara salah satu tabung yang di&ampur atau diisi dengan asam akan menyebabkan berawarna kuning, sehingga akan terlihat reaksi (ermentasi karbohidrat se&ara jelas di pandangan dalam membedakan dari warna. Proses selan.utnya : 'etelah diperoleh koloni-koloni dalam keadaan terpisah dalam lempeng pembiakan, maka tindakan selanjutnya ialah mengadakan pemeriksaan si(at-si(at biokimia yang penting untuk menunjang diagnosis yang ingin ditegakkan. 'elain itu isolasi dalam keadaan murni pada koloni itu digunakan untuk mengetahui reaksi (ermentasi terhadap jenis-jenis gula yang termasuk golongan monosakarida, disakarida, dan polisakarida. Caranya adalah sebagai berikut.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

-0 =enis-jenis gula tersebut dimasukkan ke dalam medium pembiakan &air atau padat. edium yang dipakai tergantung pada kebutuhan hidup tiap jenis organisme yang diteliti. *0 !ntuk mengetahui ada tidaknya (ermentasi terhadap gula tersebut, maka ke dalam medium tersebut ditambahkan indikator yang dapat menunjukkan perubahan p< ke arah asam atau basa. 20 =enis-jenis gula yang dipakai ditetapkan dalam satu deret /dinamakan deret aneka gula0, dan letaknya dalam deret pada tiap kali pemeriksaan tidak berubah, sehingga hasil dari tiap deret dapat dinyatakan dalam satu (ormula tetap untuk tiap jenis organisme untuk laboratorium itu. isalnya bila suatu laboratorium menggunakan deret aneka gula dengan urutan glukosa, laktosa, maltosa, dan sakarosa, maka bila deret ini ditanam dengan &almonella t"phi, hasil yang diperoleh dalam bentuk (ormula adalah /N @ N @0 yang berarti bahwa (ermentasi terjadi pada tabung-tabung glukosa dan maltosa, sedang laktosa dan sakarosa tidak di(ermentasi. 40 %e dalam tabung-tabung /dalam medium &air0 dimasukkan pula tabung ke&il yang letaknya terbalik /tabung 9urham0 untuk mengetahui apakah dalam proses (ermentasi itu terbentuk gas atau tidak. "ila gas terbentuk, sebagian gas itu akan berkumpul dalam tabung 9urham, sehingga tampak rongga kosong. "ila hal ini terjadi pada medium padat dalam tabung, mengakibatkan medium retak atau terdorong ke atas.

G $5 ! 12.1 'truktur antigenik &almonella t"phi.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

50 Cara menanam organisme ke dalam medium gula ini dilakukan sekaligus untuk satu deret. 9engan menggunakan jarum sebagian koloni diambil dan disentuhkan se&ara beruntun ke dalam medium gula tersebut. 50 Pengeraman dilakukan dalam suhu yang sesuai, untuk bakteri patogen umumnya pada suhu 27oC. 70 Reaksi positi( diperlihatkan oleh perubahan indikator, yang dinyatakan dengan tanda N /positi(0 dan bila indikator tidak berubah berarti tidak terjadi (ermentasi, yang dinyatakan dengan tanda @ /negati(0.

Perlu diperhatikan dalam hal penggunaan indikator, bahwa pemilihannya harus disesuaikan dengan keadaan p< medium pembiakan yang berubah akibat (ermentasi. "ila (ermentasi mengakibatkan terbentuknya asam, p< medium akan lebih rendah dari p< semula, dan penurunan ini tergantung pada jumlah asam yang terbentuk dan jenis bakteri yang mengadakan (ermentasi. "ila Ph turun sampai 5,+ dan indikator yang dipakai merah (enol /phenol red0, akan tampak bahwa medium yang tadinya merah berubah menjadi kuning. Tetapi bila dipakai indikator merah metil /methyl red0, maka pada p< 5,+ indikator ini belum memperlihatkan perubahan yang nyata. "aru pada p< yang jauh lebih asam, merah metil tampak merah, sehingga bagi bakteri yang tidak membentuk asam sebanyak ini, hasilnya dapat diba&a negati(, walaupun ada (ermentasi. %arena jenis gula dalam reaksi (ermentasi ini banyak, maka untuk menghindarkan kekeliruan tiap jenis gula diberi sandi warna, biasanya pada tutup tabung, misalnya kuning untuk glukosa, ungu untuk laktosa, merah untuk maltosa, dan biru untuk sakarosa. 'elain reaksi deret aneka gula, masih dilakukan reaksi-reaksi biokimia lainnya, baik untuk keperluan khusus atau untuk keperluan di(erensiasi. !ntuk bakteri golongan koli(orm ditambahkan suatu deret khusus untuk di(erensiasi, yaitu deret # 8iC. 'ingkatan ini berasal dari huru( 1 dari indol, M dari metilmerah, 'i dari 'oges @ Prauskauer dan C dari KcitrateL /sitrat0. golongan koli(orm, yang penting artinya dalam pemeriksaan air. aksud dari pemeriksaan ini adalah untuk mengadakan di(erensiasi jenis-jenis bakteri dari

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

-. U(i &er entasi karbohidrat


*ahan "ang diperlukan :

"iakan : Escherichia Coli &taph"lococcus aureus Micrococcus luteus &accharom"ces cerevisiae edia : %aldu karbohidrat, :lukosal, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang mengandung indikator "CP /brom-&resol-purple0. 'elain "CP dapat digunakan PR /phenol-red0 sebagai indikator p< yang digunakan.
; ! $en7e!< k n :

-ari perta a -. enandai tabung kaldu karbohidrat dengan : =enis karbohidrat, nama pembuat, biakan yang diinokulasikan, biakan yang digunakan untuk deret karbohidrat pertama adalah E.Coli, deret kedua aureus, ketiga M.Luteus. deret ke kempat &.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol *. enginokulasikan deret karbohidrat pertama dengan E,coli, deret kedua dengan &.aureus, deret ketiga dengan M.luteus dan deret keempat dengan &.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol. 9an melakukan inkulasi dengan proses yang hati-hati sehingga tidak menimbulkan gelembunggelembung gas dalam tabung 9urham. 2. enginkubasikan kelima deret tabung di dalam in&ubator 25GC selam *4 jam. -ari kedua -. emeriksakan adanya (ermentasi karbohidrat dengan melihat pembentukan asam dan pembentukan gas. Pembentukan asam terlihat sebagai perubahan warna kaldu karbohidrat menjadi kuning. Pembentukan gas terlihat di dalam tabung 9urham. emperhatikan bahwa di dalam

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

tabung kontrol tidak terjadi pembentukan gas. Pembentukan gas di dalam tabung kontrol dapat terjadi bila sewaktu diinokulasi tabung yang berisi kaldu diko&ok terlalu keras atau bila digunakan kaldu yang disimpan di dalam lemari es. %emudian daya larut oksigen berkurang di dalam kaldu yang dingin, namun sewaktu diinkubasikan pada suhu 27GC Aksigen dapat terperangkap di dalam tabung 9urham. *. elaporkan hasil reaksi di dalam tabung yang berisi kaldu karbohidrat.

Contoh :o!$ # l &o! n untuk uji 6ermentasi karbohidrat


0rganisme E.coli &.aureus M.luteus &.cerevisia e Glukosa /arbohidrat !aktosa 1ukrosa Maltosa Manitol

"eri tanda hasil reaksi sebagai berikut : ) " " : Pembentukan asam : Pembentukan gas : Pembentukan baa : Tidak ada pertumbuhan

): : Pembentukan asam dan gas

9alam kaitannya dengan karbohidrat, ada beberapa &ara uji yang dapat dilakukan se&ara kualitati( untuk mengetahui karbohidrat untuk di(ermentasikan. -0 !ji 6ehling, "ar(oed, "enedi&t /ada tidaknya monosakarida0. *0 !ji )ntron /penentuan adanya gula dalam darah0. 20 !ji ollis&h /karbohidrat se&ara umum0. 40 !ji 'elliwano( /penentuan fruktosa dalam sampel0. 50 !ji Tauber /ada tidaknya pentosa dalam sampel0. 50 !ji #odin /ada tidaknya glikogen atau Eritrodekstrin0. 70 6enil-<idra>in /untuk menentukan gugus karbonil lepas0. +.3.+ U(i IM.IC

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

"anyak

dilakukan

untuk

membedakan

Enterobacter

aerogenes

dan

Esherichia coli dilakukan uji # 8#C yang terdiri dalri proses uji-uji : !ji #ndol !ji ethyl Red

!ji 8oges Proskauer !ji Citrat %edua mikroorganisme tersebut akan memberikan hasil sebagai berikut :
E.coli A.aerogenes I N M N >i N ; N

-. Pe eriksaan Indol dan U(i Indol Pemeriksaan #ndol merupakan uji identi(ikasi yang didasarkan pada penggunaan asam amino, baik sebagai media maupun sampel, atau standar. )sam amino adalah molekul organik yang mengandung kelompok asam /CAA<0, amino /N<*0, dan R. :ugus R merupakan &iri khusus dan membedakan asam amino yang satu dengan yang lainnya. iroorganisme menggunakan asam amino sebagai pembuka protein, komponen sel dan kadangkala sebagai sumber energi. )sam amino ini dimodi(ikasi dengan berbagai &ara sewaktu metabolisme. 9alam praktikum ini diperlihatkan berbagai &ara mikroorhanisme memodi(ikasikan suatu asam amino. odi(ikasi asam amino dapat digunakan untuk pen&irian, karena produk yang dihasilkan akibat modi(ikasi asam amino dapat digunakan dalam identi(ikasi mikroorganisme. )sam amino tripto(an merupakan komponen asam amino yang la>im terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. "akteri tertentu seperti misalnya Escherichia coli mampu menggunakan tripto(an sebagai sumber karbon. E.coli menghasilkan en>im tripto(anase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari tripto(an. 9alam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul tripto(an /asam piru?at dan N<4N0 dapat digunakan untuk memnuhi kebutuhan >at hara mikroorganisme. ..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Gambar. &truktur kimia%i asam amino

Pembentukkan indol dari tripto(an oleh mikroorganisme dapat diketahui dengan menumbuhkannya di dalam media biakan yang kaya dengan tripto(an. Tripto(an biasanya diberikan dalam bentuk triptom suatu polipeptida yang kaya dengan residu tripto(an. Penumpukan indol dalam suatu media biakan dapat diketahui dengan penambahan berbagai reagens. Reagens bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium. )dapun proses hidrolisis tripto(an dan uji indol, pada uji ini digunakan media semi-padat yang kaya akan tripto(an. !ntuk melihat adanya indol dapat digunakan beberapa reagens yaitu 0ovacs, +ore, Ehrlich, dan Ehrlich-*ohme. 'emua reagens tersebut mengandung para-dimetil-aminoben>aldehida. 9alam praktikum digunakan reagens 3hrli&h-"ohme yang terdiri reagens ) dan ". edia untuk melihat pembentukan indol yang digunakan di laboratorium ini bersi(at semi-padat, oleh karena itu dapat digunakan juga untuk melihat pergerakan bakteri. =ika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media. menusukkan jarum ke dalam media semi-padat edia indol diinokulasikan dengan

G $5 !. Cara menginolusikan biakan semi-padat

Pemeriksaan

dimaksudkan

untuk

mengetahui

apakah

dalam

proses

pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari tripto(an. )danya

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

pembentukan indol dapat diketahui dengan reagens 3hrli&h atau %o?a&s, yang mengakibatkan medium berwarna merah. Cara pengerjaannya adalah sebagai berikut. -. edium pembiakan &air yang telah ditanam dieramkan selama *4 sampai 41 jam. *. Reagens 3hrli&h yang disediakan terdiri dari: a. Para-dimetil-amino-ben2aldehida D , g b. Etil-alkohol D -,+ ml &. Asam klorida /pekat0 D 4+ ml 2. %e dalam biakan ditambahkan - ml eter atau silol, diko&ok, sehingga tersebar rata di seluruh &airan, kemudian didiamkan sampai semua eter atau silol berkumpul di permukaan. 4. Reagens diteteskan perlahan-lahan melalui dinding tabung sebanyak kirakira +,5 ml. "ila indol positi( maka tampak &in&in merah terbentuk di batas &airan medium dan eter atau silol. #ndol dibentuk dari asam tripto(an sebagai hasil akti?itas hidrolisis beberapa spesies bakteri. 9alam hal ini yang perlu diperhatikan dalam medium pembiakan hanya digunakan pepton yang mengandung asam amino. #ndol adalah >at yang dapat menguapkan dan dapat diperiksa adanya dengan penambahan pdimetilaminoben>aldehida, atau dengan sepotong kertas yang diimpregnasi dengan asam oksalat, kemudian diselipkan antara mulut tabung dan tutup kapas. Penggunaan eter atau silol dimaksudkan untuk mengekstraksi indol dari medium, karena indol dapat larut dalam eter atau silol, sehingga bila jumlah indol sedikit dapat dikumpulkan ke permukaan medium dan bereaksi dengan reagens di permukaan medium berupa &in&in merah. !ji indol ini dilakukan pada dasarnya adalah dengan menginokulasikan biakan yang akan diujikan untuk melakukan teknik analisis mengidenti(ikasikan suatu mikroba. *. UJI METH=L RED

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Pada kaldu gula yang berisi tabung 9urham, dapat diketahui kemampuan mikroorganisme untuk mem(ermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi (ermentasi tidak diketahui. 9alam praktikum digunakan media mengetahui (ermentasi asam &ampuran atau (ermentasi butana-diol. !ji ethyl red digunakan untuk menentukan adanya (ermentasi asam &ampuran. "eberapa bakteri mem(ermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersi(at asam sehingga akan menurunkan p< media pertumbuhannya menjadi 5.+ atau lebih rendah. Penambahan indikator p< K ethyl redL dapat menunjukkan adanya perubahan p< menjadi asam. lingkungan dengan p< 5.*. ethyl red berwarna merah pada lingkungan dengan p< 4.4 dan berwarna kuning dalam R @ 8P untuk

GAMBAR. 0eterikatan antara pembentukan asam dan %aktu inkubasi se%aktu proses fermentasi campuran mikroorgansime menghasilkan berbagai asam, sehingga menurunkan p medium men#asi 3.4 atau men#adi lebih rendah.

6ermentasi asam &ampuran ditentukan dengan &ara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. )pabila terjadi (ermentasi asam &ampuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagens methyl red. !ji ini sangat berguna dalam identi(ikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pen&ernaan.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Pengujian dengan metil merah dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat membentuk asam sedemikian banyaknya sehingga dapat mengubah indikator metil merah menjadi merah. "eberapa jenis bakteri dapat membentuk asam tetapi tidak &ukup banyak untuk dapat mengubah indikator dan penurunan p< sampai 5,+, pada umumnya sudah menghambat kelanjutan hidup mikroorganisme. 'edang bakteri seperti Escherichia coli dapat memberikan hasil pengujian positi( karena dapat menurunkan hasil pengujian positi( dan dapat menurunkan p< sampai di bawah 4,5. 'ebaliknya 0lebsiella aerogenes mengadakan dekarboksilasi dan kondensasi asam piru?at untuk membentuk asetilmetilkarbinol, sehingga p< meningkat, dan bila ditambahkan metil merah warnanya menjadi kuning, yang berarti hasil pengujian negati(. Pengujian seharusnya jangan dilakukan sebelum biakan berumur dua hari pada suhu 27GC atau tiga hari pada suhu 2+GC. Reaksi ini tidak dapat diper&epat dengan meningkatkan kadar glukosa dalam medium.

Gambar Bakteri Escherichia coli.

Pada dasarnya pengerjaan praktikum !ji

ethyl Red ini digunakan untuk

mengetahui perbedaan dan menggolongkan, serta memisahkan dua bakteri yang tergolong mikroba yang patogen, yakni antara Escherichia coli dan bakteri patogen Enterobacter aerogenes. 9engan menggunakan reagens methyl red yang dapat mengidenti(ikasikan kedua bakteri tersebut untuk dapat digunakan dalam tahapan proses pengerjaan analisa selanjutnya, terutama dalam hal identi(ikasi mikroba patogen dari suatu bahan atau sampel.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Proses pengerjan Uji Met !l"re# *ahan "ang diperlukan : "iakan Escherichia coli "iakan Enterobacter aerogenes %aldu Reagens R @ 8P / ethyl Red @ 8oges Proskauer0 ethyl Red

Cara menger#akan : Hari pertama -. *. 2. enandai tabung kaldu enginokulasi kaldu R @ 8P dengan biakan bakteri yang digunakan. R @ 8P dengan biakan bakteri.

enginkubasikan dalam suhu 25GC selam 5 C *4 jam.

Hari kedua -. *. enambahkan 5 tetes reagens methyl red ke dalam tabung elaporkan hasilnya. !ji bersi(at positi( apabila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagens methyl red. !ji bersi(at negati( apabila kaldu jingga setelah penambahan reagens.
(o!$ # L &o! n U<i Me#h9l"Re6
Mikroorganisme Esherichia coli Enterobacter aerogenes Perubahan warna setelah penambahan reagens

R @ 8P.

R @ 8P berubah menjadi kuning atau

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

3. U(i .oges/Proskauer !ji ini digunakan dan dilakukan untuk mengidenti(ikasi mikroorganisme yang melaksanakan (ermentasi *.2-butanadiol. "ila bakteri mem(ermentasikan karbohidrat menjadi *.2 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 4+Q %A< dan 5Q larutan alpha-naphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin /asetilmetilkarbinol0, suatu senyawa pemuka dalam sintesis *.2-butanadiol. Pada penambahan %A<, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna biakan lebih jelas terlihat pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian *.2-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. "erdasarkan hal ini tabung yang berisi tabung diko&ok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja kerja. !ji 8orges-Proskauer ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mngetahui adanya *.2-butanadiol dan selalu didapatkan se&ara serentak, sehingga uji 8P absah untuk menentukan adanya *.2-butanadiol. Cara melakukan pengujian ini adalah sebagai berikut. -. Reagens-reagens yang diperlukan terdiri dari: a. larutan al(a-na(tol 5Q dalam alkohol absolut, b. larutan %A< 4+Q yang mengandung 2Q kreatin. *. 9engan pipet - ml biakan umur *4 jam dimasukkan ke dalam tabung Fasserman. 2. %e dalam tabung ini ditambahkan +,5 ml larutan al(a-na(tol. 4. 'elanjutnya ditambahkan +,* ml larutan %A<-kreatin. 5. 'etelah diko&ok &ampuran itu didiamkan selama -+@2+ menit. "ila di dalam biakan itu terbentuk asetilmetilkarbinol, akan timbul warna merah pada permukaan medium, dan warna ini akan meluas sampai ke seluruh &ampuran.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Penanaman dalam medium pembiakan sitrat /'immons Citrate

edium0

dimaksudkan untuk mengetahui apakah senyawa sitrat dapat dipakai sebagai satusatunya sumber karbon bagi organisme. 9alam medium ini digunakan natriumsitrat sebagai sumber karbon. "ila natriumsitrat ini dapat diuraikan maka amonium hidrogen(os(at turut teruraikan dan akan melepaskan N<2 sehingga menyebabkan medium menjadi alkalis, dan indikator bromtimolbiru berubah dari hijau menjadi biru. Penanaman dilakukan dengan jarumI penanaman berlebihan dapat menghasilkan positi( palsu. Proses Pengerjaan Uji $oges"Proskauer Cara menger#akani : Hari pertama -. *. 2. enandai kaldu R @ 8P dengan biakan bakteri yang digunakan. R @ 8P dengan biakan bakteri. enginokulasi kaldu

enginkubasikan dalam 25GC selama *4 @ 41 jam.

Hari kedua -. enambahkan -+ tetes larutan 4+Q %A< dan -5 tetes larutan alphanaphtol dalam kaldu R @ 8P. %emudian mengo&ok tabung sehingga dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi *.2-butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. <asil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 2+ menit. *. elaporkan hasil pengujian yang telah dilakukan. !ji ini bersi(at positi( apabila kaldu berwarna merah dalam waktu 2+ menit setelah penambahan reagens. !ji yang bersi(at negati( ini apabila kaldu R @ 8P tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens.
(o!$ # l &o! n U<i >o!7es"P!osk ue! Mikroorganisme 3sheri&hia &oli 3nteroba&ter aerogenes Perubahan warna setelah penambahan reagens

.i Pembentukan 0ksidase

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

Pengujian ini dikorelasikan dengan adanya sitokrom dalam kadar yang tinggi, yang dapat dipakai untuk mengenal bakteri tertentu yang termasuk dalam genus Pseudomonas dan Neisseria. Aksidasi dari p-aminodimetilanilina menjadi warna merah tua sampai hitam, dapat dipakai sebagai ukuran akti?itas sitokrom. Cara pengujiannya adalah sebagai berikut. a. "iakan ditanam pada lempeng agar bulyon. b. Pengeraman dilakukan pada suhu2+oC sampai timbul pertumbuhan. &. Permukaan lempeng pembiakan itu disiram dengan paminodimetilanilina. "ila koloni-koloni segera menjadi berwarna merah tua, menunjukkan bahwa organisme itu diduga mengandung sitokrom-C. 9alam hal ini perlu diperhatikan bahwa semua koloni dapat menjadi merah tua dengan reagens oksidase, bila dibiarkan berada dalam &ahaya. %arena itu pengujian harus segera diperiksa setelah reagens diberikan. Cara lain untuk menguji oksidase, adalah menggunakan potongan ke&il kertas saring yang di&elupkan ke dalam satu persen tetrametil-p(enilendiamin dihidroklorida /atau kosalat0. %ertas saring yang berwarna biru tidak boleh dipakai. 9engan ose platina yang bersih dikerok sedikit biakan muda, dan digosokkan di atas kertas saring. Tes oksidase positi( menghasilkan warna biru dalam waktu -+ detik. Ase yang kotor menghasilkan positi( palsu dan biakan tua tidak dapat diper&aya untuk pengujian ini. %arena telurit menghambat oksidase. Pada dasarnya uji ini ber(ungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang ditemukan pada mikroorganisme tertentu. !ji ini berguna dalam identi(ikasi mikroorganisme patogen seperti misalnya Neisseria gonorhoea dan Pseudomonas aerogenusa. %edua bakteri ini memberikan hasil positi( dalam uji oksidase. 9i dalammya terdapat perubahan warna yang disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan oksidase larutan reagens. Reagens yang dioksidasikan berwarna hitam,namun jika ada reduksi tidak terjadi perubahan warna.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

.i /atalase %atalase adalah en>im yang mengkatalisasikan penguraian < *A* /<idrogen

Peroksida0 menjadi air dan A* /Aksigen0. <idrogen Peroksida bersi(at toksik terhadap sel karena bahan ini menginakti?asikan en>im dalam sel. <idrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut. %atalase adalah salah satu en>im yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan <idrogen peroksida, en>im lainya yang dapat menguraikan <idrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroskidase oleh peroksidase tidak dihasilkan oksigen. !ji katalse berguna dalam identi(ikasi kelompok bakteri$mikroba tertentu. Pada bakteri berbentuk kokus, uji katalase digunakan untuk membedakan &taph"lococcus dan &treptococcus. %elompok &treptococcus ini bersi(at katalasenegati( sedangkan &taph"lococcus ini bersi(at katalase-positi(. Penentuan adanya katalase diuji dengan larutan 2Q <*A* pada koloni terpisah. Pada bakteri yang bersi(at katalase-positi( terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni.

2. UJI CITR#T !ji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. !ntuk uji ini dapat digunakan medium sitrat @ koser berupa medium &air atau medium sitrat @ 'immon berupa medium padat. 'immonVs sitrate agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya umber karbon, N<4N sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indikator p<, sedangkan medium sitrat @ %oser tidak mengandung indikator. )pabila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan p< dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan dari warna hijau menjadi biru ini menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. 'edangkan pada

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

medium sitrat @ %oser kemampuan menggunakan sitrat dilakukan dan ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan. Proses Pengerjaan Uji %itrat *ahan "ang diperlukan 5 "iakan Escherichia coli "iakan aerogenes "iakan vulgaris "iakan Pseudomonas aeruginosa edia biakan 'immons &itrate agar.

Cara menger#akan 5 Hari pertama -. *. enandai tabung 'immonVs &itrate agar dengan nama, tanggal, dan nama mikroorganisme yang akan diujikan. enginokulasi tabung agar dengan inokulum yang tiptis. #nokulum yang tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan-akan dapat tumbuh dalam simmonVs &itrate agar, sehingga hasil yang tidak benar. 2. enginkubasi di suhu 25GC selam 41 jam.

Hari kedua -. *. emperhatikan atau mengamati perubahan warna dengan melihat pertubuhan dan perubahan warna dari warna hijau ke warna biru. elaporkan hail pengujian yang telah dilakukan
(o!$ # L &o! n U<i ;i#! # Mikroorganisme E.coli E.aerogenes P.vulgaris P.aeroginusa 2arna setelah masa inkubasi /esimpulan hasil pengu.ian

+.3.3 PEN00UN##N CITR#T

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

!ji untuk melihat penggunaan sitrat, hidrolisis urea dan likui(ikasi gelatin sangat berguna dalam pen&irian mikroorganisme. Penggunaan sitrat merupakan salah satu uji dari deretan !ji # 8#C yang digunakan dalam pen&irian bakteri koli(orm. <idrolisis urea sering kali digunakan untuk membedakan &almonella dari Proteus yang merupakan kuman patogen pada saluran urinaria, namun dapat pula ditemukan dalam spesimen sebagai kuman non-patogen. <idrolisis gelatin sering digunakan dalam membedakan spesies tertentu Pseudomonas dan mikroorganisme dalam saluran pen&ernaan. 3idrolisis Gelatin :elatin adalah protein yang diperoleh pada waktu merebus tulang, tulang rawan atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk KgelL. "eberapa mikroorganisme tertenu mampu menguraikan molekul sehingga asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai >at hara. <idrolisis gelatin oleh mikroorganisme tersebut dikatalisasikan oleh eksoen>im yang disebut gelatinase. :elatin yang telah di&erna tidak mampu membentuk gel dan &enderung bersi(at &air. %emampuan untuk men&ernakan gelatin dapat digunakan dalam pen&irian mikroorganisme. 'ebagai &ontoh, serratia marcescens dapat dibedakan dari 0lebsiella pneumonia atau Escherichia coli bedasarkan kemampuan men&ernakan gelatin. <idrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui si(at patogen galur mikroorganisme karena sering kali dikaitkan dengan produksi en>im untuk menguraikan bahan pengikat tenunan untuk memudahkan penyebaran mikroorganisme. 9alam .aboratorium, pen&airan gelatin diuji dengan &ara menusukkan mikroorganisme yang akan diuji ke dalam media semi-padat yang mengandung nutrient broth dan gelatin. edia ini diinkubasikan dan diamati kemampuan mikroorganisme men&airkan gelatin. Pada suhu 25GC, gelatin dapat men&air apabila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu mapun tidak mampu men&airkan gelatin. "erdasarkan hal tersebut, gelatin harus dimasukkan ke dalam lemari es selam 2+ menit untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme men&airkan gelatin. )pabila mikroorganisme mampu men&erna gelatin, maka

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

media semi-padat gelatin tetap bersi(at &air setelah dikeluarkan dari lemari es. 'ebaliknya bila mikroorganisme tidak mampu men&erna gelatin, maka media semi-padat gelatin membeku kembali, setelah dikeluarkan dari lemari es. Proses pengerjaan Hi#rolisis Gelatin *ahan "ang diperlukan : "iakan E.coli "iakan ".subtillis "iakan &.marcescens edia biakan gelatin

Cara menger#akan : Hari pertama -. *. 2. enandai tabung gelatin dengan nama, tanggal pembuatan, mikroorganisme yang akan diujikan. edia diinokulasikan dengan &ara menusukkan mikroorganisme yang akan diujikan sedalam W bagian dari lapisan permukaan. enginkubasikan pada suhu 25GC selam *4 jam.

Hari kedua -. *. engamati pertumbuhan dalam media gelatin, kemudian masukkan tabung ke dalam lemari es selama 2+ menit. engamati pen&airan gelatin setelah dikelauarkan dari lemari es. Pen&airan gelatin dapat dilihat dengan memiringkan tabung. )pabila gelatin tetap dalam keadaan &air, maka mikroorganisme mampu men&ernakan atau menghidrolisiskan gelatin. "eberapa mikroorganisme mampu men&ernakan gelatin namun memerlukan waktu yang relati( lama. #ni berarti bahwa medium gelatin harus diinkubasikan kembali selama minggu sebelum dapat dinyatakan pengujian bersi(at negati(. .aporkan.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

U<i Pen8 i! n Gel #in a0 edium pembiakan tegak dari gelatin nutrisi, tiogikolat gelatin medium, dieramkan selama 7 hari pada suhu kamar, kemudian diperhatikan apakah terjadi pen&airan gelatin. !ntuk organisme yang tumbuh lambat pada suhu gelatin menjadi &air, diikutsertakan tabung kontrol dengan gelatin yang tidak ditanam, dan setelah pengeraman kedua tabung diletakkan dalam lemari es semalaman. Tabung kontrol harus membeku. b0 edium agar gelatin ditanam dan dieramkan semalam pada suhu 27 oC. %emudian lempeng pembiakan itu disiram dengan larutan jenuh ammonium sul(at. Arganisme yang menghasilkan gelatinase akan memperlihatkan lingkaran di sekitar koloni. 3idrolisis rea "eberapa mikroorganisme mampu menghasilkan en>im urease yang menguraikan urea menjadi ammonium dan CA*. akti?itas en>im urease ini dapat diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang mengandung urea dan indikator p< /biasanya phenol-red0. )pabila dihidrolisiskan, N<4N terakumulasi dlam media menjadi basa. Perubahan warna dari merah-jingga menjadi merah-ungu merupakan petunjuk terjadinya hidrolisis urea. !rea bersi(at stabil, sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan auto&la?e. 'terilisasi dilakukan dengan &ara (iltrasi /penyaringan0. :enus Proteus dapat dibedakan dari beberapa bakteri :ram negati( lain karena kesanggupannya menghasilkan banyak en>im urease. "ila dalam biakan terdapat urease, urea dihidrolisis, sehingga terbentuk amonia yang mengubah warna indikator dari kuning menjadi merah.

Re ksi Hi6!olisis u!e

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

BAB III PENUTUP


3.1 Kesi$&ul n 9alam kehidupan yang kita jalani ini alangkah baiknya kita dapat melakukan suatu kegiatan yang berman(aat dan berguna bagi orang lain kelak. Pastinya dengan menggunakan metode yang tepat dan benar. 9engan pembelajaran mikrobiologi ini kami dapat memahami tentang arti pentingnya sebuah usaha yang baik dan terarah. 9engan metode TPC, PN, dan !ji "onterey yang telah di(ahami dan dipelajari, maka kita akan dapat membantu khalayak luas dan ramai, khususnya masyarakat disekitar kita ataupun keluarga kita, dan umumnya adalah seluruh umat manusia ini, tentunya dalam perihal kaitannya dengan masalah mikroorganisme. 9engan usaha dan niat yang baik serta ilmu pengetahuan yang telah diperoleh maka dapat meningkatkan ke(ahaman dan wawasan tentang kegiatan praktikum yang akan dilakukan di semester 5 ini. 3.+ S ! n emberikan pengetahuan serta wawasan kepada masyarakat atau siswa tentang pembelajaran yang terdapat di semester 5 ini, dalam suatu pokok pembahasan yang dapat digunakan atau diman(aatkan sebagai pegangan dalam pengerjaan praktikum mikrobiologi. 'erta menyampaikan bahwa TPC, dalam kehidupan nyata dan merealisasikannya dalam dunia ini. PN, dan !ji "onterey ini merupakan jenis praktikum terapan yang dapat diaplikasikan di

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

DA(TAR PUSTAKA
"ibiana. Praktikum ikrobiologi. "andung.

'umber : www.google.&om www.wikipedia.&om 1#4 /'tandar Nasional #ndonesia0 dan ,1# /"adan 'tandar Nasional0 tentang mikroorganisme. *++1.

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI

TPC, MPN, Uji Bonterey

LAMPIRAN
L $&i! n &eke!< n 3 :

9imas 'eto Prasetyo

en&ari bahan, mengetik, editing, konsep makalah, print. <ani(a <andayani en&ari bahan, mengetik, print, dan jilid. :

..
MAKALAH MIKROBIOLOGI