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Daniel Bello, Roxana Garca, Miguel A. Otero, Gustavo Saura Fermentacin alcohlica con jugo de caa mezclado en Heriberto Duquesne ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, vol. XXXIX, nm. 2, mayo-agosto, 2005, pp. 29-34, Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120661006

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, ISSN (Versin impresa): 0138-6204 revista@icidca.edu.cu Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba

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Daniel Bello; Roxana Garca; Miguel A. Otero, Gustavo Saura Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA) e.mail: miguel.otero@icidca.edu.cu

RESUMEN Se evaluaron dos cepas industriales de Saccharomyces cerevisiae en la produccin de etanol a partir de jugos en la Empresa Mielera Heriberto Duquesne de la provincia de Villa Clara. La cepa Turbo, de procedencia sueca y desarrollada con propsitos especficos de produccin de etanol, alcanz una concentracin de etanol en el medio fermentado 36 % superior a la Collico de propsitos panaderos, en presencia de 0.1 g/L de fosfato y sulfato diamnico. En ausencia de las sales, estas concentraciones se redujeron en 71 y 52 %, respectivamente. Palabras clave: Saccahromyces cerevisiae, etanol, fermentacin alcohlica, levadura panadera ABSTRACT Two industrial strains of Saccharomyces cerevisiae were evaluated in ethanol production from sugar cane juices in the Molasses enterprise Heriberto Duquesne in Villa Clara province. Turbo yeast strain from Sweden and specially developed for ethanol production, reached an ethano concentration in fermented broth a 36 % higher than that obtained by Collico strain for bakery in presence of 0.1 g/L of diamonic phosphate and sulphate. In salt absence the yield were reduced in 71 and 52 % respectively. Key words: Saccahromyces cerevisiae, ethanol, etanol fermentation, baker`s yeast

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INTRODUCCIN La industria cubana de alcohol ha sido totalmente dependiente de las fbricas de azcar para obtener su materia prima fundamental: las mieles finales de caa. ste es un aspecto de importancia con relacin a la produccin de alcohol. Hasta el presente no ha habido un impulso empresarial al empleo de sustratos diferentes de las mieles. Sin embargo, con el presente escenario de la produccin azucarera y de etanol en Cuba, la necesidad de acudir a otros sustratos ha devenido imprescindible para cumplimentar la demanda creciente del combustible y anticipar la ya real escasez de mieles finales como materia prima (2). Dejando a un lado la produccin de etanol a partir del etileno, existen en la actualidad tres grupos de materias primas: Remolacha, caa de azcar, sorgo dulce y frutas (7, 11) Materiales amilceos tales como maz, millo, trigo, arroz, patatas, yuca, boniato, etc. (3, 4, 5, 6), y Materiales celulsicos como: madera, papel reciclado, residuos de cosecha, etc (1, 4, 9, 10). No obstante, la produccin de etanol de lignocelulsicos an no existe a escala comercial. En vista de lo anterior, el empleo de cantidades equivalentes de jugo de caa, especialmente jugos secundarios, directamente para la fermentacin y produccin de etanol, parece ser la ms econmica y revalorizadora de las alternativas para las fbricas de azcar (8). El jugo secundario posee menos azcar y arrastra impurezas. Esto requiere cantidades sustanciales de vapor para la evaporacin e induce mayores cargas durante la refinacin. Si se deriva este jugo secundario a la produccin de etanol, esto ayudara la operacin del ingenio en: Reducir la carga de evaporacin de este jugo diluido, reduciendo al mismo tiempo el consumo de vapor Produccin de azcar de mayor calidad al utilizar los jugos secundarios para la produccin de etanol y, Generacin de valores adicionales en trminos de produccin y venta de etanol Por medio de esto, cada ingenio azucarero ser capaz de cumplimentar sus demandas de produccin de azcar a partir de los
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jugos primarios y producir alcohol simultneamente a partir de los jugos secundarios durante la campaa de molida. El objetivo del presente trabajo es investigar a escala industrial, la posibilidad de fermentar jugos secundarios en la Empresa Mielera Heriberto Duquesne, con la finalidad de su posterior introduccin comercial. MATERIALES Y MTODOS Microorganismo Fueron evaluadas dos cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae seca activas comerciales, a saber: Turbo yeast, productora de etanol y Collico, de panificacin, de procedencia chilena. La primera suministrada por Quimizuk SA, en tanto la segunda fue adquirida en el mercado nacional. Propagacin Ambas cepas fueron propagadas en un fermentador de 2 L Biotec a temperatura entre 30 y 32 C. El pH fue controlado entre 3.5 y 3.8 por medio de la combinacin de sales nutrientes (1.68 g/L de fosfato diamnico, 0.76 g/L de urea y 1.59 g/L de sulfato diamnico). El flujo aire fue mantenido a 1 vvm y la agitacin en 450 rpm. Se efectu, igualmente, una propagacin a escala de 30 L utilizada para la siembra del primer pre-fermentador de la destilera. En las propagaciones a escala de 2 L se determin cada hora la materia seca gravimtrica y el conteo celular cada 2 horas para estudiar la cintica de crecimiento. En todos los casos, la propagacin se efectu con concentracin de azcares reductores totales (ART) de 30 g/L. Fermentacin alcohlica La levadura propagada aerbicamente fue utilizada para inocular frascos de 1 L con 300 mL de medio de fermentacin compuesto por diferentes variantes de sustrato: Jugo de los filtros (JF), jugos diluidos (JD) y miel final en relacin de 75 % de los azcares aportados por los jugos (60 % JD y 40 % JF) y 25 % por la miel final. Adicin de sales nutrientes (fosfato y sulfato de amonio en concentraciones de 0.1 g/L). Condiciones idnticas a las anteriores pero sin adicin de sales
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Las muestras fueron dejadas estticas a temperatura ambiente (30 C) por 20 horas. RESULTADOS Y DISCUSIN Los ajustes de los medios de fermentacin empleados en todos los experimentos se llevaron a cabo a partir de los datos de composicin de los jugos y la miel final del da. Las tablas 1 y 2 muestran el resumen de los anlisis disponibles de ambos sustratos. La fermentacin de jugos de caa es un proceso establecido en las destileras de Brasil desde hace aos como parte de su programa nacional de alcohol. Sin embargo, en nuestro pas solamente se han realizado pruebas a escala de laboratorio y en condiciones lejanas a las de una destilera tpica. La figura 1 muestra el esquema previsto para la realizacin de la prueba industrial de fermentacin de jugos en la destilera de la Empresa Azucarera Heriberto Duquesne, sita en el municipio de Remedios en la provincia de Villa Clara. El jugo de la desmenuzadora (primer molino) se destina ntegramente a la produccin de azcar, en tanto los jugos de los molinos 2, 3 y 4, mezclados con los jugos de los filtros de cachaza se emplearn en la fermentacin

Figura 1. Esquemas de produccin de jugos para la fermentacin alcohlica en la destilera de la EA Heriberto Duquesne

alcohlica. Es de destacar, que en todos los casos, la levadura en los pre-fermentadores fue propagada con miel final exclusivamente. Antes de enfrentar la fermentacin alcohlica es preciso estudiar las potencialidades de propagacin de las cepas candidatas a su introduccin en la fbrica. La etapa de propagacin reviste vital importancia pues de ella depende el estado fisiolgico del microorganismo y las posibilidades de una

Tabla 1. Composicin de las mieles finales tributadas a la destilera de la EA Heriberto Duquesne entre los das 23 y 28 de febrero del 2005 Densidad Brix pH Lodos RLibres RTotales Sacarosa AzTot AzFerm RInferm 23-02 1.410 80.00 6.1 4.80 15.10 61.69 44.26 59.36 58.79 2.9 24-02 1.415 80.60 5.9 6.74 13.16 61.76 46.18 59.33 58.68 3.1 25-02 1.412 80.14 5.7 10.34 17.21 61.77 42.32 59,54 58.68 3.1 26-02 1.413 80.28 5.8 7.90 17.17 61.21 41.84 59.01 58.13 3.1 27-02 1.456 86.66 5.7 7.44 17.12 61.36 42.03 59.14 58.28 3.1 28-02 1.450 86.0 5.7 7.00 15.02 56.15 39.08 54.09 53.61 2.5 MEDIA 1.426 0.017 82.33 2.58 5.82 0.13 7.37 1.44 15.80 1.32 60.66 1.78 42.62 1.92 58.41 1.70 57.70 1.62 2.96 0.17

Tabla 2. Composicin de jugos de la EA Heriberto Duquesne durante la zafra 2003-2004 JUGO BRIX Desmenuzadora 19.66 Jugo Mezclado molinos 2,3,4 14.85 Jugo Mezclado filtros 14.72 Filtros 13.63 *determinados para el presente informe ICIDCA No. 2, 2005 POL 16.99 12.71 12.56 11.53 PUREZA 86.36 85.73 85.34 80.95 LODOS, %* ND 9.80 8.72 18.30 31

Figura 2. Curvas de crecimiento y multiplicacin de Saccharomyces cerevisiae Turbo en miel final de caa. Composicin del medio: ART = 30 g/L, temperatura = 30-32 C, pH = 3.5-4.0, aire = 1 VVM/450 rpm

Figura 3. Curvas de crecimiento y multiplicacin de Saccharomyces cerevisiae Collico en miel final de caa. Composicin del medio: ART = 30 g/L, temperatura = 30-32 C, pH = 3.5-4.0, aire = 1 VVM/450 rpm

fermentacin eficiente, en un proceso no asptico. La tasa mxima de crecimiento (max) de una poblacin microbiana en un medio de composicin dada, caracteriza a esa poblacin desde el punto de vista cintico. Las dos cepas en estudio fueron propagadas aerbicamente sobre un medio compuesto exclusivamente por miel final de caa y sales nutrientes. La figura 2 muestra el comportamiento de la cepa alcoholera turbo de la especie Saccharomyces cerevisiae. Bajo las condiciones establecidas, es de esperar la formacin de etanol por desviacin del metabolismo producto del efecto Pasteur tpico de este gnero. Un patrn similar se obtuvo con la levadura panadera seca activa Collico, como puede observarse en la figura 3. Se observa de la comparacin de ambas figuras, una pendiente mayor en el caso de Turbo lo que sugiere una mayor tasa de crecimiento en esta cepa. La determinacin grfica de la max en ambos casos, evidenci diferencias significativas entre ambas cepas, obtenindose 0.28 h-1 y 0.14 h-1 para Turbo y Collico, respectivamente. Los valores de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s) no mostraron, sin embargo, diferencias entre ambas, obtenindose valores en el entorno de 0.21 en los dos casos. Los valores obtenidos de max no corresponden a la realidad de las cepas en cuestin, por ser utilizado parte del sustrato en el crecimiento anaerbico, mucho menos eficiente que la respiracin. Es preciso estudiar la propagacin en concentraciones de azcar ms bajas para evitar el desvo del metabolismo.
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Se ensay la influencia del nutriente QZ-350 sobre esta etapa, con el objetivo de potenciar el estado fisiolgico del inculo. La figura 4 muestra el comportamiento de la levadura Turbo en presencia de ste. El incremento de la concentracin celular es de slo 6 %, sin embargo, la max aumenta hasta 0.31 h-1, 11 % superior al de la cepa sin nutriente. Cuando se increment la concentracin de nutriente hasta 0.05 g/L, la concentracin super 6.5 g/L y el conteo celular se elev hasta 2.47 x 108.

Figura 4. Curvas de crecimiento y multiplicacin de Saccharomyces cerevisiae Turbo en miel final de caa suplementada con 0.03 Kg/m3 de QZ-350. Composicin del medio: ART = 30 g/L, temperatura = 30-32 C, pH = 3.5-4.0, aire = 1 VVM/450 rpm

Fermentacin de jugos A partir de los experimentos de propagacin de las dos cepas en estudio, se preparaICIDCA No. 2, 2005

ron frascos de 1 L con 300 mL de medio conformado por 45 % de jugo mezclado, 30 % de jugo de filtros y 25 % de miel final de caa. Los medios fueron suplementados con sulfato y fosfato de amonio en concentraciones de 0.01 g/L con el objetivo de estudiar la influencia de la adicin de sales en la etapa de fermentacin. La tabla 3 muestra los resultados obtenidos.
Tabla 3. Fermentacin de mezclas de jugo y miel con las cepas Turbo y Collico en presencia de sales nutrientes. Condiciones Turbo yeast Con sales Sin sales Collico Con sales Sin sales ART ART Etanol inic, fin, % g/L g/L
6.84 4.00 5.02 3.29 131 131 131 131 18 50 13 35

Yp/s, %

60.49 2.87 49.38 2.43 42.54 0.33 34.27 0.21

Para asegurar un estado fisiolgico ptimo del microorganismo, se adicion al medio 0.05 g/L de estimulador de crecimiento QZ-350, ligeramente superior al utilizado en los experimentos previos, adems de las correspondientes sales de forma que la fuente de carbono fuese el sustrato limitante. La propagacin fue llevada a cabo por 9 horas, alcanzndose una concentracin celular de 247 millones/mL correspondientes a una materia seca de 6.5 g/L. El contenido ntegro del tanque fue utilizado en la siembra del pre-fermentador 1 de la fbrica sobre un lecho de 600 L de medio de miel final a 7 bx y las sales nutrientes necesarias para la propagacin. La tabla 4 muestra el comportamiento del pre-fermentador de 12 m3.
Tabla 4. Comportamiento del prefermentador 1 de la EA H. Duquesne inoculado con la levadura Turbo sobre miel final de caa. HORA BRIX TEMPERATURA, C 11:20 13.11 28 13:20 13.11 28 15:20 13.11 28 17:20 13.11 28 19:20 13.16 28 21:20 12.56 29 23:20 11.76 29 01:20 9.71 29 03:20 7.63* 31 05:20 13.03 34 07:20 11.00 32 09:20 9.96 33 *elevacin del volumen de propagacin a 12 m3

La comparacin entre ambas cepas mostr diferencias significativas a favor de turbo yeast para 0.05, tanto en la versin con sales como sin ellas. Es importante destacar que esta levadura es especfica para la fermentacin alcohlica no as la Collico que es una levadura de panificacin. Con relacin a la adicin de sales como tal, se manifestaron tambin diferencias significativas a favor de su uso, cualquiera sea la levadura utilizada. En la actualidad la destilera de la Empresa Azucarera H. Duquesne, adiciona sales en la etapa de fermentacin. Otro aspecto a favor del uso, es el mayor agotamiento del sustrato, lo que tiene importancia no slo econmica al inducir un mayor agotamiento del sustrato, sino tambin ecolgica por disponer vinazas de menor grado de contaminacin. Una vez demostrado el efecto positivo de la adicin de sales y la superioridad de la cepa Turbo con relacin a la Collico, se procedi a su propagacin a escala de fbrica, en la bsqueda de su adaptacin a la escala industrial en las condiciones de produccin establecidas en la destilera. A estos efectos, se prepar un tanque con 30 L de medio al que se le provey de aireacin y se inocul con el contenido total del fermentador de 2 L para una relacin de inoculacin de 1:15.
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A partir del completamiento del prefermentador 1, se extrajeron 2/5 partes del mismo para inocular el pre-fermentador 2 y se adicion medio fresco hasta completar la propagacin. El pre-fermentador 2 por su parte, sigui el mismo esquema con relacin al pre-fermentador 3. Una vez terminada la propagacin en el 1, se inocul el fermentador industrial de 100 m3 No. 6 para comenzar la fermentacin alcohlica a escala industrial. En el marco de 24 horas, la sala de fermentacin estaba ocupada completamente por la nueva cepa Turbo yeast.
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Tabla 5 Composicin de etanol destilado a partir de la fermentacin mezcla de sustratos y por la levadura Turbo yeast ANLISIS FERMENTACI N 1* FERMENTACI N 2** FERMENTACI N 3*** Grado 8.6 14.3 ND Acetaldehdo, g/100 l 26.95 23.44 0.74 Acetato de etilo, g/100 l 20.61 27.77 3.98 Propanol, g/100 l 11.02 19.13 1.97*** Isobutanol, g/100 l 28.33 23.52 2.12*** Isoamlico, g/100 l 103.17 59.57 8.48*** *fermentacin a escala de laboratorio; ** fermentacin industrial; *** expresado en g/l

Composicin del alcohol destilado a escala de laboratorio e industrial El etanol producido a escala de laboratorio a partir de la mezcla de sustratos en presencia de sales, fue destilado y analizado en su composicin. La tabla 5 ofrece los resultados obtenidos. CONCLUSIONES La utilizacin de jugos secundarios de la fbrica de azcar en mezclas con pequeas cantidades de miel de caa permite el incremento de la concentracin de etanol en la baticin fermentada. El empleo de cepas de levadura productoras especficas de etanol, influye positivamente en la concentracin alcohlica del medio. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Ballesteros, M; Oliva, JM; Manzanares, P; Negro, MJ; Ballesteros, I. Ethanol production from paper material using a simultaneous saccharification and fermentation system in a fed-batch basis. World J Microbiol Biotechnol 18(6):559-561, 2002 2. Deeb, RA; Chu, KH; Shih, T; Linder, S; Suffet, IM; Kavanaugh, MC; Alvarez, CL. MTBE and other oxygenates: Environmental sources, analysis, occurrence, and treatment. Environm Eng Sci, 20(5):433-447, 2003

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