Teknik Biologi Molekuler

Teknik Biologi Molekuler

Sejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme. Komponen-komponen ini mencakup DNA, repositori informasi genetik; RNA, kerabat dekat DNA yang fungsinya melayani sebagai berkisar dari copy pekerjaan sementara DNA untuk fungsi struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan struktural dari aparat translasi, dan protein, jenis struktural dan enzimatik utama dari molekul dalam sel.

Ekspresi kloning
Salah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein bunga kloning (menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid (dikenal sebagai vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor khusus untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid. Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan DNA telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus). Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik transfeksi berbeda tersedia, seperti transfeksi kalsium fosfat, elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil, atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara. Dalam kedua kasus, DNA coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein sekarang dapat dinyatakan. Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur tersier yang dapat dipelajari, atau, dalam industri farmasi, aktivitas obat baru terhadap protein dapat dipelajari.

Polymerase chain reaction (PCR)

Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali), atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.

Gel elektroforesis
Elektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau berdasarkan ukuran dan muatan listrik mereka dengan menggunakan apa yang dikenal sebagai elektroforesis gel 2D.

Makromolekul blotting dan menyelidik

Istilah''utara'',''Barat''dan''''timur blotting berasal dari apa yang awalnya adalah lelucon biologi molekuler yang dimainkan di''''jangka blotting Selatan, setelah teknik yang dijelaskan oleh Edwin Selatan untuk dengan hibridisasi DNA dari dihapuskan. Patricia Thomas, pengembang dari noda RNA yang kemudian menjadi dikenal sebagai
P

Saved from URL: http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Indonesian).aspx

/4

Teknik Biologi Molekuler

noda''''utara sebenarnya tidak menggunakan istilah itu. Kombinasi lebih lanjut dari teknik ini menghasilkan istilah-istilah seperti''southwesterns''(protein-DNA hybridizations),''northwesterns''(untuk mendeteksi protein-RNA interaksi) dan farwesterns''''(interaksi protein-protein), yang semuanya saat ini ditemukan dalam literatur.

Southern blotting
Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Selatan, Selatan Blot adalah metode untuk menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian terkena probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA pada bunga. Kebanyakan protokol asli yang digunakan label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia. Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. Bercak ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun, seperti mengukur jumlah salinan transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa gen sel induk garis KO embrio.

Northern blotting
Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup.

Western blotting
Antibodi terhadap protein yang paling dapat dibuat dengan menyuntikkan sejumlah kecil protein menjadi binatang seperti mouse, kelinci, domba, atau keledainya (antibodi poliklonal) atau diproduksi dalam kultur sel (antibodi monoklonal). Antibodi ini dapat digunakan untuk berbagai teknik analisis dan preparatif. Di barat blotting, protein yang pertama dipisahkan oleh ukuran, dalam gel tipis terjepit di antara dua pelat kaca dalam teknik yang dikenal sebagai SDS-PAGE (natrium sulfat dodesil poliakrilamida elektroforesis gel). Protein dalam gel kemudian ditransfer ke PVDF, nitroselulosa, membran nilon atau dukungan lainnya. Membran ini kemudian bisa dideteksi dengan solusi antibodi. Antibodi yang secara khusus mengikat protein yang menarik kemudian dapat divisualisasikan oleh berbagai teknik, termasuk produk berwarna, chemiluminescence, atau autoradiografi. Seringkali, antibodi diberi label dengan enzim. Ketika substrat chemiluminescent terkena enzim itu memungkinkan deteksi. Menggunakan teknik western blotting memungkinkan deteksi tidak hanya tetapi juga analisis kuantitatif. Metode analog dengan Barat blotting dapat digunakan untuk langsung noda protein tertentu dalam sel hidup atau bagian jaringan. Namun, metode''''immunostaining, seperti IKAN, lebih sering digunakan dalam penelitian biologi sel.

Timur blotting
Teknik blotting Timur adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein mengeringkan ke nitroselulosa membran PVDF atau yang diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu.

Array
P

Saved from URL: http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Indonesian).aspx

/4

Teknik Biologi Molekuler

Sebuah array DNA adalah kumpulan bintik-bintik melekat pada dukungan solid seperti slide mikroskop dimana spot masing-masing berisi satu atau lebih beruntai tunggal oligonukleotida fragmen DNA. Array memungkinkan untuk meletakkan jumlah besar bintik-bintik yang sangat kecil (100 diameter micrometre) pada slide tunggal. Setiap tempat memiliki molekul DNA fragmen yang melengkapi urutan DNA tunggal (mirip dengan blotting Selatan). Sebuah variasi dari teknik ini memungkinkan ekspresi gen dari suatu organisme pada tahap tertentu dalam pembangunan yang berkualitas (profiling ekspresi). Dalam teknik ini RNA dalam jaringan adalah terisolasi dan diubah menjadi cDNA berlabel. Ini cDNA ini kemudian hibridisasi dengan fragmen di array dan visualisasi hibridisasi dapat dilakukan. Sejak beberapa array dapat dilakukan dengan posisi yang sama persis fragmen mereka sangat berguna untuk membandingkan ekspresi gen dari dua jaringan yang berbeda, seperti jaringan sehat dan kanker. Juga, kita dapat mengukur apa gen disajikan dan bagaimana perubahan ekspresi yang dengan waktu atau dengan faktor lain. Sebagai contoh, ragi roti yang umum itu,''Saccharomyces cerevisiae'', mengandung sekitar 7000 gen, dengan microarray, orang dapat mengukur secara kualitatif bagaimana gen masing-masing dinyatakan, dan bagaimana bahwa perubahan ekspresi, misalnya, dengan perubahan suhu. Ada banyak cara yang berbeda untuk mengarang mikroarray; yang paling umum adalah chip silikon, mikroskop slide dengan bercak ~ 100 diameter micrometre, array kustom, dan array dengan bercak yang lebih besar pada membran berpori (macroarrays). Ada bisa dimana saja dari 100 spot ke lebih dari 10.000 pada array yang diberikan. Array juga dapat dibuat dengan molekul lain dari DNA. Sebagai contoh, sebuah array antibodi dapat digunakan untuk menentukan apa yang protein atau bakteri yang hadir dalam sampel darah.

Oligonukleotida spesifik alel

Oligonukleotida alel spesifik (ASO) adalah teknik yang memungkinkan deteksi mutasi basa tunggal tanpa memerlukan elektroforesis PCR atau gel. Pendek (20-25 nukleotida panjang), probe berlabel terkena DNA target non-terfragmentasi. Hibridisasi terjadi dengan kekhususan tinggi karena panjang pendek dari probe dan bahkan perubahan basa tunggal akan menghambat hibridisasi. DNA target kemudian dicuci dan probe label yang tidak berhibridisasi dihapus. DNA target kemudian dianalisa untuk kehadiran probe melalui radioaktivitas atau fluoresensi. Dalam percobaan ini, seperti dalam kebanyakan teknik biologi molekular, kontrol harus digunakan untuk memastikan percobaan berhasil. Illumina Metilasi Assay adalah contoh dari sebuah metode yang mengambil keuntungan dari teknik ASO untuk mengukur satu perbedaan pasangan basa secara berurutan.

Teknologi kuno
Dalam biologi molekular, prosedur dan teknologi yang terus-menerus dikembangkan dan teknologi yang lebih tua ditinggalkan. Misalnya, sebelum munculnya gel elektroforesis DNA (agarosa atau Polyacrylamide), ukuran molekul DNA biasanya ditentukan oleh tingkat sedimentasi di gradien sukrosa, teknik lambat dan padat karya yang membutuhkan instrumentasi mahal; sebelum gradien sukrosa, viscometry digunakan . Selain dari kepentingan sejarah mereka, sering perlu mengetahui tentang teknologi yang lebih tua, karena kadang-kadang berguna untuk memecahkan masalah lain yang baru untuk teknik yang lebih baru adalah tidak tepat. Bacaan lebih lanjut Apakah Biologi Molekuler?

Artikel ini berlisensi di bawah Lisensi Creative Commons Attribution-ShareAlike . Ini menggunakan bahan dari artikel Wikipedia pada " biologi molekuler "Semua bahan yang digunakan diadaptasi dari Wikipedia tersedia di bawah persyaratan Lisensi Creative Commons Attribution-ShareAlike . Wikipedia itu sendiri adalah merek dagang terdaftar dari Wikimedia Foundation, Inc

Saved from URL: http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Indonesian).aspx

/4

Teknik Biologi Molekuler

Peringatan: Halaman ini adalah terjemahan mesin halaman ini aslinya dalam bahasa Inggris. Harap diperhatikan karena terjemahan yang dihasilkan oleh mesin, tidak semua terjemahan akan sempurna. Website ini dan halaman web yang dimaksudkan untuk dibaca dalam bahasa Inggris. Setiap terjemahan dari website ini dan halaman web yang mungkin tidak tepat dan tidak akurat secara keseluruhan atau sebagian. Terjemahan ini disediakan sebagai kenyamanan.

Saved from URL: http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Indonesian).aspx

/4