Anda di halaman 1dari 5

3.

Isolasi bakteri Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkung annya seperti yang terdapat pada organ organisme (ikan), sehingga diperoleh kultur murni atau biak an murni bakteri. Mengisolasi bakteri dilakukan di dalam laminary flow secara aseptik dan teliti. Pros es pengisolasian dilakukan menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan kemudian ditusuk ke orga n komoditi yang ingin didentifikasi. Setelah itu digoreskan pada media padat TSA atau BHIA. Setelah penggoresan selesai media dimasukkan kedalam inkubator pada suhu 26-300C. selama 2448 jam dan akan menghasilkan koloni transparan berukuran 0.5 mm. 4. Pemurnian Bakteri Pemurnian dilakukan dari isolasi bakteri yang telah diinkubasi selama 24 48 jam, bakteri yang telah diinkubasi biasanya terdiri dari beberapa koloni bakteri. Sehingga diperlu kan pemurnian bakteri secara aseptik agar kita hanya memperoleh satu jenis bakteri didalam media tumbuh tersebut. Teknik pemurnian bakteri dilakukan dengan menggunakan jarum ose yang telah di sterilkan. Kemudian mengambil satu koloni yang terpisah pada media hasil isolasi, lalu digores ke per mukaan media tumbuh sesuai jenis koloni yang ingin dimurnikan menggunakan dengan teknik 4 gor esan. Bakteri yang diambil dari media tumbuh secara aseptik, digoreskan pada media kultur murni B HIA, setelah goresan pertama selesai, jarum ose dipanaskan dan setelah dingin dilakukan goresan ke dua, dari goresan kedua ke goresan ketiga tidak perlu memanaskan jarum ose, hal ini dimaksudkan j umlah koloni bakteri dari goresan kedua sudah mulai sedikit, sedangkan goresan keempat terpisah d ari goresan 1, 2 dan 3. Setelah kultur murni selesai, bakteri tersebut diinkubasi dengan suhu 270C 30 0C selama 24 48 jam di inkubator. 5. Uji Biokimia Uji biokimia (uji lanjut) dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri yang menyerang ikan, selain dengan melihat bentuk dan warna koloni bakteri, kita perlu melakukan uji biokimia agar proses ident ifikasi lebih akurat. Adapun langkah-langkah yang dilakukan dalam uji biokimia yaitu ; a. Pewarnaan gram Proses pewarnaan gram dilakukan dengan cara menyediakan slide glass bersih yang sudah dib eri tetesan aquadest. Mengambil biakan bakteri yang akan diuji lalu digoreskan pada slide glass terse but dengan cara diratakan secara tipistipis hingga kering agar bakteri yang ada pada slide tersebut tidak menumpuk sehingga mudah untuk diamati. Setelah itu, difiksasi di atas api bunsen agar bakteri betulbetul merekat pada slide glass, tetapi pada saat difiksasi jangan terlalu lama, karena dapat menyeba bkan bakteri jadi rusak. Selanjutnya, memberikan tetesan gram A (Kristal violet) selama 1 menit, kem udian dibilas dengan air mengalir, lalu dikeringkan. Gram ini berfungsi untuk memberikan warna sek aligus gram positif pada bakteri yang ada pada slide tersebut. Setelah kering ditetesi lagi dengan gra m B (iodium) selama 1 menit juga. Ini untuk merekatkan gram positif pada bakteri. Setelah gram B, d iberikan lagi gram C (alcohol 95%) selama 30 detik lalu dibilas dan dikeringkan. Dan yang terakhir, dit etesi dengan gram D (safranin) selama 2 manit lalu dibilas dengan air dan dikeringkan. Pada gram ini, dia akan memberikan / merekatkan gram negative. Jika bakteri termasuk gram positif maka gram D tidak akan berpengaruh pada bakteri tersebut. Tetapi jika sebaliknya, gram D akan merekat dan me

mberikan warna negative pada bakteri tersebut. Setelah semua pemberian warna selesai,objek glass dapat diamati langsung dibawah mikroskop. Hasil Pewarnaan Gram Edwardsiella tarda Adapun hasil yang diperoleh pada sampel ikan Nila yang di ininokulasikan dengan media TSB, dila kukan uji pewarnaan gram. Organ yang di isolasi adalah ginjal dan ditemukan bakteri Edwardsiella ta rda berwarna merah muda dengan bentuk batang pendek gram negatif.

Gambar 13. Bakteri Edwardsiella tarda b. Uji oksidase Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri tersebut. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dan diletakkan pada kertas oksidase, jika kertas oks idase berwarna biru maka uji oksidase positif, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna mak a uji oksidase negatif. c. Uji katalase Uji katalase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim katalase bakteri. Uji ini dilakukan denga n cara mengambil biakan bekteri yang telah ditetesi H2O2, jika bakteri tersebut berbuih atau mengel uarkan gelembung gas maka uji katalase positif, sedangkan jika tidak berbuih maka katalase negative . d. Uji MIO Uji MIO terdiri terdiri dari motil (tusukan), indol (cincin) dan ornithin (perubahan warna). Biakan b akteri diambil menggunakan jarum ose lurus dan ditusukan secara vertical lalu diinkubasi selama 2 4 jam, kemudian dilihat perubahan yang terjadi. Apabila biakan bakteri menyebar dari garis tusukan maka motil positive, sedangkan apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu tua atau tetap ungu, maka ornithin positive dan apabila terjadi cincin merah setelah ditetesi larutan kovaks maka indol p ositive. e. Uji Triple Sugar Iron (Agar)

Uji TSIA ini bertujuan untuk melihat perubahan warna yang terjadi pada goresan miring (Slant) dan tusukan tegak (Butt) dan melihat reaksi bakteri terhadap asam dan basa, serta kemampuan bakteri manghasilkan gas dan H2S. Apabila terjadi perubahan warna merah pada goresan miring dan tusuka n tegak maka bakteri bersifat K/K (basa), sedangkan apabila perubahan pada goresan miring menjadi warna kuning dan pada tusukan tegak menjadi merah maka bakteri bersifat A/K (Asam/Basa). Selain itu apabila terbentuk warna hitam, maka bakteri menghasilkan H2S dan apabila ada gas, maka bakte ri dapat menghasilkan gas. f. Uji Lysine decarboxilase Media LIA terdiri dari goresan miring/slant (diaminase) dan tusukan lurus/butt (decarboxylase), uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose kemudia n ditusukkan pada butt dan digoreskan pada slant kemudian diinkubasi selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warna pada slant dan butt menjadi ungu tua maka uji LIA ini positif, dan apabila tid ak terjadi perubahan warna maka pembacaannya negative. Media akan berubah warna menjadi hitam apabila bakteri yang diuji mampu menghasilkan gas (H2S). g. Uji Simons Citrate Agar (SCA) Prinsipnya untuk mendeterminasi kemampuan bakteri menggunakan asam citrat sebagai sumber k arbon untuk metabolisme. Test ini dapat untuk membedakan genera Edwardsiella () dengan Salmonella (+), membedakan spesies Aeromonas hydrophyla (+) dengan A. salmonicida () dan lainlain. Uji SCA dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose, lalu digoresk an pada media SCA dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi, diamati perubahan warna ya ng terjadi. Jika terjadi perubahan warna dari warna hijau menjadi warna biru maka uji SCA positif, se dangkan apabila tidak terjadi perubahan warna, maka hasilnya negatif. h. Uji Trehalose, Dmanitol , dan sukrose, L-arabinouse Uji gulagula ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri melakukan fermentasi karbohidrat. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan jarum ose lalu dimasukkan ke dala m media gulagula setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warna maka pengujian terse but positif dan apa bila tidak terjadi perubahan warna maka pengujian tersebut hasilnya nega tif. i. Uji Malonate Uji ini dilakukan untuk melihat perubahan malonate. Jika terjadi perubahan warna dari hijau ke bir u, maka uji malonate positif. Sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna maka uji malonate ne gatif. j. Uji MRVP Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri menfermentasi glukosa untuk menghasilka n asam pada pengujian Methyl Red (MR). Pembacaan MR dilakukan dengan menambahkan reagent

MR sebanyak 6 tetes, apabila terjadi perubahan warna menjadi warna merah maka hasil pembacaan nya positif, sedangkan apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning maka hasil pembacaannya n egatif. 6. Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri adalah membandingkan bakteri yang belum diketahui dengan bakteri yang suda h diketahui identitasnya dengan melakukan pembacaan warna. Identifikasi mikroba berguna untuk mempelajari secara detail karakter fisik, kimiawi, dan biologis mikroba sehingga dapat di ketahui dan dimanfatkan secara optimal.

Gambar. Hasil pembacaan bakteri Edwardsiella tarda Identifikasi bakteri di lakukan dengan melihat perubahan uji biokimia yang telah diinkubasi selama 2448 jam. Hasil uji biokimia dan perwarnaan gram di tulis dalam blangko pengujian dan selajutnya diid entifikasi secara manual dengan bantuan buku acuan : 1. Bakteria from Fish and Other Aquatic Animals 1 (Buller, 2004) 1. Bacteria Fish Pathogens Disease of Farmed and Wild Fish (Springer, 2007) 2. Cowan and Steels Hasil uji biokimia untuk kontrol ( + ) edwardsiella tarda sebagai berikut ; KARAKTAERISTIK Acid Production From : 1. D-Mannitol Edwardsiella tarda

2. Sucrose 3. Trehalose 4. L-Arabinose Tetrathionate reduction Malonate utilization Indole production

+ +

Hidrogen sulfide production in Triple Sugar Iron (agar) + Motility Citrate (Christensens) Sumber : OIE, 1995 + +