Anda di halaman 1dari 16

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Penyakit trombosis


Hemostasis merupakan peristiwa penghentian pendarahan akibat gumpalan darah yang
terjadi di sekitar pembuluh darah yang rusak. Sedangkan trombosis merupakan peristiwa
yang terjadi ketika endotelium yang melapisi pembuluh darah rusak atau robek. Peristiwa
trombosis ini mencakup proses pembekuan darah (koagulasi) yang melibatkan pembuluh
darah, trombosit, dan protein plasma penyebab pembekuan darah maupun pelarutan bekuan
darah. Hemostasis dan trombosis memiliki tiga fase yang sama, yaitu: (1) Pengaktifan
trombosit oleh trombin membentuk agregrat trombosit sementara yang dalam hemostatis
disebut sumbat hemostatik dan dalam trombosis dikenal sebagai trombus; (2) Pembentukan
jaring fibrin yang terikat dengan agregat trombosit sehingga terbentuk sumbat hemostatik
atau thrombus yang lebih stabil; dan (3) Pelarutan sebagian atau keseluruhan agregrat
hemostatik atau trombus oleh plasmin (Murray et al., 1992).
Trombosis telah menjadi penyebab kegawatan medis yang serius. Penyakit trombosis
berlangsung ketika tubuh mengalami ketidakseimbangan proses pembekuan darah dan
pencairannya kembali. Penyakit trombosis yang banyak dikenal diantaranya adalah cerebral
stroke, myocardial infarction, venous thromboembolism, dan hemofilia. Penyakit trombosis
pada pembuluh arteri jantung merupakan penyebab utama kematian di banyak bagian dunia.
Stroke merupakan salah satu penyakit trombosis akibat pendarahan di otak. Pendarahan ini
menyebabkan pecahnya pembuluh darah di otak yang mengakifkan trombin untuk mengubah
fibrinogen menjadi benang-benang fibrin. Benang-benang fibrin ini mengakibatkan
pembekuan darah di pembuluh yang rusak. Pada penderita penyakit stroke, tubuh tidak dapat
mencairkan gumpalan darah yang sudah terjadi sehingga aliran darah dan nutrisi pada otak
terhenti.
4
Penanganan terhadap penyakit stroke sudah banyak dilakukan dalam bentuk pemberian
aktivator agen-agen pencairan darah (fibrinolisis) diantaranya adalah: (1) t-PA, protease
serin yang merupakan aktivator alami dalam tubuh; (2) u-PA yang zat diisolasi dari urine. u-
PA yang disintesis oleh tipe sel seperti monosit/makrofag, fibroblast, dan sel-sel epitel
merupakan prazat aktivator sekunder plasminogen; dan (3) streptokinase, aktivator
plasminogen yang dihasilkan oleh bakteri Streptococci. Biasanya, jumlah plasmin yang
diaktifkan oleh streptokinase melebihi kapasitas 2-antiplasmin yang bersirkulasi di dalam
darah sehingga menyebabkan fibrin terurai dan juga mengakibatkan perdarahan saat
dilakukan terapi fibrinolitik. Tabel 2.1 memperlihatkan perbandingan antara t-PA dan
streptokinase dipandang sebagai preparat trombolitik.

Tabel 2.1 Perbandingan beberapa sifat streptokinase dan t-PA

SK t-PA
Selektif untuk bekuan fibrin +
Menurunkan kematian + +
Menimbulkan reaksi alergi +
Menyebabkan hipotensi +
Biaya untuk tiap perawatan $ 400 $ 2.900
Sumber Webb and Thompson, 1992. SK adalah streptokinase, dan t-PA adalah aktivator plasminogen
jaringan. Biaya perawatan dalam mata uang dolar Kanada.

Dari data di atas tampak bahwa kelemahan dari agen trombolitik yang digunakan saat ini
yaitu biaya pengobatan mahal dan efek samping dari penggunaan obat. Namun, kini tersedia
obat antitrombosis lain yang dapat digunakan untuk alternatif pengobatan. Obat-obat ini
merupakan golongan enzim fibrinolitik yang diisolasi dari berbagai jenis makhluk hidup
seperti lalat (Ahn et al., 2005), ular (Bolger, 2001), dan cacing tanah (Mihara, 1991;
Nakajima,1993) yang memiliki efek samping yang rendah dan harga yang murah.
5
2.1.1 Mekanisme pembekuan darah
Terdapat dua faktor yang menyebabkan pembekuan darah yaitu faktor instrinsik dan
ekstrinsik. Proses yang mengawali pembentukan bekuan fibrin sebagai respon terhadap
cedera jaringan dilaksanakan oleh lintasan ekstrinsik. Sedangkan lintasan instrinsik terjadi
karena pengaruh dari protein kolagen dan kalikrein di dalam tubuh (Bhagavan, 2002).
Lintasan ekstrinsik dan instrinsik menyatu dalam lintasan akhir yang sama yaitu pengaktifan
protrombin menjadi trombin (Gambar 2.1).


Gambar 2.1 Proses pembekuan darah
6

Lintasan intrinsik, ekstrinsik, dan lintasan terakhir melibatkan banyak macam protein (Tabel
2.2) yang dapat diklasifikasikan sebagai berikut: zimogen protease, kofaktor, fibrinogen,
transglutaminase, dan protein pengatur.
Tabel 2.2 Faktor pembekuan darah, nama umum, dan fungsi
Kategori dan faktor Nama umum Fungsi
Zimogen protease serin
Faktor XII Faktor Hageman Terikat dengan permukaan negatif
pada tempat pembuluh darah yang
mengalami cedera; diaktifkan oleh
kinogen dan kalikrein
Faktor XI Plasma Thromboplastin
Antecedent (PTA)
Diaktifkan oleh faktor XIIa
Faktor X Faktor Stuart-power Diaktifkan pada permukaan
trombosit aktif oleh kompleks tenase
(Ca
2+
, faktor VIIa dan IXa) dan oleh
faktor VIIa dengan adanya faktor
jaringan dan Ca
2+

Faktor IX Faktor antihemofilia B,
Christmas, komponen
tromboplastin plasma
(PTC)
Diaktifkan oleh faktor XIa dengan
adanya Ca
2+

Faktor VII Prokonventin, unsur
akselerator konversi
protrombin serum
(SPCA), kotromboplastin
Diaktifkan oleh trombin dengan
adanya Ca
2+

Faktor II Protrombin Diaktifkan pada permukaan
trombosit aktif oleh kompleks
protrombinase
Kofaktor
Faktor VIII Antihemofilia A, globulin
antihemofilia (AHG)
Diaktifkan oleh trombin; faktor
VIIIa merupakan kofaktor dalam
aktrivasi faktor X oleh faktor IXa
Faktor VI Proacelerin, faktor labil,
unsur globulin akselerator
atau (Ac-)
Diaktifkan oleh trombin; faktor VIa
merupakan kofaktor dalam aktivasi
protrombin oleh faktor Xa
Faktor III Faktor jaringan, Ca
2+

faktor-faktor ini biasanya
tidak disebut sebagai
faktor pembekuan
Glikoprotein yang diekspresikan
pada permukaan sel endotel yang
cedera atau distimulasi untuk
bekerja sebagai kofaktor bagi faktor
VIIa
Fibrinogen
Faktor I Fibrinogen Dipecahkan oleh trombin untuk
membentuk bekuan fibrin
Transglutaminase yang
bergantung-tiol

Faktor XIII Faktor penstabil fibrin
(FSF), fibrinoligase
Diaktifkan oleh trombin dengan
adanya Ca
2+
; menstabilkan bekuan
fibrin melalui ikatan silang kovalen
Protein pengatur dan
protein lain

7
Protein C Diaktifkan menjadi protein Ca
dengan pengikatan trombin menjadi
trombomodulin; kemudian
memecahkan faktor VIIIa dan Va
Protein S Bekerja sebagai kofaktor protein C;
baik protein yang mengandung
residu Gla (-karboksiglutamat)
Trombomodulin Protein pada permukaan sel endotel
mengikat trombin yang kemudian
mengaktifkan protein C
Sumber Murray et al.,1992.

Proses pembekuan darah ini merupakan mekanisme bertingkat yang melibatkan
kesinambungan pengaktifan faktor yang satu dengan yang lainnya. Pada tahap terakhir
trombin akan mengubah fibrinogen menjadi serat fibrin yang dapat menjaring platelet
trombosit, sel darah merah, dan plasma sehingga terbentuk bekuan darah. Fibrinogen (340
kDa) merupakan glikoprotein plasma yang bersifat dapat larut, terdiri atas tiga pasang rantai
polipeptida nonidentik, pada kedua rantainya terdapat fibrinopeptida yang mengandung
muatan negatif berlebihan yang turut memberikan sifat dapat larut. Benang fibrin merupakan
produk degradasi fibrinogen oleh trombin, yang masih memiliki 98% residu yang terdapat
dalam fibrinogen. Trombin menghidrolisis empat ikatan Arg-Gli diantara molekul-molekul
fibrinopeptida sehingga memungkinkan monomer fibrin mengadakan agregrasi spontan
dengan susunan bergiliran sehingga terbentuk bekuan fibrin yang tidak larut. Polimerisasi
fibrin terjadi akibat adanya ikatan hidrogen yang distabilkan oleh ikatan kovalen.
2.1.2 Mekanisme pencairan darah beku
Sistem koagulasi dalam tubuh seharusnya mengalami keseimbangan dinamis. Ketika bekuan
fibrin terus-menerus dibentuk, maka harus terdapat suatu proses untuk melarutkannya
kembali. Proses pelarutan benang-benang fibrin ini disebut fibrinolisis. Komponen penting
dalam proses fibrinolisis ini adalah plasmin. Plasmin dalam darah berada dalam bentuk
zimogen inaktif, yaitu plasminogen (90 kDa). Plasmin merupakan protease serin yang dapat
menguraikan benang fibrin dan fibrinogen. Plasmin yang terbentuk dengan jumlah kecil
dalam fase cair di bawah kondisi fisiologis akan dihilangkan aktivitasnya dengan cepat oleh
inhibitor plasmin, yaitu
2
-antiplasmin. Pada bekuan darah, plasminogen terikat dengan
fibrin, oleh karena itu plasmin yang terbentuk dapat terlindungi dari inhibitornya. Diperlukan
zat aktivator untuk mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin. Berbagai tipe zat aktivator
plasminogen ditemukan di sebagian besar jaringan tubuh dan semuanya memutuskan ikatan
Arg-Val dalam plasminogen untuk menghasilkan protease serin dua rantai yaitu plasmin.
8
Aktivator plasminogen jaringan (alteplase atau t-PA) merupakan protease serin dengan Mr
72 kDa. t-PA dilepas ke dalam sirkulasi darah pada saat luka atau tekanan, dan memiliki sifat
katalitik aktif bila terikat dengan fibrin. Setelah terikat dengan fibrin, t-PA memecah
plasminogen menjadi plasmin, selanjutnya plasmin mencerna fibrin hingga terbentuk produk
degradasi yang dapat larut. Tidak satu pun dari plasmin, plasminogen, dan aktivator
plasminogen yang dapat tetap terikat dengan produk penguraian ini sehingga semuanya akan
dilepas ke dalam media cair yang kemudian dihilangkan aktivitasnya oleh inhibitor alaminya
(Murray, 1992). Proses regulasi pencairan darah beku selengkapnya ditunjukkan pada
Gambar 2.2.


Gambar 2.2 Proses pencairan darah beku

2.2 Enzim fibrinolitik dari cacing tanah
Cacing tanah mampu menghasilkan protease yang dapat mendegradasi kasein, gelatin, dan
fibrin. Protease ini memiliki aktivitas fibrinolitik yang tinggi karena mampu mendegradasi
benang-benang fibrin yang berperan penting dalam pembekuan darah sehingga berpotensi
sebagai agen trombolitik. Dibandingkan dengan obat-obatan trombolitik yang sudah ada,
enzim fibrinolitik dari cacing tanah memiliki lebih banyak kelebihan seperti: murah, mudah
disimpan, dapat digunakan secara oral, tidak beracun, memiliki ketahanan tinggi, dan tidak
memiliki efek samping (Mihara et al., 1991; Nakajima et al., 1993).
Penelitian enzim fibrinolitik dari cacing tanah L. rubellus pertama kali dilakukan oleh
Mihara dan koleganya. Enzim ini kemudian dikenal dengan nama lumbrokinase. Selanjutnya
penelitian tentang enzim ini berlanjut pada spesies-spesies cacing tanah yang lain seperti: E.
fetida (Yang and Ru, 1997), L. bimastuss (Tao et al., 2005), Pheretima sp (Sahlan, 2002;
9
Hardiany, 2005), dan P. excavatus (Elyani, 2005; Fulyani, 2006). Lumbrokinase kini telah
dijual di daerah Jepang dan Korea.
2.2.1 Lumbrokinase
Riset mengenai enzim fibrinolitik dari cacing tanah dilakukan oleh Mihara dan koleganya
pada 1991. Penelitian ini menghasilkan suatu penemuan berupa adanya protease yang
memiliki aktivitas fibrinolitik pada cacing tanah L. rubellus. Enzim ini kemudian diberi
nama lumbrokinase sesuai dengan nama genus/marga cacing tanah yang digunakan.
Penelitian selanjutnya dilakukan oleh Nakajima dan koleganya pada tahun 1993 sampai 2003
yang berhasil mengklon gen pengode lumbrokinase untuk mengarakterisasi enzim ini lebih
lanjut.
Lumbrokinase pada L. rubellus disekresikan di daerah kerongkongan, tembolok, lambung,
dan bagian usus depan. Hal ini ditunjukkan oleh adanya zona bening pada piringan kaya
fibrin yang di atasnya diletakan potongan tubuh cacing tanah L. rubellus (Gambar 2.3).


Gambar 2.3 Aktivitas fibrinolitik cacing tanah
Potongan cacing tanah disimpan diatas piring fibrin yang mengandung plasminogen selama 18 jam
pada suhu 37
o
C. Sumber: Nakajima et al., 2003

Lumbrokinase merupakan kumpulan protein yang terdiri dari enam buah isoenzim. Enzim
homolog yang memiliki aktivitas fibrinolitik pada hasil filtrasi gel tersebut terdiri dari fraksi
pertama (F-I) yang terdiri dari 3 subbagian fraksi (F-I-0 , F-I-1, F-I-2), fraksi kedua (F-II)
dan fraksi yang ketiga (F-III) terdiri dari 2 subbagian F-III-1, F-III-2 (Mihara, 1991).
Masing-masing isoenzim merupakan rantai polipeptida tunggal dan bukan termasuk
glikoprotein. Keenam isoenzim memiliki berat molekul rata-rata 2330 kDa, dan nilai pI (pH
isoelektrik) 3,44,85. Keenam fraksi ini diinhibisi oleh inhibitor tripsin kedelai (SBTI) dan
10
diisopropilflorofosfat (DFP), yang menunjukkan bahwa enzim ini termasuk ke dalam
kelompok protease serin. Enzim ini memiliki aktivitas kaseinolitik sebaik aktivitas
fibrinolitiknya. Dari penelitian terhadap substrat ditunjukkan bahwa fraksi I dapat memotong
residu tirosin yang menunjukkan sifat mirip kimotripsin, fraksi III dapat memotong residu
arginin dan lisin yang menunjukkan sifat mirip tripsin, sedangkan untuk fraksi kedua (F-II)
yang semula diperkirakan tidak memiliki sifat mirip tripsin, kimotripsin, maupun elastase
(Mihara, 1991), ternyata mampu memotong residu valin, alanin, glisin, serin, histidin, dan
serin yang menunjukkan sifat mirip elastase (Nakajima, 2003).
Dibandingkan dengan protease serin yang umum digunakan seperti plasmin dan urokinase,
enzim ini memiliki sifat yang sama sekali berbeda. Hal ini ditunjukkan oleh banyaknya
residu aspartat dan arginin dan sedikitnya residu prolin dan lisin pada keenam isoenzim
tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa lumbrokinase termasuk ke dalam alkali protease serin
(Mihara, 1991). Kestabilan aktivitas enzim terhadap pH dan suhu dari lumbrokinase dapat
diperlihatkan oleh grafik berikut ini (Gambar 2.4 dan Gambar 2.5).

Gambar 2.4 Kurva kestabilan enzim pada berbagai suhu dan pH
Sumber: Mihara et al., 1991

11

Gambar 2.5 Kurva Aktivitas enzim pada berbagai pH
Sumber: Mihara et al., 1991

Pada Gambar 2.4 diperlihatkan bahwa aktivitas enzim stabil pada kisaran pH 210 saat suhu
37
o
C, sedangkan pada suhu 60
o
C aktivitas enzim stabil pada kisaran pH 69. Aktivitas enzim
tertinggi dicapai pada saat suhu 55
o
C. Akan tetapi, pada suhu tinggi (80
o
C), aktivitas enzim
sudah tidak ada sama sekali. Observasi terhadap pH optimum dilakukan terhadap aktivitas
fibrinolitik enzim pada piring fibrin berbagai pH. Gambar 2.5 menunjukkan pH optimum
enzim antara 7,4 dan 9. Tidak seperti enzim lain, pada lumbrokinase tidak ditemukan pH
optimum pada satu titik, sehingga disimpulkan bahwa enzim memiliki jangkauan pH yang
luas terhadap aktivitas optimumnya. Kisaran pH yang besar pada suhu tubuh 37
o
C
memungkinkan penggunaan lumbrokinase sebagai agen trombolitik yang digunakan secara
oral.
Kelebihan lain dari lumbrokinase adalah memiliki kestabilan penyimpanan yang sangat baik.
Aktivitas enzim lumbrokinase turun 20% setelah disimpan selama 5 tahun dalam bufer Tris-
Cl 0,1 mM pH 8 yang mengandung NaN
3
1% pada suhu ruang. Dari hasil di atas, dapat
disimpulkan bahwa enzim lumbrokinase dikategorikan sebagai enzim yang memiliki
toleransi yang tinggi terhadap panas, pH, dan lama penyimpanan. Lumbrokinase tahan
terhadap pelarut-pelarut organik seperti propanol, aseton, toluen, dan heksan serta detergen
dan NaCl (Nakajima, 2003). Hal ini memungkinkan lumbrokinase sebagai biokatalis dalam
media organik.
Enzim ini pun memiliki karakater berbeda dari agen trombolitik lainnya karena bekerja
hanya sebagai pendegradasi benang-benang fibrin saja, bukan sebagai aktivator
plasminogen. Hal ini ditunjukkan oleh tidak adanya perbedaan aktivitas fibrinolitik pada
piring fibrin yang bebas plasminogen dan kaya plasminogen (Nakajima, 2003). Dengan
12
demikian, penggunaan lumbrokinase tidak memiliki efek samping pendarahan yang lebih
lanjut.
2.2.2 Protease serin
Lumbrokinase merupakan enzim pendegradasi fibrin yang memiliki aktivitas seperti protease
serin. Protease serin adalah kelas enzim yang dapat memutuskan ikatan peptida pada protein.
Enzim ini memiliki sifat khas yaitu residu serin yang memegang peranan dalam proses
katalitik. Pada tubuh manusia, serin protease yang sering ditemui adalah keluarga mirip
kimotripsin dan keluarga mirip subsitilis. Terdapat tiga jenis protease serin yang termasuk ke
dalam enzim mirip kimotripsin yaitu kimotripsin, tripsin, dan elastase. Ketiganya merupakan
enzim yang disintesis oleh pankreas dan disekresikan oleh usus kecil. Enzim-enzim ini
memiliki struktur tiga dimensi yang identik dan memiliki residu aspartat, histidin, dan serin
sebagai tritunggal katalitik (Fersht, 2000). Perbedaan antara enzim-enzim ini terletak pada
daerah pemotongan substrat pada sisi karboksilat dari residu asam amino yang spesifik.
Kimotripsin memotong ikatan peptida pada sisi karboksilat dari residu asam amino
hidrofobik seperti fenilalanin, triptofan, dan tirosin. Tripsin memotong ikatan peptida pada
sisi karboksilat dari residu asam amino yang mengandung muatan positif, karena memiliki
residu asam aspartat yang mampu menarik muatan positif pada asam amino seperti arginin
dan lisin. Sedangkan elastase dapat memotong ikatan peptida pada residu asam amino netral
yang kecil seperti alanin, glisin, dan valin. Pada sisi katalitik elastase, kantong hidrofobik
pada sisi katalitik sebagian diisi oleh valin dan treonin sehingga menyebabkan tekanan
dalam kantong menjadi rendah, dan dapat mengakomodasi residu asam amino yang kecil.
Biasanya ketiga enzim ini bekerja bersama untuk mendegradasi protein-protein yang penting
dalam tubuh. Mekanisme reaksi kimotripsin ditunjukkan pada Gambar 2.6.

13


Gambar 2.6 Mekanisme katalitik kimotripsin
Sumber: http://www.umfiasi.ro/temp/mg/biochemie/rom/stud_files/imagini/emzyme/chymotrypsin3.gif

Reaksi kimotripsin dimulai dari pengikatan substrat polipeptida pada sisi aktifnya. Pada
kompleks enzim-substrat, ikatan peptida yang akan diputus berada pada orientasi yang tepat
di mana residu hidrofob spesifik dari substrat (R
2
) terikat pada daerah kantong hidrofob
enzim. Serangan nukleofilik atom oksigen dari gugus hidroksi residu serin ke atom karbon
karbonil dari ikatan peptida substrat mengakibatkan ikatan peptida ini putus membentuk dua
fragmen pendek. Satu fragmen berikatan asil dengan residu serin sedangkan fragmen lainnya
terlepas dari sisi katalitik enzim. Residu histidin mampu menarik air dan berikatan dengan
asilenzim sehingga menyebabkan ikatan fragmen substrat yang tersisa terputus dari residu
serin (Mathews et al., 2000).
14
2.3 Cacing tanah Perionyx excavatus
Perionyx excavatus merupakan salah satu spesies cacing tanah yang banyak ditemukan di
daerah tropis seperti Indonesia (Stephenson,1930). Taksonomi P. excavatus secara lengkap
adalah sebagai berikut (Smith, 1991):
Divisi : Annelida
Kelas : Chaetopoda
Subkelas : Oligochaeta
Bangsa : Haplotaxida
Subbangsa : Lumbricina
Suku : Megascolecidae
Marga : Perionyx Perrier
Jenis : Perionyx excavatus



Gambar 2.7 Cacing tanah P. excavatus

P. excavatus termasuk dalam golongan hewan tidak bertulang belakang yang memiliki
struktur tubuh bersegmen. Karakteristik yang khas dari cacing ini adalah tubuhnya yang
berwarna ungu tua dan kemerahan dan sifatnya yang agresif. Cacing ini memiliki panjang
tubuh 1018cm dan tebal 56 mm (Bhattacharjee and Chauduri, 2002).
Cacing tanah pada umumnya memiliki sistem organ reproduksi hermaprodit dimana organ
reproduksi jantan dan betina terdapat dalam satu tubuh cacing. Hal ini menyebabkan cacing
memiliki sistem reproduksi biparental (bereproduksi dengan sesama jenis cacing) dan
uniparental (bereproduksi tanpa kehadiran sesama jenisnya). Hasil reproduksinya adalah
15
kokon yang akan dikeluarkan melalui klitelium. Biasanya kokon tersebut akan menghasilkan
1 atau 2 cacing tanah. Masa pendewasaan cacing tanah memakan waktu minimal selama 3
minggu.
Sistem pernapasan dilakukan dengan mengabsorbsi oksigen oleh kelenjar mukus yang
terdapat pada seluruh permukaan tubuhnya. Untuk bergerak, cacing menggunakan setae atau
bulu halus yang terdapat diseluruh permukaan tubuhnya (Edward and Lofty, 1972). Sistem
pergerakan ini dinamakan gelombang peristaltik karena melibatkan penggembungan dan
pemampatan segmen-segmennya (Pechenik, 2005). Sistem pencernaan terbentang dari mulut
sampai anusnya. Cacing tanah menerima nutrisi sebagai makanan dari komponen-komponen
sederhana material organik seperti tanaman, protozoa, bakteri, dan jamur.
Pemeliharaan terhadap P. excavatus membutuhkan media yang mengandung bahan organik
seperti kotoran ternak dan sampah organik. Kotoran ternak yang paling baik digunakan
adalah kotoran babi dan sapi (Edwards et al, 1998). Kondisi media harus dijaga antara suhu
1525
o
C dengan rentang pH 67,4. Komposisi media dapat terdiri dari kotoran ternak 50%,
jerami 15%, serbuk gergaji 15%, kapur tembok 5% dan pakan tambahan yang berasal dari
sampah organik yang telah direndam selama 2 hari (Wallwork, 1920). Air merupakan
komponen penting dari pemeliharaan karena 85% tubuh cacing terdiri dari air. Oleh karena
itu, kelembaban media dijaga pada 4060%.
2.4 Pemurnian enzim
Ekstrak kasar enzim tidak dapat memberikan informasi yang tepat dan akurat tentang
karakteristik enzim tertentu. Hal ini disebabkan oleh banyaknya kandungan substansi dan
pengotor. Pemurnian enzim merupakan strategi yang dilakukan oleh banyak peneliti untuk
mendapatkan informasi tentang karakter enzim lebih tepat. Lima hal yang harus
dipertimbangkan untuk mencapai kesuksesan dalam pemurnian protein adalah: sensitifitas,
akurasi, presisi, kemampuan berinteraksi dengan substrat, dan harga (Deutscher, 1990). Hal
ini mempengaruhi pemilihan metode pemurnian yang digunakan terhadap suatu enzim.
Pada penelitian ini dilakukan pemurnian enzim sebagian yang meliputi pemekatan enzim
menggunakan amonium sulfat dan pemisahan enzim menggunakan kromatografi filtrasi gel.
2.4.1 Fraksinasi amonium sulfat
Amonium sulfat, (NH
4
)
2
SO
4
, telah lama digunakan dalam proses salting out yang bertujuan
untuk memekatkan maupun memurnikan enzim. Alasan penggunaan garam ini adalah karena
16
kelarutannya yang tinggi dalam air, tingkat inhibisi yang rendah pada sebagian besar enzim,
murah, dan dalam beberapa kasus memiliki efek penstabil enzim (Wiseman, 1986).
Kelarutan protein pada proses fraksinasi sangat bergantung pada kekuatan ionik dari
garamnya. Kekuatan ionik dari garam bertambah seiring dengan naiknya kadar garam.
Proses salting out terjadi ketika kadar garam yang ditambahkan cukup besar. Hal ini
menyebabkan molekul-molekul air yang berada di permukaan protein akan tertarik oleh ion-
ion garam sehingga protein menjadi tidak larut. Sisi hidrofob protein akan terekspos keluar
dan berinteraksi dengan sisi hidrofob protein lainnya membentuk agregat kemudian
mengendap. Protein satu dengan lainnya memiliki kelarutan yang berbeda-beda terhadap
konsentrasi garamnya. Hal inilah yang menjadi dasar dari pemurnian protein menggunakan
fraksinasi.
Lumbrokinase merupakan enzim berkomponen banyak yang dapat dimurnikan
menggunakan fraksinasi amonium sulfat 60% jenuh (Park et al., 1998). Berdasarkan
penelitian tersebut, lumbrokinase dari P. excavatus dipekatkan oleh amonium sulfat 60%
jenuh kemudian dilakukan pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatografi filtrasi gel.
2.4.2 Filtrasi gel
Metode kromatografi merupakan salah satu metode yang dapat digunakan dalam pemurnian
enzim. Berbagai jenis kromatografi seperti filtrasi gel, kromatografi penukar ion, affinitas,
dan interaksi hidrofobik telah banyak digunakan dalam proses pemurnian.
Salah satu metode kromatografi yang sering digunakan dalam pemurnian protein adalah
filtrasi gel. Filtrasi gel merupakan metode pemisahan protein berdasarkan bobot molekulnya.
Filtrasi gel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Fast Protein Liquid Chromatography
(FPLC). Matriks gel yang digunakan adalah Sephacryl S300HR yang dapat memisahkan
molekul protein berukuran 101500 kDa. Matriks gel ini berperan sebagai fasa diam yang
terbuat dari polisakarida dextran. Bufer digunakan sebagai fasa gerak yang berfungsi untuk
mengelusi sampel keluar dari kolom. Pemilihan bufer harus sesuai dengan sifat protein yang
diinginkan, sehingga protein tidak rusak selama proses pemurnian. Proses yang terjadi pada
filtrasi gel ini adalah pemisahan secara difusi dari molekul sampel diantara fasa gerak dan
ruang-ruang pori pada fasa diam. Protein dengan bobot yang kecil akan tertahan pada pori-
pori matriks sehingga protein dengan bobot molekul lebih besar akan keluar terlebih dahulu.
17
2.5 Uji aktivitas protease
Uji aktivitas enzim diperlukan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif pada enzim. Dalam
penelitian ini, analisis uji aktivitas enzim proteolitik protease pada enzim fibrinolitik dari
cacing tanah P. excavatus meliputi uji aktivitas fibrinolitik dan uji aktivitas azokaseinolitik.
Uji aktivitas fibrinolitik merupakan analisis kualitatif terhadap aktivitas enzim dalam
mendegradasi benang-benang fibrin pada koagulan darah manusia (Nakajima et al., 1993).
Pada uji aktivitas ini, koagulan darah diinkubasi bersama dengan enzim pada temperatur
ruang. Apabila koagulan tadi dapat mencair dengan adanya enzim, maka uji aktivitas
menunjukkan hasil yang positif terhadap adanya enzim fibrinolitik. Pengujian ini merupakan
cara visualisasi yang baik dan mudah dalam mengidentifikasi enzim fibrinolitik (Nurachman
et al., 2003).
Uji aktivitas azokaseinolitik digunakan sebagai analisis kualitatif dan kuantitatif pada enzim
fibrinolitik. Azokasein merupakan substrat protein kasein yang terikat pada gugus kromofor
azo. Substrat ini dapat digunakan untuk menguji aktivitas protease serin protease mirip
tripsin karena aktivitas proteolitik tripsin terhadap kasein. Ketika protease mampu
menghidrolisis azokasein, maka gugus kromofor azo (N=N) dapat terekspos keluar. Gugus
ini dapat memberikan absorbansi pada panjang gelombang 340 nm. Lumbrokinase
merupakan enzim mirip tripsin, kimotripsin, dan elastase yang termasuk dalam keluarga
serin protease sehingga metode uji aktivitas ini dapat digunakan (Mihara et al., 1991).
2.6 Elektroforesis SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan
suatu metode umum untuk mengidentifikasi protein dan hasil pemurnian protein berdasarkan
pemisahan berat molekul protein. Konsep dasar dari metode SDS-PAGE adalah
elektroforesis yang melibatkan pergerakan partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.
Kation akan bergerak ke arah katoda sedangkan anion akan bergerak ke arah anoda.
Kecepatan migrasi dari suatu protein akan bergantung pada kekuatan medan listrik dan
muatan proteinnya. Pemisahan elektroforesis pada SDS-PAGE berlangsung pada medium
gel poliakrilamid yang tipis, terbentang secara vertikal sehingga molekul dapat bergerak dari
atas ke bawah. Gel poliakrilamid terbentuk dari hasil polimerisasi akrilamid dan ikatan
silang oleh metilenbisakrilamid (Berg et al., 2002). Gel ini dipilih karena sifatnya yang inert
dan mudah terbentuk.
Protein dapat bergerak ke arah suatu kutub apabila dilingkupi oleh muatan listrik yang sama.
Oleh karena itu, dilakukan pendenaturasian protein terlebih dahulu oleh detergen SDS
18
(Sodium Dodecyl Sulphate) yang bermuatan negatif sebelum memasuki matriks gel. SDS
mampu membuka struktur protein dengan memutuskan ikatan nonkovalen pada protein
sehingga protein berada dalam keadaan rantai tunggal saja. Pendenaturasian protein dibantu
pula oleh merkaptoetanol yang dapat memutuskan ikatan sulfida. Anion dari SDS akan
berikatan dengan rantai tunggal protein dengan rasio perbandingan satu SDS mengikat dua
residu asam amino. Komplek SDS dengan denaturan protein yang bermuatan negatif akan
bergerak ke arah anoda pada proses elektroforesis. Protein yang berukuran lebih kecil dari
pori-pori gel akan cepat bermigrasi sedangkan protein yang berukuran besar akan lebih lama
tertahan pada gel. Dari metode ini bobot molekul dapat diidentifikasi karena protein berada
pada keadaan struktur primernya.
Setelah proses elektroforesis selesai, gel diwarnai oleh metode pewarnaan menggunakan
perak. Sistem pewarnaan ini lebih sensitif dibandingkan dengan sistem pewarnaan dengan
reagen pewarna seperti Coomassie blue. Batas deteksi protein menggunakan Coomassie blue
adalah ~0,1 g sedangkan menggunakan Ag adalah ~0,02 g (Berg et al., 2002). Selain itu,
proses pewarnaan pada Coomassie blue yang dapat berlangsung selama 24 jam, sedangkan
pewarnaan dengan perak hanya memakan waktu sekitar 2 jam. Pewarnaan menggunakan
metode perak meliputi beberapa tahap yaitu: 1) Fiksasi yang berfungsi untuk mengeluarkan
ion pengganggu dan detergen dari gel dan juga membantu pencegahan protein keluar dari
matrik gel; 2) Pemekaan, berfungsi untuk meningkatkan kepekaan dan kekontrasan pada
pewarnaan; 3) Pencucian, berfungsi untuk mengeluarkan sisa zat pemekaan dan rehidrasi gel
untuk tahap berikutnya; 4) Pewarnaan, berfungsi untuk mengikatkan ion Ag
+
ke protein dan
membentuk bakal gambar; 5) Pencucian kembali untuk mengeluarkan kelebihan pewarna; 6)
Pengembangan, berfungsi untuk mereduksi ion perak menjadi perak sehingga menimbulkan
warna metalik pada pita protein; dan 7) Pemberhentian, berfungsi untuk mengkompleksan
perak bebas dengan EDTA sehingga mencegah reduksi lanjutan.