Anda di halaman 1dari 13

Laporan Praktikum KI2221 Pemisahan dan Elektrometri Percobaan 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Nama NIM Kelompok Tanggal Percobaan Tanggal Pengumpulan Asisten, NIM

: Airlangga Diandra Putra : 10512038 : 4 : 22 April 2014 : 29 April 2014 : Kurniawan

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2014

Modul 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

I.

Tujuan Percobaan Menentukan konsentrasi kafein dalam sampel kopi dan teh

II.

Teori Dasar Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan berdasarkan partisi senyawa analit terhadap fasa diam dan fasa gerak. Metoda kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) merupakan metoda kromatografi dimana digunakan tekanan yang tinggi untuk mendorong pelarut (fasa gerak) menuju suatu kolom (fasa diam) yang berisi partikel-partikel pengemasnya. Kafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak dari sampel ke pelarut yang lebih non-polar. Tetapi, apabila fasa diam yang digunakan bersifat non-polar dengan fasa gerak yang polar, ekstrasi tersebut tidak perlu dilakukan. Pada monitor kromatogram akan terbentuk dimana tingginya berbanding lurus dengan konsentrasi kafein, sehingga konsentrasinya dapat ditentukan.

III.

Alat dan Bahan a. Bahan 1. Larutan standar kafein 500 ppm 2. Larutan asam fostfat 5% 3. Metanol(aq) 4. Aqua Bidest 5. Produk minuman ber-kafein 6. Aqua DM b. Alat 1. Gelas kimia 2. Gelas ukur 3. Pipet tetes 4. Instrumen HPLC 5. Labu takar 6. Syringe 7. Ultrasonic Bath

IV.

Cara Kerja Dimasukkan 140 mL Aqua Bidest ke dalam gelas kimia lalu ditambahkan 1.4 mL H3PO4 5% dan 60 mL metanol, dihilangkan gas terlarut dengan ultrasonic bath. Dibuat 5 mL larutan standar kafein 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm dari larutan standar kafein 500 ppm dengan eluen sebagai penanda-batas pada labu takar. Dilarutkan sampel serbuk kopi dan teh celup dalam air dan dipanaskan dilanjutkan dengan pengenceran hingga 25 mL (eluen sebagai penanda-batas). Dilakukan analisis terhadap kelima larutan standar kafein dan terhadap kedua sampel dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Dilakukan pembilasan terhadap syringe dan tempat injeksi syringe yang akan dipakai terlebih dahulu menggunakan aqua DM dan larutan yang akan diuji. Ditentukan waktu retensi dari larutan analit dan ditentukan konsentrasi kafein di dalam sampel.

V.

Data Pengamatan Fasa diam Panjang kolom Ukuran partikel Fasa gerak Laju alir Volum injeksi Tekanan gas Panjang gelombang UV : C-18 : 12.5 cm : 5.0 m : Metanol-air (65%-35%) : 1.0 mL/menit : 20.0 L : 180.0 barr : 280.0 nm

1. Larutan standar kafein 20 ppm

Puncak ke1 2 3

tr (menit) 0.994 1.179 1,348 Total

Tipe Puncak BB BV VB

w (menit) 0.0873 0.1225 0,0813

Luas area (mAU*s) 22.19830 34.01767 919,20111 975.41708

Tinggi puncak (mAU) 3.53165 3.59002 174,96242 182.08409

%Luas area 2.2758 3.4875 94,2367

2. Larutan standar kafein 40 ppm

Puncak ke1 2 3

tr (menit) 0.998 1.182 1.350 Total

Tipe Puncak BB BV VB

w (menit) 0.0744 0.1188 0.0819

Luas area (mAU*s) 16.58859 39.20728 1758.28345 1814.07932

Tinggi puncak (mAU) 3.10160 4.36484 331.32278 338.78922

%Luas area 0.9144 2.1613 96.9243

3. Larutan standar kafein 60 ppm

Puncak ke1 2 3

tr (menit) 1.000 1.186 1.352 Total

Tipe Puncak BB BV VB

w (menit) 0.0713 0.1161 0.0813

Luas area (mAU*s) 16.16898 41.82574 2363.00488 2420.99960

Tinggi puncak (mAU) 3.29210 4.68939 449.92599 457.90749

%Luas area 0.6679 1.7276 97.6045

4. Larutan standar kafein 80 ppm

Puncak ke1 2 3 4

tr (menit) 0,772 1,000 1,186 1,352 Total

Tipe Puncak BV VB BV VB

w (menit) 0,1213 0,0677 0,114 0,0804

Luas area (mAU*s) 103,18629 19,324430 42,561270 3222,92432 3387,99631

Tinggi puncak (mAU) 12,12074 4,197310 4,894970 622,59247 643,80538

%Luas area 3,0456 0,5704 1,2562 95,1277

5. Larutan standar kafein 100 ppm

Puncak ke1 2 3

tr (menit) 1.002 1.190 1.353 Total

Tipe Puncak BB BV VB

w (menit) 0.0616 0.1105 0.0809

Luas area (mAU*s) 13.85685 46.66743 4358.54736 4419.07164

Tinggi puncak (mAU) 3.257185 5.526670 834.61401 843.39787

%Luas area 0.3136 1.0560 98.6304

6. Larutan sampel teh

Puncak ke1 2 3

tr (menit) 1.114 1.353 1.608 Total

Tipe Puncak BV VV VB

w (menit) 0.5172 0.0890 0.3159

Luas area (mAU*s) 5794.49609 3728.34521 1282.31665 1.08052-E4

Tinggi puncak (mAU) 548.89172 630.58948 55.848860 1235.33006

%Luas area 53.6271 34.5052 11.8676

7. Larutan sampel kopi

Puncak ke1 2 3 4 5 6

tr (menit) 1.148 1.350 1.525 1.744 2.531 2.698 Total

Tipe Puncak BV VV VB BB BV VBA

w (menit) 0.1204 0.0879 0.0924 0.0878 0.0974 0.1792

Luas area (mAU*s) 1.27686-E4 1.01700-E4 686.20221 137.87712 42.105380 166,94238 2.39717-E4

Tinggi puncak (mAU) 1544.72083 1800.25854 110.51438 25.199636 6.513920 14.84260 3502.04963

%Luas area 53.2653 42.4250 2.86260 0.57520 0.17560 0.69640

VI.

Pengolahan Data 1. Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar kafein [Kafein] (ppm) 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Luas area (mAU*s) 919.201110 1758.28345 2363.00488 3222.92432 4358.54736 Tinggi puncak (mAU) 174.96242 331.32278 449.92599 622.59247 834.61401

Kurva kalibrasi luas vs konsentrasi kafein


4650

Luas area (mAU*s)

3900 3150 2400 1650 900 20 40

y = 41.717x + 21.392 R = 0.9886

60

80

100

Konsenrasi kafein (ppm)

Kurva kalibrasi tinggi vs konsentrasi kafein


850

Tinggi puncak (mAU)

750 650 550 450 350 250 150 20 40

y = 8.0529x - 0.4883 R = 0.9897

60

80

100

Konsentrasi kafein (ppm)

2. Penentuan konsentrasi kafein dalam sampel teh dan sampel kopi Sampel Teh Kopi Luas area (mAU*s) 3728.34521 10170.0000 Tinggi puncak (mAU) 630.589480 1800.25854

a. Berdasarkan luas kromatogram y Teh = 41.717x + 21.392 ; (y adalah luas puncak, x adalah konsentrasi kafein) 3728.34521 = 41.717 [Kafein] + 21.392

[Kafein]sampel = 88.8595 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 88.8595 ppm x 5 = 444.2975 ppm Kopi 10170.0000 = 41.717 [Kafein] + 21.392 [Kafein]sampel = 243.2727 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 243.2727 ppm x 5 = 1216.3635 ppm b. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram y Teh = 8.0529x - 0.4883 (y adalah tinggi puncak, x adalah konsentrasi kafein) 630.589480 = 8.0529 [Kafein] - 0.4883

[Kafein]sampel = 78.3665 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 78.3665 ppm x 5 = 391.8326 ppm Kopi 1800.25854 = 8.0529 [Kafein] - 0.4883 [Kafein]sampel = 223.6147 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 223.6147 ppm x 5 = 1118.0735 ppm Konsentrasi kafein1 (ppm) 444.2975 1216.3635
1 2

Sampel Teh Kopi Keterangan.

Konsentrasi kafein2 (ppm) 391.8326 1118.0735

Pengukuran berdasarkan luas kromatogram Pengukuran berdasarkan tinggi puncak kromatogram

VII.

Pembahasan Pada percobaan kali ini, dilakukan penentuan kadar kafein di dalam larutan sampel teh dan sampel kopi dengan metoda pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Metoda kromatografi ini merupakan analisis kualitatif sekaligus kuantitatif, dengan variabel kualitatifnya adalah waktu retensi dari sampel. Prinsip kerja dari HPLC adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya yan berupa pelarut agar dapat melewati fasa diam yang berupa kolom berisikan partikel pengemas. Pada percobaan ini digunakan HPLC dengan jenis fasa terbalik, yaitu fasa diamnya nonpolar (C-18) dan fasa geraknya polar (metanol:air = 65:35). Pada instrumen HPLC, pelarut-pelarut harus dihilangkan komponen gasnya untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung, dan penghilangan ini dapat dilakukan menggunakan ultrasonic bath. C-18 merupakan senyawa silika yang pada permukaannya diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar. Komposisi metanol-air yang digunakan sebagai eluen dipilih 65-35 dikarenakan komposisi tersebut yang memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan waktu analisis yang sesebentar mungkin (dengan pembanding hasil percobaan pada komposisi lain). Metoda peng-elusi-an analit yang dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu komposisi eluen yang dipakai selama proses elusi adalah tetap (65-35), tidak berubah, sedangkan metoda elusi lainnya adalah elusi gradien, komposisi eluen berubah selama proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan memiliki retensi yang besar, sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar dibandingkan dengan air, pelarutpelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah dibandingkan pelarut organik lain dan tidak terlalu berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Pada percobaan ini digunakan metoda elusi isokratik dikarenakan sudah diketahui bahwa komponen penyusun sampel tidaklah terlalu banyak sehingga tidak perlu dilakukan pemisahan yang banyak dengan metoda elusi gradien. Suatu komponen dapat terpisah dari komponen penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan interaksi antara komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang dimaksudkan dalam HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu senyawa memiliki sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan untuk dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen akan lebih

terlarut dalam satu fasa yang kepolarannya lebih mendekati dibandingkan fasa yang lainnya. Kafein merupakan komponen yang ingin dipisahkan, komponen ini memiliki sifat yang polar, maka dari itu digunakan HPLC fasa terbalik yang tujuannya mempercepat waktu analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam fasa diam dan akan memiliki waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen lainnya yang lebih bersifat non-polar namun akan memiliki waktu retensi yang lebih besar dibandingkan komponen lainnya yang bersifat lebih polar dibandingkan kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung kepada: tekanan yang digunakan (mempengaruhi laju alir pelarut); sifat fasa diam (komponen dan ukuran partikel); komposisi pelarut; dan suhu kolom. Detektor yang digunakan pada instrumen HPLC kali ini adalah

spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan pada aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan dari berkas cahaya, maka dapat didapatkan pembacaaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada saat itu. Pelarut yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan menyerap sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spektrum UV. Metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm. Sehingga jika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit. Output akan direkam sebagai rangkaian puncak, masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas puncak dapat digunakan untuk mengukur jumlah dari senyawa ini. Konsentrasi kafein dalam percobaan ini ditentukan dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian larutan standar sebagai pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh berdasarkan perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi kromatogram dapat disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga mempengaruhi tekanan dalam kolom.

VIII.

Kesimpulan Konsentrasi kafein dalam sampel teh dan kopi berdasarkan hasil kurva dari luas area kromatogram adalah 444.2975 ppm dan 1216.3635 ppm dan dari tinggi puncak kromatogram sebesar 391.8326 ppm dan 1118.0735 ppm.

IX.

Daftar Pustaka www.scimedia.com/chem-ed/sep/lc/hplc.htm, diakses 21/04/2014 20:37 WIB http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_uv.html, diakses 22/04/2014 21:31 WIB www.sciencelab.com/msdsList.php, diakses 19/04/2014 15:11 WIB www.chem-is-try.org/materi_kimia, diakses 19/04/2014 15:18 WIB