Ekspresi gen

(DNA RNA Protein)

Struktur DNA
Ujung 5 rantai Basa-basa Ujung 3 rantai

Ujung 5 rantai Ikatan hidrogen

ikatan fosfodiester Ujung 3 rantai

Perbedaan struktur RNA dengan DNA

Figure 6-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Dogma sentral biologi molekuler

molecularstation.com, 14-08-2010

Ekspresi gen

Penyimpanan informasi

Penggunaan informasi

Urutan nukleotida gen Urutan nontemplate strand

Efisiensi ekspresi gen berbeda-beda

Figure 6-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Sintesis RNA

RNA polimerase

Holoenzim : RNA polimerase dengan subunit yang lengkap

Core-enzyme :RNA

polimerase tanpa subunit

8

Inisiasi transkripsi (I)

Tidak perlu primer Faktor mengenali promoter

Figure 6-11 (part 1 of 7) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Inisiasi transkripsi (2)

Kedua untai DNA terpisah Sintesis RNA dimulai Setelah ~ 10 nt, faktor lepas

Terminasi transkripsi

RNA pol mencapai terminator RNA pol lepas

Figure 6-13 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Promoter prokariot

Promoter inti (core promoter) : -10 pb dan -35 pb Elemen UP (UP element) :

Tempat Fis (Fis sites) :

terdapat antara -40 pb s/d -60 pb. meningkatkan proses transkrpsi 30 kali lebih banyak. Menentukan pelekatan protein aktivator transkripsi

rrn13 B

Faktor sigma bakteri

Holoenzim RNA polimerase bakteri 2 Faktor digunakan untuk mengekspresi sekelompok gen secara serentak Faktor Berperan mengenali promoter dari gen Terdapat beberapa macam faktor sigma Masing-masing mengenali promoter yang berbeda

14

Faktor sigma alternatif

Kejutan panas pada E. coli Suhu naik, protein heat shock (hsp) disintesis ( 17 protein) Promoter 70 (standard) TTGAA(16-18).TATAAT Promoter 32 (hsp) T-C-C-C TTGAA(13-15)CCCAT-TSporulasi pada Bacillus subtilis Kondisi lingkungan tidak menguntungkan, terjadi sporulasi Gen-gen untuk pertumbuhan vegetatif inaktif Gen-gen untuk pembentukan spora menjadi aktif akibat aktifnya faktor-faktor sigma baru

15

Terminasi transkripsi

Ada dua jenis terminasi

Terminasi yang tidak tergantung Rho (Rho-independent) Terminasi yang tergantung Rho (Rhodependent)

Rho adalah protein yang berperan dalam proses terminasi transkripsi gengen E. coli dan Phage nya
16

Terminasi yang tidak tergantung Rho (Rho-independent)

Mekanisme terminasi membutuhkan struktur hairpin dan diikuti dengan poly(A) Struktur hairpin diduga merupakan faktor yang dapat menarik RNA keluar dan ikatan antara A-U (DNA-RNA) yang lemah dapat lepas
17

Model terminasi transkripsi tidak tergantung rho

18

Model terminasi transkripsi tergantung rho

Rho merupakan protein dengan 6 subunit yang memiliki aktivitas ATPase sehingga Rho dapat bergerak 5 3 Ketika RNA Pol sampai pada terminator

Sintesis RNA berhenti (ketika hairpin disintesis) Rho tiba di RNA pol Rho melepaskan RNA dari hibrid DNA-RNA dengan aktivitas helikase yang dimilikinya
19

Synthetic Biology

Biological Components:

1-Parts

Ekspresi gen dari promoter yang kuat dan dapat diregulasi

Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling penting Dikontrol oleh promoter dari gen Dua sifat penting dari promoter Kuat Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase Ikatan kuat sering ditranskripsi Ikatan lemah RNA polimerase lepas tidak ada transkripsi Dapat diregulasi Kapan gen diekspresi dapat dikontrol gunakan induser / ko-represor
21

Promoter yang penting dalam bioteknologi

lac (atau lacUV5) trp tac (atau trc) pL dari fag l gen 10 dari fag T7

22

Promoter lac

operon lac Regulasi negatif represor lac terikat operator induser terikat represor - represor tidak berfungsi Induser = allolaktosa, IPTG Regulasi positif Operon lac dikontrol juga oleh aktivator CAP - catabolite activator protein CAP saja tidak berfungsi Kompleks CAP-cAMP berfungsi
23

Promoter trp

Dari operon triptofan E. coli Dikontrol oleh represor trp - ko-represor (triptofan) represor yang disintesis dalam bentuk tidak berfungsi Kompleks represor-ko-represor dapat berfungsi
Hanya represor Represor + ko-represor (trp) Gen diekspresi Gen tidak diekspresi

24

Promoter tac dan trc

Hibrid dari promoter lac dan trp daerah -35 dari trp daerah -10 dari lac terpisah 16 pb = promoter tac terpisah 17 bp = promoter trc 3x lebih kuat dari trp 10x lebih kuat dari lac

25

Promoter l pL

promoter pL diregulasi oleh represor l represor l dikode gen cI Digunakan gen cI mutan Mutasi kondisional Mutan sensitif suhu 28-30C = suhu permisif fenotipe normal Tidak ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI 42C = suhu restriktif mutan 26 ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI

Regulasi oleh promoter pL

A) 30C protein cI aktif mRNA

pcI

cI

oL

pL

gen target
27

Regulasi oleh promoter pL

B) 42C protein cI aktif

protein cI tidak aktif

mRNA

pcI

cI - ts

oL

pL

gen target
28

Promoter gen 10 fag T7

Semua promoter fag T7 (termasuk gen 10) memerlukan RNA Polimerase T7 untuk ekspresinya

Letakkan gen RNA Pol T7 di bawah kontrol promoter lac dalam sel E.coli Letakkan Gen target di bawah kontrol promoter gen 10
29

Promoter gen 10 fag T7

Induser
RNA Pol

T7

pro lac Gen RNA Pol T7 Protein target

T7 RNA Pol

pro g10

Gen target
30

Promoter gen 10 fag T7

Ekspresi gen RNA polimerase T7 dikontrol oleh induser operon lac

Laktosa (allolaktosa) ATAU IPTG (iso-propil thio galaktosida) Tidak dimetabolisasi seperti laktosa Tidak dipotong oleh b-galaktosidase

31

Promoter bocor

Beberapa promoter tidak diinaktifkan secara tuntas masih ada ekspresi yang rendah Disebut bocor (LEAKY) Dapat disebabkan oleh mutasi pada represor atau urutan DNA operator atau faktor lain Dapat disebabkan oleh jumlah kopi promoter vs. Gen represor Gen pada plasmid multikopi dikontrol oleh represor yang dikode oleh satu kopi gen pada kromosom

Untuk promoter lac multikopi yang bocor q Letakkan di dalam sel dengan mutasi lacI q lac I merupakan mutasi pada promoter gen lac I Menyebabkan produksi protein represor Lac I yang tinggi akibat peningkatan transkripsi

32

pAV10 dengan promoter Tn5

Tn5 promoters: facilitate transcription in a wide range of bacterial hosts

33

Yang mempengaruhi kekuatan promoter

Sequence

Daerah -10: Daerah -35: Spacer antara daerah -10 dengan daerah 35:

Daerah -20 s/d -13 promoter lac yang kaya GC diganti dengan sequence yang kaya AT, transkripsi meningkat 8 x

34

Translasi: biosintesis protein

(RNA Protein)

Proses translasi

Inisiasi memerlukan:

Subunit ribosom yang bebas Faktor inisiasi

36

Arah sintesis protein

Sintesis polipeptida dimulai dari ujung N ke arah ujung C

37

Enzim aminoasil-tRNA sintetase mempunyai sisi pengikatan spesifik untuk asam amino dan tRNA

38
Figure 6-58 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

38

Inisiasi translasi bakteri

Ribosom terikat pada urutan spesifik pada mRNA: urutan Shine Dalgarno / ribosome binding site (rbs) Urutan komplementer dengan 16S rRNA dari subunit kecil ribosom
UAAGGAGG AUUCCUCC 3 AUG 3

mRNA
5

16S rRNA 5
39

small ribosomal subunit

Terminasi translasi

40
Figure 6-74 (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

40

Faktor pelepasan

Prokariot

RF1 RF2 RF3

: UAA, UAG : UAA, UGA : protein pengikat GTP yang membantu pengikatan RF1 & RF2 ke ribosom

41

Kodon

Urutan kodon pada mRNA

Tidak tumpang tindih Tidak ada loncatan

Kodon terdiri dari tiga nukleotida Kodon degenerate

Satu asam amino dapat dikode oleh lebih dari satu kodon

Kode genetik hampir universal

42

Kode genetika

43
Figure 6-50 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

43

Start kodon bakteri

> 90% = ATG Bisa juga: TTG, GTG, CTG (semua mirip ATG dan mengkode fmet) Untuk memastikan bahwa kodon di atas adalah start kodon, cari urutan yang mirip dengan SD/rbs (AGGAGGA) ~ 7 sampai 13 nt sebelah hulunya

GTAACGAGGATAATGGAATG

http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm, 17-08-10)

44

Table 18.1

45

Tiga macam kerangka baca pada mRNA

46
Figure 6-51 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

46

Kontrol ekspresi gen

Operon, atenuasi, perubahan faktor sigma Vektor ekspresi pada E.coli

47

Kontrol ekspresi gen dapat terjadi pada tahap:

Transkripsi Stabilitas mRNA Pemrosesan mRNA pada eukariot Translasi

48

Kontrol ekspresi gen bakteri pada tahap transkripsi

Operon

protein represor dan aktivator Transkripsi dapat terhenti lebih awal akibat adanya atenuator (terminator) di sebelah hulu (5) gen Beberapa kondisi lingkungan memerlukan perubahan pola ekspresi gen secara keseluruhan

Atenuator

Faktor sigma alternatif

49

Operon

Gen-gen yang diperlukan untuk fungsi tertentu akan diekspresi bersamaan Operon

Regulasi transkripsi sekelompok gen pada prokariota Dari satu promoter akan ditranskripsi satu mRNA yang mengandung > 1 gen (polycistronic)
Operon lac : Gen-gen untuk penggunaan laktosa Operon trp : Gen-gen untuk sintesis triptofan
50

Contoh

Komponen suatu operon

Trans acting (gen, tidak harus ada dalam DNA yang sama)

Gen struktural

Gen regulator

Gen yang mengkode protein/RNA Gen struktural yang mengkode protein yang meregulasi ekspresi gen lain Terikat pada DNA pada sisi spesifik Represor: protein regulator yang bila terikat pada DNA, tidak terjadi transkripsi Aktivator: protein regulator yang harus terikat pada DNA agar dapat terjadi transkripsi

Cis acting (elemen genetik, harus ada dalam DNA yang

sama)

Promoter: Tempat pengikatan RNA polimerase Terminator: Tempat terminasi transkripsi Operator: Tempat pengikatan represor

51

Kontrol positif dan negatif

52

Operon lac

Kontrol negatif

Represor lac menghambat operon apabila tidak ada laktosa Aktivator lac mengaktifkan operon apabila tidak ada glukosa

Kontrol positif

Ada glukosa dan laktosa dalam medium pertumbuhan 53

Kontrol negatif operon lac

54

Kontrol positif pada operon lac

Diatur oleh catabolite activator protein (CAP) bersama cAMP [cAMP] turun bila ada glukosa

55

Operon lac: aktivator

Kontrol positif: bila aktivator terikat DNA, baru terjadi transkripsi

Tidak ada glukosa ATP menjadi cAMP cAMP terikat CAP (catabolite activator protein) CAP terikat DNA transkripsi Ada glukosa CAP tidak dapat terikat DNA tidak terjadi transkripsi

56

Pengikatan represor LacI pada operator lac

Operator

Masing-masing dimer represor terikat pada 1 operator Tingkat represi dipengaruhi oleh jumlah operator

berbentuk palindrom (pengulangan terbalik) Ada > 1 operator Afinitas dengan represor tinggi O1 = -7 s/d +29 (axis simetri +11) Afinitas dengan represor rendah (pseudo-operator) O2 = +410; O3 = -83)

Pengikatan represor pada operator

Tidak ada O2 atau O3 : represi menurun 2-4 x Tidak ada O2 dan O3 : represi menurun 100 x

Memperkuat pengikatan RNA pol (kompleks tertutup) Mencegah RNA pol menginisiasi transkripsi Represor lepas, transkripsi langsung dimulai (kompleks terbuka)
57

Operator lac

Operator = palindrom

58

Pengaruh ketiga operator terhadap represor

Represi = rasio aktivitas galaktosidase dengan dan tanpa induser

59

Regulasi operon lac

60

Operon triptofan E. coli

Promoter trp Dikontrol oleh represor trp - ko-represor (triptofan) represor yang disintesis dalam bentuk tidak berfungsi kompleks represor-ko-represor dapat berfungsi
Hanya represor Represor + ko-represor (trp) Gen diekspresi Gen tidak diekspresi

61

62

63

Kontrol translasi

Ribosome Binding Site (RBS)

RBS Kuat: interaksi kuat dengan ribosom, lebih sering ditranslasi RBS lemah: interaksi lemah dengan ribosom, lebih jarang ditranslasi

Fungsi rbs dipengaruhi juga oleh sequence gen

bila terbentuk struktur sekunder antara gen dengan rbs, gen tidak akan ditranslasi

64

RBS calculator

Menentukan perbedaan energi bebas antara struktur sekunder mRNA dengan mRNA yang telah terikat ribosom Korelasi antara hasil prediksi dengan hasil observasi belum cukup tinggi
65

Pustaka

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter P. (2008) Molecular Biology of the Cell, 5th ed., Garland Science, N.Y.