BAB 3 PEMERIKSAAN LABORATORIUM

Pemeriksaan mikrobiologi merupakan pemeriksaan yang sangat penting dalam membantu penegakkan diagnosis penyakit infeksi. Praanalitik pemeriksaan mikrobiologi ditentukan dari pengambilan spesimen yang benar meliputi pemilihan wadah spesimen, jenis spesimen, cara pengambilan spesimen, volume spesimen, dan pengiriman spesimen secara benar. Kesalahan pada waktu

praanalitik akan menyebabkan kuman gagal tumbuh, tumbuhnya flora normal, atau kuman kontaminan (Indrasari, 2 !2". 3.1.1 Persiapan dan Penanganan Sampel (Indrasari, 2 !2" #erikut adalah syarat pengambilan spesimen secara khusus$ %. #iakan &putum &putum diproses di laboratorium untuk mengetahui kuman penyebab infeksi pada saluran pernafasan bawah. Pasien dianjurkan untuk menyikat gigi dan berkumur sebelum pengambilan sputum untuk mengurangi kontaminasi spesimen. Pengambilan sampel dari sputum pagi hari lebih dianjurkan karena semalaman sputum terkumpul sehingga konsentrasi kuman menjadi lebih banyak, apabila tidak memungkinkan diperoleh sampel pagi hari maka sampel sewaktu juga dapat diterima. 'adah spesimen sputum harus bersih, bermulut lebar, terbuat dari plastik, tidak mudah pecah dan bocor, serta bertutup ulir. #erikut adalah cara pengambilan sputum$ ( pasien disuruh berkumur(kumur tiga kali dengan air minum. !)

pasien disuruh menarik nafas dalam(dalam dan menghembuskannya sebanyak tiga kali berturut(turut lalu dibatukkan dahak*sputum kedalam wadah sputum. +langi prosedur ini sehingga diperoleh 2(, sendok makan dahak*sputum.

wadah ditutup dan dikencangkan tutup ulirnya agar tidak bocor atau tumpah.

( (

wadah diberi label. segera dikirim ke laboratorium.

#. #iakan -arah -arah dalam keadaan normal bersifat steril. &pesimen untuk pemeriksaan biakan darah adalah whole blood. 'adah spesimen biakan darah komersial kini tersedia dalam berbagai jenis untuk dewasa atau pediatrik, biakan aerob dan anaerob. #eberapa hal yang harus diperhatikan dalam pengambilan spesimen biakan darah adalah$ ( spesimen darah diambil pada tahap awal penyakit karena jumlah kuman dalam darah lebih tinggi pada saat akut atau tahap awal penyakit. ( spesimen darah sebaiknya diambil pada saat demam*suhu tinggi karena jumlah kuman dalam darah akan lebih banyak pada suhu tinggi. ( pengambilan spesimen sebaiknya diambil sebelum mendapat antibiotik karena . / biakan akan positif. ( volume darah yang dibutuhkan pada neonatus adalah ,0 m1 ( ! m1, anak(anak 2 m1 ( 0 m1, dewasa 0 m1 2 2 m1. 3umlah kuman dalam

!.

darah anak(anak biasanya lebih tinggi dibandingkan dengan dewasa sehingga spesimen darah yang diambil lebih sedikit daripada dewasa. ( spesimen darah sebaiknya diambil paling sedikit dua set dengan jarak ! menit dan lokasi pengambilan yang berbeda. 4. #iakan 4airan 5ubuh 4airan tubuh seperti cairan pleura, cairan otak, dan cairan sendi dalam keadaan normal bersifat steril dan dalam jumlah terbatas. &pesimen biakan cairan tubuh dapat diperoleh melalui pungsi pleura, pungsi asites, pungsi cairan sendi, dan pungsi lumbal pada keadaan dugaan terjadi infeksi. &ebelum dilakukan pungsi cairan tubuh selalu dilakukan tindakan asepsis terlebih dahulu. &pesimen cairan tubuh ditampung dalam semprit steril. &pesimen cairan tubuh harus dikerjakan dengan hati(hati dan efektif karena spesimen cairan tidak mungkin diambil ulang dalam waktu singkat dan seringkali dalam volume sedikit.

3.2 Pemeriksaan Bak eri!l!gi 3.2.1 Pemeriksaan Langs"ng 3.2.1.1 Pe#arnaan $ram Pewarnaan 6ram digunakan untuk membedakan antara bakteri negatif 6ram atau positif 6ram. Pewarnaan 6ram merupakan pewarnaan diferensial mikrobiologi yang paling penting dan sangat luas digunakan. Pewarnaan ini juga dapat menilai morfologi sel, ukuran, dan bentuk susunan sel kuman. Pewarnaan 6ram biasanya pemeriksaan pertama kali yang dilakukan di laboratorium untuk identifikasi kuman (1eboffe dan Pierce, 2 !!". 2

Perbedaan pada pewarnaan 6ram terjadi karena perbedaan struktur dinding sel. -inding bakteri positif 6ram memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, sedangkan dinding bakteri negatif 6ram hanya memiliki lapisan peptidoglikan tipis dengan kandungan lemak yang lebih banyak (&acher dan 7cPherson, 2 %. Prinsip Pewarna primer kristal violet bersifat sebagai kation akan menembus dinding sel bakteri dan berikatan dengan isi sel yang bermuatan negatif. Iodin ditambahkan sebagai mordant untuk meningkatkan pewarnaan kristal violet dengan membentuk kompleks kristal violet(iodin. &elanjutnya diikuti dengan dekolorisasi menggunakan alkohol atau aseton yang akan melarutkan lemak pada dinding sel terutama bakteri negatif 6ram. -ekolorisasi ini akan menyebabkan lapisan peptidoglikan mengkerut sehingga kompleks kristal violet(iodin tercuci pada bakteri negatif 6ram, tetapi kompleks ini masih terperangkap pada sel bakteri positif 6ram sehingga bakteri positif 6ram masih diwarnai dengan pewarna primer yaitu ungu. #akteri negatif 6ram ini kemudian diwarnai dengan pewarna tanding safranin*fuchsin sehingga bakteri negatif 6ram akan berwarna merah (6ambar ,.!" (1eboffe dan Pierce, 2 !!8 Kumalawati,2 !2". 28 Kumalawati, 2 !2".

2!

$am%ar 3.1 Pe#arnaan $ram. &etelah diberikan pewarnaan primer (kristal violet", dekolorisasi, pewarna tanding dengan safranin, maka akan terbentuk bakteri negatif 6ram berwarna merah dan bakteri positif 6ram berwarna ungu (1eboffe dan Pierce, 2 !!". #. Prosedur Pewarnaan 6ram (9urahmi et al, 2 ( ( :"

spesimen atau koloni kuman diambil dengan sengkelit steril preparat dibuat di atas kaca objek, difiksasi dan dikeringkan diatas #unsen

preparat ditetesi dengan carbol gentian violet dan dibiarkan selama satu menit

( ( ( (

preparat diangkat, kemudian dibilas dengan air mengalir preparat ditetesi dengan lugol dan ditunggu selama satu menit preparat diangkat dan dibilas dengan air mengalir ;at warna pada preparat dilunturkan dengan menggunakan alkohol .</ (dekolorisasi"

preparat dibilas dengan air sampai bersih 22

( ( (

preparat ditetesi dengan larutan fuchsin dan dibiarkan selama =0 detik preparat dibilas dengan air sampai bersih preparat dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak emersi (pembesaran ! kali".

4.

Interpretasi >asil (&acher dan 7cPherson, 2 ( #akteri positif 6ram berwarna

2" seperti Streptococcus

ungu,

pneumoniae ( #akteri negatif 6ram berwarna merah (6ambar ,.2".

$am%ar 3.2 Streptococcus pneumoniae pada Pe#arnaan $ram (9ester et al, 2 .". 3.2.2 Pe#arnaan Kaps"l (>arley, 2 2" %. Prinsip Pewarnaan primer adalah kristal violet yang memberi warna ungu gelap pada dinding sel dan kapsul. #erbeda dengan sel, kapsul merupakan nonionik dan ;at warna primer tidak dapat melekat. Copper sulfate merupakan agen dekolorisasi yang dapat menghilangkan kelebihan 2,

pewarnaan primer dan warna kapsul. Copper sulfat juga berfungsi sebagai ;at warna tanding yang diabsorbsi oleh kapsul sehingga berwarna biru muda atau merah muda. #. Prosedur Pemeriksaan ( sebanyak satu loop koloni dari kultur dipindahkan ke slide, slide dibiarkan kering dan jangan difiksasi dengan panas. ( slide diletakkan pada rak pewarnaan kemudian diwarnai dengan ;at warna kristal violet dan dibiarkan selama =(: menit. ( ( ( slide dibilas dengan copper sulfate 2 /. sediaan dikeringkan dengan kertas hisap. kemudiaan sediaan diamati dibawah mikroskop yang diberi minyak emersi (pembesaran ! kali" (6ambar ,.,".

$am%ar 3.3 Pr!sed"r Pe#arnaan Kaps"l (>arley, 2

2"

4.

Interpretasi >asil >asil positif$ kapsul akan terlihat seperti daerah halo di sekitar sel yang gelap, contoh$ Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae (6ambar ,.=". 2=

. $am%ar 3.& Pe#arnaan Kaps"l (>arley, 2 2"

3.2.3 Pemeriksaan K"l "r Klebsiella pneumoniae 3.2.3.1 Pemeriksaan K"l "r dengan Agar 'ara(

%. Prosedur Pemeriksaan ( Kuman dari medium Brain Heart Infusion Broth (#>I#" diinokulasi pada media agar darah dengan menggunakan sengkelit yang sudah disterilkan, dibuat delapan goresan sejajar pertama. ( 1empeng agar diputar . ?, dibuat enam goresan sejajar yang kedua tegak lurus dengan goresan pertama. ( 1empeng agar diputar . ?, dibuat lagi enam goresan sejajar yang ketiga tegak lurus goresan kedua. ( 1empeng agar diputar lagi . ?, dibuat kembali enam goresan sejajar yang keempat tegak lurus goresan ketiga, dan jangan sampai menyentuh goresan pertama.

20

#. Interpretasi >asil 3.2.& U)i Bi!kimia 3.2.&.1 U)i Ka alase +ji katalase digunakan untuk mengidentifikasi organisme yang

memproduksi en;im katalase (1eboffe dan Pierce, 2 !!". Pemeriksaan en;im katalase ini membantu dalam membedakan antara kuman Staphylococcus dan Streptococcus, serta berguna dalam mengidentifikasi banyak kuman lainnya (%slan;adeh, 2 %. Prinsip Katalase merupakan en;im dalam sistem en;im sitokrom bertanggung jawab untuk pemecahan hidrogen peroksida (>2@2" yang dibentuk selama respirasi aerob. 5erdapatnya katalase akan membentuk gelembung yang disebabkan oleh pelepasan @2 dari >2@2 (%slan;adeh, 2 <". <".

#. Prosedur Pemeriksaan ( Koloni dipindahkan ke permukaan kaca obyek dengan menggunakan jarum inokulasi. ( &ebanyak satu tetes >2@2 ,/ ditambahkan pada kaca objek dan perhatikan terbentuknya gelembung ('inn et al, 2 4. Interpretasi >asil ( >asil positif$ terbentuknya gelembung. 2< <".

>asil negatif$ tidak terbentuk gelembung, misalnya$ Streptococcus Spp. (6ambar ,.0" (%slan;adeh, 2 <".

$am%ar 3.* U)i Ka alase Mengg"nakan Slide. 6elembung yang dihasilkan menunjukkan hasil positif (1eboffe dan Pierce, 2 !!". 3.2.+ Pemeriksaan M!lek"lar "n "k 'e eksi Mengg"nakan Polymerase Chain Reaction Deoxyribonucleic Acid

-eteksi berdasarkan P4A tergantung pada amplifikasi gen spesifik Streptococcus pneumoniae. &alah satu target P4A yang secara luas digunakan untuk identifikasi Streptococcus pneumoniae pada spesimen klinis adalah gen pneumolisin (ply". Penelitian baru(baru ini menunjukkan target lainnya, seperti gen autolisin (lytA" dan gen adhesi permukaan Streptococcus pneumoniae (PsaA" (#laschke, 2 !!". %. Isolasi -9% ('>@, 2 !!" !. Prosedur melisiskan sel bakteri$ ( digestion buffer disiapkan ( , =g*m1 liso;im dan :0+*m1 mutanolisin dalam bufer 5B". 1arutan ini disiapkan C!0 menit sebelum digunakan ( digestion buffer ! mikrosentrifus 2: D1 ditambahkan pada masing(masing tube

D1 larutan sel bakteri dari hasil biakan atau spesimen klinis

ditambahkan pada masing(masing tube mikrosentrifus, kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu ,:?4 selama satu jam ( 2 D1 bufer untuk melisiskan sel ditambahkan pada masing(

masing tube mikrosentrifus ( 2 D1 proteinase K (2 mg*m1" ditambahkan dan masing(masing tube dibolak balik sampai tahap mencampuran sempurna, kemudian diinkubasi pada suhu ,:?4 selama , menit sampai satu jam ( eo!yribonucleic acid dimurnikan sebelum dilakukan reaksi P4A

2. Pemurnian -9% Prosedur 7enghilangkan -ebris &el dan Protein 7enggunakan Phenol"Chloroform$ ( sebanyak volume yang sama larutan phenol $ chloroform (!$!" ditambahkan pada spesimen yang telah dilisiskan, kemudian dicampur dengan baik ( tube disentrifus pada !<. mikrosentrifus ( lapisan cairan bagian atas dipisahkan dengan hati(hati dari lapisan phenol bagian bawah dan dipindahkan pada tube baru, dilakukan dengan hati(hati untuk mencegah tercampur ( langkah !(, diulang sampai batas keduanya tidak tampak E g selama !0 menit dalam

2)

volume chloroform yang sama ditambahkan pada lapisan cairan untuk menghilangkan semua bekas phenol, kemudian tube disentrifus pada !<. E g selama !0 menit dengan mikrosentrifus

lapisan cairan bagian atas dipisahkan dari lapisan chloroform bagian bawah dengan hati(hati dan dipindahkan pada tube baru, hati(hati untuk mencegah tercampur

( (

langkah 0(< dapat diulang sampai batas keduanya tidak tampak eo!yribonucleic acid dipresipitasi oleh etanol atau isopropanol.

#. Prosedur Polymerase Chain #eaction ( eo!yribonucleic acid (-9%" template dan -9% kontrol positif dipindahkan dari suhu (2 ?4 pada tempat penambahan -9% dan dibiarkan cair sempurna. ( Pengumpulan reagen dibutuhkan untuk reaksi P4A termasuk P4A master mi!$ primers$ dan PC# grade water pada tempat terjadinya reaksi P4A. Aeagen dibiarkan cair sempurna apabila reagen disimpan pada suhu (2 ?4. ( Aeaksi sekuensial P4A multipleks disiapkan dengan standar volume reaksi 20 D1 menggunakan primer dan kadar tertentu. ( &etiap reaksi P4A seharusnya mengandung$ o 2 D7 deoksinukleosid trifosfat (d95Ps"

o ,,0 m7 7g4l2 2.

o 2 unit %a& -9% polimerase o 'orward primer o #everse primer o 2,0 -9% template dari isolat o 20 D1 P4A(grade water ( (aster mi! disiapkan, termasuk komponen tersebut diatas kecuali -9% template. Ketika menghitung volume reagen master mi!, ingatlah untuk menambahkan reagen master mi! yang cukup untuk dua reaksi ekstra dari jumlah spesimen yang diperiksa untuk memastikan reagen master mi! yang cukup. ( (aster mi! dipipet 22,0 D1 pada masing(masing well yang tepat dari .< well. ( )ell ditutup. ! / pemutih disemprot dan dibersihkan pada tempat bekerja, diulangi dengan menggunakan alkohol : /. 3as laboratorium dan sarung tangan dipindahkan, serta menggunakan sarung tangan yang baru. >ati(hati dalam memindahkan .< well pada tempat penambahan -9%. ( 5utup plate dibuka, kemudian 2,0 D1 -9% template ditambahkan pada masing(masing well yang tepat dari .< well. ( Paling sedikit satu kontrol positif dan kontrol negatif dikerjakan pada setiap serotipe setiap melakukan pemeriksaan P4A. ( ( Kolom well ditutup, pindahkan plate pada PC# thermocycler. Kondisi P4A yang digunakan$ o satu siklus .=?4 selama = menit ,

o , siklus .=?4 selama =0 detik8 0=?4 selama =0 detik dan :2?4 selama 2 menit o ! siklus :2?4 selama 2 menit. 4. -eteksi Produk P4A dengan Blektroforesis ( gel agarose 2/ diencerkan pada oven microwave dan agar didinginkan pada kira(kira 00?4, kemudian ditambahkan ethidium bromide atau ;at warna gel lainnya. 5uangkan pada gel casting cassette, masukkan comb, dan biarkan mengeras selama , menit ( bufer !F %ris"acetate"* %A (5%B" atau %ris"borate"* %A (5#B" ditambahkan pada tangki elektroforesis dan tempat kaset gel yang mengandung gel agarose yang telah keras pada tangki ( tube atau plate P4A dipusing dengan kecepatan 0 semua cairan berada di bawah ( ( sebanyak ! D1 reaksi P4A dicampurkan dengan 2D1 <F loading dye campuran -9% dan loading dye dipipet kedalam well. &atu well memuat 0D1 -9% ( gel dijalankan pada , volt(0 volt selama !0(2 menit atau sampai band ;at warna Bromophenol blue memenuhi setengah gel. Gat warna berjalan kira(kira dengan kecepatan yang sama sebagai pasangan 0 -9% ( gel dilihat dibawah cahaya +H dan jika mungkin gambar dicetak atau disimpan ( setiap reaksi harus memberikan dua band, contoh$ band kontrol positif spesies spesifik dan band serotype spesifik ,! basa fragmen E g untuk memastikan

sisa amplikon disimpan jika diperlukan pada suhu (2 ?4.

-. -eteksi %mplifikasi +kuran band pada gel agarose harus cocok dengan kontrol positif sebelum menetapkan serotype tersangka. Produk P4A (amplikon" dideteksi menggunakan elektroforesis gel agarose seperti terlihat pada 6ambar ,.!2$

$am%ar 3.12 Iden i,ikasi Streptococcus pneumoniae dengan Mengg"nakan P-R. 6en autolisis (lytA" dan gen pneumolisin (ply" dari isolat yang diidentifikasi sebagai Streptococcus pneumoniae. 6en autolisin (lytA", gen pneumolisin (ply", marker ukuran molekul (7", -9% isolat (&", kontrol positif (P", dan kontrol negatif (9" (9ishiyama et al, 2 !!".

,2