Produksi insulin manusia pada Escherichia coli.

Ada dua perlakuan untuk kloning

molekuler ekspresi gen pada bakteri. Yang paling umum dimulai dengan messenger RNA
(mRNA) dan menggunakan reverse transcriptase untuk membuat salinan DNA (cDNA), yang
kemudian dikloning. Digunakan metode itu karena dapat digunakan kode genetik dari dua gen
kecil yang berisi tepat sequence nukleotida untuk membuat sel bakteri menghasilkan insulin
manusia. Gen dirancang dan dibuat memiliki urutan nukleotida yang berbeda dari urutan
pengkodean alami insulin manusia.


Skema gambaran dari strain dan prosedur untuk produksi insulin manusia oleh bakteri.
Dua Escherichia coli strain yang dibangun mensintesis insulin A-atau gen rantai-B dimasukkan
ke (2-galaktosidase gen/3-GAI) dari vektor kloning plasmid. Secara in vivo, protein menyatu
dibuat seperti fi-galaktosidase, tetapi dengan ekor insulin bergabung dengan metionin. Secara In
vitro, rantai peptida insulin terpotong oleh sianogen bromida. Setelah pemurnian terpisah, insulin
A-dan B-rantai bergabung dengan oksidasi udara.






Dua perlakuan untuk kloning molekul gen sehingga memproduksi bakteri hormon
mamalia dan protein.

Gen-gen untuk insulin manusia, B-dan A-rantai, yang dirancang dari sekuens asam amino dari
polipeptida manusia. Ujung 5 'dari setiap gen memiliki termini kohesif beruntai tunggal untuk
EcoRl dan Bam saya pembatasan endonuckases untuk
pemasangan yang benar dari setiap gen ke dalam plasmid pBR322. Sebuah situs pengakuan / / /
endonuklease Hind dimasukkan ke tengah rantai-B gen untuk sekuens asam amino Glu-Ala
untuk memungkinkan amplifikasi dan verifikasi setiap setengah dari gen terpisah sebelum
pembangunan seluruh gen rantai-B. The B-dan gen A-rantai dirancang untuk dibangun dari 29
oligodeoxyribonucleotides yang berbeda, bervariasi dari decamers untuk pentoda camers. Setiap
panah menunjukkan fragmen disintesis dengan metode phosphotriester ditingkatkan, HI ke H8
dan BJ B12 untuk gen rantai-B, dan
A / All untuk gen A-rantai




F / G. 4. Sintesis kimia oligodeoxyribonuckotides oleh im-
terbukti metode Triester.
5
Hal ini jelas bahwa teknik telah dikembangkan ke titik
di mana gen untuk mengubah bakteri dapat dibuat dengan hubungan-
tively sederhana usaha. Sebenarnya, teknik telah im-
terbukti jauh sejak proyek insulin dan jauh lebih sedikit
waktu akan dibutuhkan sekarang.
Gambar 4 mengilustrasikan metode sintesis kimia Triester
yang digunakan untuk membuat gen insulin.
5
Dimulai dengan nu-
cleosides, perpustakaan trimer Triester sepenuhnya dilindungi, seperti
1 dan 2, yang dibuat. Tipe 2 trimer, dengan anisol 3'-
gugus pelindung, akan menjadi ujung 3 'dari oligonucleo-
pasang. Tipe 1 trimer adalah bifunctional, dan tergantung pada
pengobatan (baik ringan atau asam basa), akan baik akhir 5 '
komponen atau komponen urutan internal. karena
kelompok melindungi chloropehnyl dipasang ester linkage
kelompok fosfat (membentuk phosphotriesters), yang
trimer dan oligonukleotida menengah (misalnya, 3, 4, 5, 6,
7) tidak larut dalam air. Oleh karena itu, semua kondensasi dan
pemurnian dilakukan dalam pelarut berair seperti kloro-
bentuk. Trimer dapat terkondensasi untuk menghasilkan hexamers (misalnya,
3 + 4 hasil 6) dan nexamers dapat terkondensasi untuk menghasilkan do-
decamers (misalnya, 6 + 7 hasil 8, masih sepenuhnya dilindungi Triester
bentuk). Langkah berikutnya-untuk-terakhir dalam sintesis khas adalah re-the
moval dari semua kelompok melindungi oleh pengobatan dengan asam asetat
dan NH4OH, menghasilkan yang diinginkan larut dalam air single-
terdampar fragmen DNA. Langkah terakhir adalah purifica-hatition dari fragmen DNA dengan
kromatografi cair kinerja tinggi-
matography.



Gambar 5 menggambarkan bagaimana insulin Sebuah rantai-dihimpun,
kloning, dan diposisikan pada akhir beta-galaktosidase. langkah
1 (ditunjukkan dalam Gambar 5) telah bergabung dengan kecil (13 Rata-rata dasar)
oligonukleotida. Karena mereka dirancang untuk memiliki com-
tumpang tindih plementary, mereka berkumpul sendiri dan
bergabung untuk memberikan DNA dupleks oleh aksi DNA T4
ligase. Gen ini dirancang untuk memiliki enzim restriksi
situs pada setiap akhir (EcoRI di sebelah kiri dan BamHI pada
kanan). Langkah 2 adalah persiapan kloning DNA plasmid
vektor pBR322. Persiapan meliputi pengobatan dengan EcoRI
dan BamHI enzim restriksi, yang memotong sepotong kecil
dari plasmid dan menyediakan sebuah situs untuk penyisipan syn-
thetic Sebuah gen. Pada langkah 3, plasmid dipersiapkan dan sintetis
DNA dicampur dan bergabung dengan ligase T4, diikuti oleh trans-
pembentukan E. coli dan kloning molekuler. Clone adalah ob-
verifikasi dipelihara yang berisi insulin yang benar gen A, sebagaimana yang dijabarkan oleh
sekuensing DNA langsung. Selanjutnya, fragmen DNA yang mengandung
sebagian besar E. coli lac operon, termasuk promotor lac,
operator, dan pertama 1006 kodon asam amino beta-galac-
tosidase, dimasukkan (langkah 4, 5, dan 6). Hal ini menyebabkan klon
membuat insulin-beta-galaktosidase protein menyatu.



Gambar. 5. Pembangunan DNA plasmid yang mengandung sintetis insu-
lin gen Sebuah rantai-disisipkan pada akhir (gen 3-galaktosidase. The prosedur
prosedur di dijelaskan dalam teks, dan rincian diberikan dalam Goeddel et al.
2
Hanya penjelasan dari simbol-simbol yang diberikan di sini. Simbol A perwakilan-
sents gen Sebuah rantai-sintetis. pBR322 adalah plasmid baik ditandai
vektor kloning yang mengandung dua gen resistensi antibiotik, ampisilin
(Amp) dan tetrasiklin (Tet), dan beberapa pembatasan nyaman endonu-
situs clease termasuk Eco Rl (Rl) dan Bam HI (Bam). Lambda adalah plac
lambda pentransduksi fag membawa seluruh E. coli operon, yang dalam-
cludes promotor lac (?), operator lac (O), dan seluruh (i-galac-
tosidase gen struktural (Z). Ada Rl situs endonuklease Eco ke
kiri operon dan abo satu di dekat akhir (gen i-galaktosidase;
dengan demikian, operon lac fragmen DNA dapat segera diperoleh. The fenotipe
jenis strain bakteri berhasil terinfeksi plasmid yang diinginkan
ditampilkan. Sebagai contoh, strain A-rantai produksi akan ampisilin
tahan (AMPR
), Tetrasiklin sensitif (Tet
s
), Dan koloni akan
Biru pada agar indikator khusus yang disebut XG