Anda di halaman 1dari 5

Dibandingkan kromatografi gas (GC), HPLC mempunyai beberapa keunggulan, diantaranya dapat

digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile), isolasi zat secara termal tidak
stabil, pemisahan senyawa anorganik, dan dapat dioperasikan pada suhu kamar.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari
pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai
dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang
berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas
permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya.
Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Perbedaan HPLC dan GC

HPLC GC
Fasa diam Fisa diam berupa adsorben yang
tidak boleh larut dalam fasa gerak.
Ukuran yang lebih kecil (5 s/d
10 mm) dan tekanan sampai 6000
psi. Ukuran yang kecil dari fasa diam
menyebakan fasa diam mempunyai
luas permukaan yang besar,
keseimbangan antar fasa menjadi
lebih baik dan efisien pemisahan
dipertinggi.
Fasa diam berupa suatu cairan
bertitik didih tinggi dan proses
serapannya lebih banyak berupa
partisi yang berupa padatan dan
adsopsi memainkan peranan utama.
Fasa gerak Fasa gerak merupakan suatu cairan. fase gerak adalah gas seperti helium,
hidrogen, atau nitrogen.
Kolom Ada 2 tipe:
- Kolom analitik dengan
performance tinggi, diameter dalam
1-6 mm
- Kolom preparative, diameter lebih
besar
Tabung kolom dibuat dari kaca dan
baja tahan karat. Panjang kolom 0,3-
6 meter atau lebih, rata-rata 0,9 m.
Kolom yang lebih panjang akan
menghasilkan resolusi bertambah
baik, tetapi perlu tekanan tinggi.
Tabung kolom dapat dikelilingi
Ada dua tipe utama kolom dalam
kromatografi gas-cair. Tipe pertama,
tube panjang dan tipis berisi
material padatan; Tipe kedua, lebih
tipis dan memiliki fase diam yang
berikatan dengan pada bagian
terdalam permukaannya.
Kolom biasanya dibuat dari baja tak
berkarat dengan panjang antara 1
sampai 4 meter, dengan diameter
internal sampai 4 mm. Kolom
digulung sehingga dapat disesuakan
dengan oven yang terkontrol secara
termostatis.
selubung air (water jacket) untuk
pengaturan suhu. Jenis isi kolom
(kemasan kolom) tergantung cara
kromatografi yang dipakai (adsorpsi,
partisi, atau penukaran ion).
Kolom dipadatkan dengan tanah
diatomae, yang merupakan batu
yang sangat berpori. Tanah ini
dilapisis dengan cairan bertitik didih
tinggi, biasanya polimer lilin.

Detektor Ada beberapa cara untuk
mendeteksi substansi yang telah
melewati kolom. Metode umum
yang mudah dipakai untuk
menjelaskan yaitu penggunaan
serapan ultra-violet.
Detektor yang paling banyak
digunakan adalah detektor
fotometer sinar tampak atau sinar
ultraviolet, dan detektor indeks bias.
Fungsi detektor untuk mendeteksi
adanya komponen cuplikan, dan
mengukur banyaknya komponen.
Syarat-syarat yang baik detektor
adalah mempunyai kepekaan tinggi,
gangguan noise sedikit, daerah
respon linear cukup luas,
memberikan respon terhadap
semua tipe senyawa, dan tidak peka
terhadap perubahan kecepatan
aliran dan perubahan suhu.
Ada beberapa tipe detektor yang
biasa digunakan. Detektor ionisasi
nyala merupakan detektor yang
umum dan lebih mudah untuk
dijelaskan daripada detektor
alternatif lainnya.
Dalam mekanisme reaksi detektor
ionisasi nyala, pembakaran senyawa
organik merupakan hal yang sangat
kompleks. Selama proses, sejumlah
ion-ion dan elektron-elektron
dihasilkan dalam nyala. Kehadiran
ion dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam
oven yang lebih panas dibanding
dengan temperatur kolom. Hal itu
menghentikan kondensasi dalam
detektor.

Jumlah sample Sampel cuplikan harus dimasukkan
ke dalam kolom sebagai lapisan
setipis mungkin. Ukuran sampel
sekitar 1-20 mL. Dua cara untuk
melakukan injeksi: cara injeksi dan
katup pemasukan cuplikan mikro
(micro-sampling valve)

Sample harus mudah menguap dan
memiliki kstabilan termal pada suhu
pengoperasian. Sampel dimasukkan
ke dalam aliran gas melalui lubang
injeksi yang terletak pada bagian
atas kolom. Suatu aliran gas yang
sinambung mengelusi komponen-
komponen dari kolom dan kemudian
mencapai detektor yang
dihububngkan dengan suatu sistem
pencatat. Berikut diagramnya





Prinsip pemisahan /
Prinsip kerja
Mula-mula solven diambil melalui
pompa Solven ini kemudian masuk
ke dalam katup injeksi berputar,
yang dipasang tepat pada sample
loop. Dengan pertolongan
mikrosiring, sample dimasukkan ke
dalam sample loop yang kemudian
bersama-sama dengan solven masuk
ke dalam kolom. Hasil pemisahan
dideteksi oleh detektor yang
ditampilkan oleh perekam/recorder.
Tekanan solven diatur dengan
pengatur dan pengukur tekanan.
Pompa memasok solven pada
tekanan konstan hingga
tekanan 4500 psi dengan laju alir
rendah, yakni beberapa milliliter per
menit.
Output akan direkam sebagai
rangkaian puncak-puncak, dimana
masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menerap sinar
UV. Sepanjang anda mengontrol
kondisi kolom, anda dapat
menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi
senyawa yang diperoleh, tentunya,
anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa
murninya dari berbagai senyawa
pada kondisi yang sama.
Jika anda menginjeksi suatu larutan
yang mengandung senyawa murni X
yang telah diketahui jumlahnya pada
instrumen, anda tidak hanya dapat
merekam waktu retensi dari
Ada tiga hal yang dapat berlangsung
pada molekul tertentu dalam
campuran yang diinjeksikan pada
kolom:
- Molekul dapat berkondensasi
pada fase diam.
- Molekul dapat larut dalam
cairan pada permukaan fase diam
- Molekul dapat tetap pada fase
gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak
satupun yang bersifat permanen.

Hasil akan direkam sebagai urutan
puncak-puncak; setiap puncak
mewakili satu senyawa dalam
campuran yang melalui detektor.
Sepanjang anda mengontrol secara
hati-hati kondisi dalam kolom, anda
dapat menggunakan waktu retensi
untuk membantu mengidentifikasi
senyawa yang tampak-tentu saja
anda atau seseorang lain telah
menganalisa senyawa murni dari
berbagai senyawa pada kondisi yang
sama.

senyawa tersebut, tetapi anda juga
dapat menghubungkan jumlah dari
senyawa X dengan puncak dari
senyawa yang dihasilkan.


Area yang berada dibawah puncak
sebanding dengan jumlah X yang
melalui detektor, dan area ini dapat
dihitung secara otomatis melalui
layar komputer. Area dihitung
sebagai bagian yang berwarna hijau
dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area
dibawah puncak akan berkurang
meskipun waktu retensi akan sama.
Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan
mengkalibrasi instrumen sehingga
dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang
dihasilkan meskipun dalam jumlah
kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-
hati. Jika anda mempunyai dua
substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y),
dapatkah anda mengatakan jumlah
relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda
menggunakan serapan UV sebagai
metode pendeteksinya.


Area dibawah puncak sebanding
dengan jumlah setiap senyawa yang
telah melewati detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis
melalui komputer yang dihubungkan
dengan monitor. Area yang akan
diukur tampak sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar yang
disederhanakan.

Perlu dicatat bahwa tinggi puncak
tidak merupakan masalah, tetapi
total area dibawah puncak. Dalam
beberapa contoh tertentu, bagian
kiri gambar adalah puncak tertinggi
dan memiliki area yang paling luas.
Hal ini tidak selalu merupakan hal
seharusnya.
Mungkin saja sejumlah besar satu
senyawa dapat tampak, tetapi dapat
terbukti dari kolom dalam jumlah
relatif sedikit melalui jumlah yang
lama. Pengukuran area selain tinggi
puncak dapat dipergunakan dalam
hal ini.