Anda di halaman 1dari 4

Kromatografi dan HPLC

Kromatografi adalah salah satu teknik pemisahan dan


pemurnian suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusinya terhadap fase gerak dan
fase diam. Dengan metode kromatografi, hampir setiap campuran kimia mulai dari berat
molekul rendah sampai tinggi, dapat dipisahkan menjadi komponenkomponennya
!"ritter et al., #$$#%.
&acam kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran 'at'at kimia yang
terkandung dalam tumbuhan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom,
kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi !Harborne, #$()%.
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa dari campurannya
karena perbedaan keseimbangan distribusi senyawa diantara * fase yaitu fase diam dan
fase gerak !koefisien distribusi%. &igrasi suatu senyawa hanya terjadi apabila senyawa
trsebut dalam fase gerak, sehingga kecepatan migrasi senyawa proporsional terhadap
koefisien distribusinya. +enyawa dengan distribusi yang tinggi pada fase diam akan
bergerak lebih lambat dalam kolom dan terpisah dari senyawa dengan distribusi rendah
pada fase diam !Hamilton et al., #$(*, +astrohamidjojo, *--#%.
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel,
dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa
gerak.mobil. /asa diam berupa padatan.cair yang dilapiskan pada padatan.gel. Pada
pemisahan ini senyawasenyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang
bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa mobil akan
terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan
kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponenkomponen
dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaanperbedaan sifatsifat
fisik komponen yang hendak dipisahkan !&ulja, #$$0%. Perbedaaan sifat tersebut
diantaranya 1
1Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
2+ifat untuk bertaut !adsorpsi% yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk
bahan padat
3+ifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.
2erdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka kromatografi dibedakan menjadi 3
!&ulja, #$$0%, yaitu 1
1Kromatografi dengan asas adsorpsi.
Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau gas.
Pemisahan komponenkomponennya akan sangat bergantung pada perbedaan polaritas
molekulmolekul yang akan dipisahkan.
2Kromatografi dengan asas partisi.
Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponen
komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd !Koefisien distribusi% molekul
molekul yang dipisahkan.
3Kromatografi dengan asas filtrasi.
Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi terhadap komponen
yang mempunyai massa molekul relatif !&r% yang tinggi dan fasa padat tersebut dimiliki oleh
gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya adalah cairan. Kromatografi dengan dasar
filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk !struktur dan ukuran molekul%.
4Kromatografi dengan asas suhu kritik.
Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa mobil
dipakai C4* dalam keadaan superkritik.
+ecara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam
mempunyai luas permukaan sebesarbesarnya sehingga terjadi keseimbangan yang baik
antara fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase
gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi sekecilkecilnya. 5ntuk
memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penjerap atau fase diam harus berupa
serbuk halus. +edangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang
berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Persyaratan tersebut menghasilkan
teknik high pressure liquid chromatography, yang selanjutnya lebih dikenal sebagai high
performance liquid chromatography !HPLC% atau kromatografi cair kinerja tinggi !"ritter et
al., #$$#%.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Li6uid Chromatography !HPLC% merupakan metode pemisahan yang
dikembangkan dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas
yaitu proses pemisahan yang berdasarkan afinitas, filtrasi gel, dan ion yang berpasangan
yang prosesnya tetap dilaksanakan di dalam kolom yang disertai pemakaian pelarut dengan
tekanan tinggi !&ulja,#$$0%.
HPLC adalah teknik yang berkembang dari kromatografi kolom yang memiliki beberapa
keuntungan diantaranya ukuran fasa diamnya lebih kecil, kolom lebih pendek sehingga
waktu elusi atau waktu retensi !t7% lebih pendek dan analisisnya berlangsung cepat, pelarut
dan kolom dapat dipakai berulang kali serta ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi.
8pabila dibandingkan dengan kromatografi gas maka HPLC tidak dipengaruhi oleh
9olatilitas dan stabilitas bahan !Lindsay, #$$*%.
Dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan migrasi dari komponenkomponen
sampel yang terjadi karena adanya perbedaan kesetimbangan distribusi dalam fasa diam
dan fasa gerak untuk senyawasenyawa yang berbeda. HPLC sangat ideal untuk
memisahkan molekulmolekul dari sampel organik dalam sampel biologis, bahanbahan
alam yang mudah mengalami perubahan, senyawa yang kurang stabil, dan senyawa
dengan berat molekul tinggi !&ulja, #$$0, Lindsay, #$$*%.
HPLC pada dasarnya adalah suatu bentuk kromatografi kolom yang menggunakan kolom
yang terbuat dari bahan kemasan ukuran partikel kecil dan berbentuk teratur. Karena
kehalusan kemasan, untuk mendapatkan laju aliran yang memadai, digunakan tekanan
sampai #-.--- psi. Cara ini memungkinkan peneliti menganalisis komponen fla9onoid dalam
suatu campuran secara kuantitatif pada aras resolusi dan kepekaan yang tinggi !: 0- ng%
!&arkham, #$()%.
Dalam HPLC, terdapat suatu detektor yang sangat peka untuk menganalisis larutan yang
keluar dari kolom. +ecara umum, alat yang digunakan untuk deteksi dalam kromatografi
kolom berdasarkan pada perbedaan sifat fisika dan kimia dari analit dan pelarut. Pada
sistem kromatografi cair, sifat fisik dari sampel dan fase gerak sering kali sama sehingga
ada * tipe dasar detektor yang dikembangkan untuk penggunaan pada sistem kromatografi
cair, yaitu1 #%. &engukur perbedaan sifat umum yang ada baik pada sampel maupun fase
gerak, misalnya detektor perbedaan indeks bias, kondukti9itas dan konstanta dielektrik, *%.
&engukur sifat yang spesifik pada sampel, dengan membersihkan fase gerak sebelum
deteksi !flame ionization detector !/;D% danelectron capture detector !<CD%% atau tanpa
membersihkan fase gerak sebelum deteksi dilakukan !detektor 5=, polarografi dan
radioakti9itas%. Karakteristik detektor yang ideal untuk HPLC, antara lain1 memiliki
sensiti9itas tinggi, memberikan respon terhadap semua solut !memiliki spesifisitas yang
dapat diprediksi%, memiliki respon linier terhadap seri konsentrasi solut, ruang kosong yang
rendah, tidak destruktif, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan fase
gerak, dan mudah digunakan !Hamilton et al., #$(*, +wadesh, *---%.
Dalam penggunaan HPLC, ada * teknik yang sering dilakukan yaitu elusi secara isokratik
dan gradien. Kromatografi isokratik cenderung lebih sensitif terhadap perubahan fase gerak,
temperatur, kecepatan pompa dan komposisi sampel. +edangkan kromatografi gradien
biasanya kurang sensitif terhadap 9ariasi kecil faktorfaktor diatas, tetapi sangat sensitif
terhadap kolom, waktu ekuilibrasi dan preparasi gradien. Parameter teoritis dari kromatografi
isokratik digambarkan dengan model lempeng !plate%. +enyawa yang dianalisis akan
terdistribusi antara fase diam dan fase gerak. Pada saat tertentu, suatu molekul akan
ditransfer pada fase diam dalam kolom. Kemudian, molekul tersebut akan lepas dari kolom
dan terbawa kembali oleh fase gerak sampai pada tempat dimana molekul tersebut terikat
lagi pada fase diam. Proses ini terjadi secara kontinyu. Lokasi dimana analit ditransfer ke
fase diam secara teoritis disebut lempeng !plate% dan jarak antara lempeng satu dengan
yang lain disebut tinggi lempeng !plate height%. Parameter yang digunakan untuk
menentukan kemampuan pemisahan dalam penggunaan HPLC adalah faktor kapasitas,
waktu retensi, lebar pada tinggi setengah puncak, jumlah lempeng teoritis, resolusi dan
faktor selekti9itas !+wadesh, *---%.