1

Tentir Praktikum Biomol

Bacalah dengan (menyebut) nama Tuhan-mu yang menciptakan. Dia telah menciptakan
manusia dari segumpal darah. Bacalah, dan Tuhanmulah Yang Maha Mulia. Yang mnegajarkan
(manusia) dengan pena. Dia mengajarkan manusia apa yang tidak diketahuinya. (QS. Al Alaq:
1-5)
Tentir ini bertujuan untuk mempermudah kalian belajar, semuanya diambil dari penuntun
praktikum dan beberapa dari sumber lain.
ISI: Halaman
1. Identifikasi Karbohidrat, Protein, Lemak ...............................................................2
2. Isolasi dan pemisahan protein.................................................................................10
3. Pengaruh suhu dan pH terhadap enzim .................................................................12
4. Isolasi DNA ................................................................................................................15
5. PCR .............................................................................................................................18
6. STR .............................................................................................................................21
Selamat belajar..


2

Identifikasi Karbohidrat, Protein, Lemak
1. Karbohidrat
Uji karbohidrat yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah uji Benedict, uji Molisch, uji
Selliwanoff dna uji Iodium.
a. Uji Benedict
Uji ini bertujuan untuk mengetahui sifat reduksi karbohidrat. Prinsipnya adalah larutan
tembaga yang beraski basa akan direduki oleh gula yang mempunyai gugus aldehida atau
keton bebas dan akan terbentuk endapan kupro-oksida yang berwarna merah. Larutan
Benedict mengandung kupri sulfat, natrium karbonat dan natrium sitrat.

Uji benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi.
Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa
dan maltosa.
Sukrosa (gula pasir) tidak terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa mengandung dua
monosakrida (fruktosa dan glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidic sedemikian rupa
sehingga tidak mengandung gugus aldehid bebas dan alpha hidroksi keton. Sukrosa juga
tidak bersifat pereduksi.
Cara Kerja:
Masukkan 1 ml larutan Benedict ke dalam tabung reaksi tambahkan 1,5 mL larutan
yang akan diperiksa masukkan ke dalam penangas air mendidih selama 3 menit, dinginkan
perlahan periksa warna endapan.
Hasil positif: endapan berwarna hijau, kuning atau merah.


3

b. Uji Molisch
Uji Molisch merupakan tes umum karbohidrat. Prinsipnya adalah karbohidrat dengan
asam sulfat pekat menghasilkan suatu senyawa furfural. Senyawa tersebut dengan pereaksi
alfa naftol menghasilkan senyawa yang berwarna ungu. Hasil negatif merupakan suatu bukti
bahwa tidak ada karbohidrat.


Dasar uji ini adalah heksosa atau pentosa mengalami dehidrasi oleh asam sulfat pekat
menjadi hidroksimetilfurfural atau furfural dan kondensasi aldehida yang terbentuk ini
dengan -naftol membentuk senyawa yang berwarna khusus untuk polisakarida dan
disakarida.
Cara kerja:
2 mL larutan karbohidrat yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
diberikan 3 tetes pereaksi Molisch kocok pegang tabung dalam keadaan miring, alirkan
dengan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung pereaksi.
Hasil positif: adanya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan cairan.



4

c. Uji Selliwanoff
Uji Selliwanoff merupakan uji yang digunakan untuk membedakan karbohidrat yang
mempunyai gugus keton dan aldehida. Prinsipnya adalah karbohidrat atau turunannnya (4-
hidroksi metil furfural) dengan resorsinol menghasilkan senyawa yang berwarna merah.

Uji Selliwanoff dipakai untuk menunjukkan adanya ketoheksosa, misalnya fruktosa.
Pereaksi Selliwanoff adalah resorsinol dalam asam klorida encer. Dua tahap reaksi terjadi
dalam pendidihan ini, yaitu dehidrasi fruktosa oleh HCL yang ada dalam pereaksi Selliwanoff
membentuk hidroksimetilfurfural dan kondensasi hidroksimetilfurfural yang terbentuk
dengan resorsinol membentuk senyawa berwarna merah.
Sukrosa memberikan hasil positif pada uji ini karena sukrosa mengalami hidrolisis
menjadi glukosa dan fruktosa. Fruktosa memberikan warna merah.

Cara kerja:
Masukkan 2 mL larutan karbohidrat yang akan diperiksa ke dalam tabung reaksi
tambahkan 2 mL pereaksi Selliwanoff campurkan dan panaskan dalam penangas air
mendidih selama 60 detik.
Hasil positif: larutan berwarna merah

5

d. Uji iodium
Uji Iodium bertujuan untuk mengidentifikasi polisakarida. Reagent yang digunakan
adalah larutan iodine yang merupakan I2 terlarut dalam potassium iodide. Reaksi antara
polisakarida dengan iodin membentuk rantai poliiodida. Polisakarida umumnya membentuk
rantai heliks (melingkar), sehingga dapat berikatan dengan iodin, sedangkan karbohidrat
berantai pendek seperti disakarida dan monosakaraida tidak membentuk struktur heliks
sehingga tidak dapat berikatan dengan iodin. Amilum dengan iodine dapat membentuk
kompleks biru, amilopektin dengan iodin akan memberi warna merah ungu sedangkan
dengan glikogen dan dekstrin akan membentuk warna merah coklat.

2. Protein
a. Uji Biuret
Uji Biuret adalah uji untuk mengidentifikasi adanya protein (merupakan tes umum
tehadap protein). Uji Biuret adalah uji umum untuk protein (ikatan peptida), tetapi tidak
dapat menunjukkan asam amino bebas. Prinsipnya adalah protein dengan tembaga
hidroksida membentuk kompleks berwarna ungu.

Cara kerja:
2 mL larutan albumin dicampur dengan 2 ml NaOh tambahkan 5 tetes larutan CuSO
4

kocok.
Hasil positif: terbentuk kompleks berwarna ungu
6


b. Uji Millon
Uji Millon merupakan uji untuk menentukan gugus mono hidroksi benzen dalam sampel.
Prinsipnya adalah reaksi ini bergantung adanya derivat mono hidroksi benzen seperti tirosin
dan fenol. Reaksi ini akan terganggu jika ada ion klorida atau amonium.
Pereaksi Millon terdiri atasa larutan merkuro nitrat dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.
Protein dengan pereaksi Millon akan membentuk endapan putih. Jika dipanaskan, warnanya
berubah menjadi merah.
Cara kerja:
Dalam tabung reaksi, campurkan 2 mL albumin dnegan 3 tetes reagen Millon
panaskan 5 menit.
Hasil positif: adanya endapan merah

c. Uji Xantoproteat
Uji Xantoproteat adalah uji untuk mengidentifikasi adanya asam amino yang
mengandung cincin benzena, seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan.
Pada uji Xantoproteat ini, larutan asam nitrat pekat (HNO3) ditambahkan dengan hati-
hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah
menjadi kuning apabila dipanaskan kemudian menjadi warna jingga bila dibuat alkalis (basa)
dengan larutan NaOH. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada
benzena yang terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi
oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena.


7

Cara Kerja:
Masukkan 2 mL larutan yang akan diperiksa tambahkan asam HNO
3
pekat sebanyak 1
mL perhatikan adanya endapan putih yang terbentuk panaskan 1 menit sampai
endapan larut kembali
Hasil positif: larutan berwarna kuning

d. Pengaruh alkohol terhadap protein
Uji ini bertujuan untuk melihat pengaruh alkohol terhadap protein. Prinsipnya adalah
protein dapat membentuk presipitat dengan alkohol. Dengan penambahan air, beberapa
protein akan jernih kembali (menunjukkan sifat reversibilitas protein). Penambahan alkohol
dapat mendenaturasi protein, karena sifat alkohol yang dapat menarik mantel air pada
protein.

Cara kerja:
2 mL larutan albumin dicampur dengan 3 mL alkohol tambahkan 5 mL air

3. Lipid
a. Uji Hubl
Uji ini bertujuan untuk mengetahui ikatan tak jenuh dalam suatu lipid. Prinsipnya adalah
senyawa tak jenuh seperti lipid dapat mengalami reaksi adisi (pengurangan jumlah ikatan
rangkap dalam senyawa). Untuk menentukan adanya ikatan rangkap, sampel direaksikan
dengan larutan Hubl. Berkurangnya warna merah larutan Hubl, menunjukkan adanya ikatan
rangkap.
Cara Kerja:
2 mL minyak ditambahkan klorofom dan 2 tetes larutan Hubl kocok.
*kloroform berfungsi untuk melarutkan minyak
b. Uji kelarutan lipid
Pada uji kelarutan lipid, hampir semua jenis lipid, yaitu lemak dan minyak tidak larut
dalam pelarut polar seperti air, namun larut dalam pelarut non polar seperti kloroform, dan
8

eter. Pada natrium karbonat, minyak mengalami reaksi emulsi/penyabunan. Asam oleat dan
gliserol larut dalam air maupun alkohol. Hal ini disebabkan karena pada gliserol dan asam
oleat mempunyai kepala polar berupa gugus -OH yang dapat berikatan hidrogen dengan
molekul air ataupun alkohol. Lemak hewan dan minyak kelapa tengik dapat terdispersi
menjadi misel yang megubah asam-asam lemak penyusunnya menjadi sabun.
c. Uji keasaman lipid
Uji ini bertujuan untuk sifat asam basa minyak kelapa. Prinsipnya adalah minyak murni
umumnya bersifat netral, sedangkan minyak yang sudah tengik bersifat asam. Hal ini
disebabkan karena minyak mengalami hidrolisis dan oksidasi menghasilkan, aldehida, keton,
dan asam asam lemak bebas. Proses ketengikan pada lemak atau minyak dapat dipercepat
oleh adanya : cahaya, kelembaban, pemanasan, aksimikroba, dan katalis logam tertentu,
seperti Fe, Ni, atau Mn. Sebaliknya, zatzat yang dapat menghambat terjadinya proses
ketengikan disebut antioksidan, misalnya: tokoferol (vitamin E), asam askorbat (vitamin C),
polifenol, hidroquinon, dan flavonoid.

d. Uji Liebermann Burchard
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi adanya kolesterol dalam suatu senyawa. Reaksi
Liebermann Burchard bergantung pada dehidrasi kolesterol dan oksidasi dengan asam sulfur
untuk membentuk asam sulfonik kolestaheksan. Untuk menyempurnakan dehidrasi, reagen
harus anhidros.
Pada reaksi Liebermann-Burchard larutan akan berubah warna dengan segera menjadi
merah dengan cepat akan menjadi biru-violet (Kolekalsiterol kolesterol) dan untuk
selanjutnya akan menjadi hijau (ergokalsiferol).
Cara Kerja:
Sedikit kolesterol dilarutkan dalam kloroform hingga larut seluruhnya Tambahkan 10
tetes asam asetat anhidrid dan 2 tetes asam sulfat pekat kocok perlahan-lahan dan
biarkan beberapa menit Perhatikan perubahan warna yang terjadi.
9

Hasil positif: Kolesterol dilarutkan dalam kloroform warnanya akan menjadi kecoklatan.
Setelah ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrid dan 2 tetes asam sulfat pekat warnanya akan
berubah menjadi biru kehijauan.

10

Isolasi dan Pemisahan Protein
Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering sel
terdiri atas protein. Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang
terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein apapun dan berasal dari mahluk hidup
tersusun dari 20 macam asam amino. Kedua puluh asam amino tersebut mempunyai ciri-ciri
umum yaitu:
Semua mempunyai konfigurasi L
Mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus NH
2
yang terikat ke atom C

Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk
mantel air. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sangat meningkatkan
kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid
yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan
protein. Penghilangan mantel air dapat membantu dalam pengendapan protein. Penghilang
mantel air dapat dilakukan dengan penambahan garam berkonsentrasi tinggi dan etanol
absolut.
a. Pengendapan protein dengan larutan garam konsentrasi tinggi (Salting out)
Tujuan dari uji ini adalah menunjukkan bahwa protein dapat dipisahkan satu dari yang
lain dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi.
Untuk larut dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan
cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar merata di antara
molekul-molekul air. Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi
molekul protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap.
Larutan garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam
berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan semakin
berkurang.
Pengendapan ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein, sedangkan molekul
protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan tersebut bersifat
reversibel.
11

Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein karena di dalam air
garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yaitu yang masing-masing berinteraksi
sempurna dengan air.
(NH
4
)
2
SO
4
setengah jenuh dapat mengendapkan globulin
(NH
4
)
2
SO
4
jenuh dapat mengendapkan albumin
NaCl hanya bisa mengendapkan globulin dalam keadaan jenuh, tetapi tidak dapat
mengendapkan albumin.
Cara kerja:
2 mL serum dicampurkan dengan larutan amonium sulfat setengah jenuh saring
periksa ada endapan atau tidak periksa endapan dan filtrat dengan uji biuret. Lakukan
langkah yang sama dengan konsentrasi amonium sulfat jenuh.

b. Pemisahan protein dengan etanol absolut
Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol
absolut pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan
molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul
beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein tersebut
dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang terbentuk tidak
dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.
Cara kerja:
2 mL serum dicampurkan dengan etanol absolut kocok saring periksa filtrat dan
endapan dengan uji biuret. Lakukan dengan cara yang sama pada larutan albumin.

12

Pengaruh suhu dan pH terhadap Enzim
Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk berbagai
reaksi kimia dalam sistem biologik. Enzim terdistribusi di tempat-tempat tertentu di dalam
sel, seperti enzim yang berperan dalam sintesis dan reparasi DNA terletak di dalam inti sel.
Suatu enzim dapat mengatalisis satu atau beberapa reaksi saja. Meskipun jumlah enzim
ada ribuan yang berseumber dari mahluk hidup, reaksi-reakis yang dikatalisis oleh enzim
dapat digolongkan ke dalam 6 macam reaksi saja. Berdasarkan itu, para ahli telah
menggolongkan enzim ke dalam 6 golongan, yaitu:
Oksidoreduktase mengkatalisis reaksi-reaksi oksidasi reduksi
Transferase mengkatalisis reaksi pemindahan berbagai gugus seperti amina,
karboksil, karbonil, metil, asil, glikosil atau fosforil
Hidrolase mengkatalisis pemutusan ikatan kovalen sambil mengikat air
Liase mengkatalisis reaksi pemecahan ikatan kovalen tanpa mengikat air
Isomerase mengkatalisis proses isomerisasi
Ligase (sintetase) mengkatalisis pembentukan ikatan kovalen
Seperti molekul protein lainnya, sifat biologis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai
faktor fisiko-kimia. Enzim bekerja pada kondisi tertentu yang relatif ketat. Faktor yang
mempengaruhi kerja enzim antara lain:
Suhu
pH
oksidasi oleh udara atau senyawa lain
Penyinaran sinar ultraviolet
Sinar X, , , dan

a. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim
Suhu yang sangat rendah akan menyebabkan terhentinya kerja enzim secara reversibel,
karena dalam keadaan tersebut tidak terjadi benturan antara partikel E (enzim) dan S
(substrat). Akibatnya kompleks E-S yang sangat penting dalam reaksi enzimatik tidak
terbentuk, sehingga P (produk) juga tidak terbentuk. Bila suhu dinaikkan sedikit demi
13

sedikit, benturan E dan S untuk membentuk kompleks E-S akan makin gencar, sehingga P
yang terbentuk semakin banyak. Keadaan ini terjadi sampai pada suhu tertentu, yaitu suhu
optimum.
Suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum menyebabkan enzim terdenaturasi. Akibatnya
meskipun benturan E dengan S lebih gencar lagi, kompleks ES tidak terbentuk karena enzim
terdenaturasi. Akibatnya pembentukan P berkurang. Denaturasi enzim dapat terjadi
irreversibel terutama bila suhu lingkungan jauh melampaui suhu optimum.
Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada suhu optimum. Enzim dalam
tubuh manusia mempunyai suhu optimum sekitar 37C. sebagian besar enzim menjadi tidak
aktif pada pemanasan sampai 60C karena terjadi denaturasi.

Cara kerja:
Larutan pati sebanyak 1 mL diinkubasi selama 5 menit pada suhu 0C campurkan air liur
yang sudah diencerkan 1000 x sebanyak 200 mL inkubasi selama 1 menit campurkan
larutan iodium sebanyak 1 mL dan air suling 8 mL baca serapan pada panjang gelombang
680 nm dengan spektrofotometri. Lakukan cara yang sama untuk suhu 25C, suhu ruang,
37C, 60C, dan 100C.
Larutan iodium digunakan sebagai penanda untuk adanya larutan pati. Jika enzim
bekerja maksimal, maka pati akan semakin berkurang dan larutan berwarna ungu lebih
muda dibandingkan pada larutan yang kerja enzimnya tidak maksimal.



14

b. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim
Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan menunjukkan kerja maksimum pada pH
optimum. Di luar pH optimum aktivitas enzim dapat terganggu.
Jika dilakukan pengukuran aktivitas enzim pada beberapa macam pH yang berlainan,
sebagian besar enzim di dalam tubuh menunjukkan aktivitas maksimum antara pH 5,0
sampai 9,0. Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada pH optimum. Ada enzim
yang mempunyai pH optimum yang sangat rendah, seperti pepsin yang mempunyai pH
optimum 2. Pada pH yang jauh di luar pH optimum, enzim akan terdenaturasi. Selain itu pada
keadaan ini baik enzim maupun substrat dapat mengalami perbuahan muatan listrik yang
mengakibatkan enzim tidak dapat berikatan dengan substrat.

Cara kerja:
Larutan pati sebanyak 1 mL (yang sudah dilarutkan dalam pH 1) diinkubasi selama 5 menit
pada suhu 37C campurkan air liur yang sudah diencerkan 1000 x sebanyak 200 mL
inkubasi selama 1 menit campurkan larutan iodium sebanyak 1 mL dan air suling 8 mL
baca serapan pada panjang gelombang 680 nm dengan spektrofotometri. Lakukan cara
yang sama untuk larutan pati yang sudah dilarutkan dalam pH 3, 5, 7, 9 dan 11.

15

Isolasi DNA
DNA merupakan polideoksiribonukleotida yang mengandung banyak
monodeoksiribonukleotida yang dihubungkan secara kovalen melalui ikatan 3 5
fosfodiester. Satu nukleotida terdiri atas 3 bagian yaitu:
a. Cincin purin atau pirimidin, yaitu basa nitrogen yang terikat pada molekul atom C nomor 1
suatu molekul gula (ribosa atau deoksiribosa) melalui ikatan N-glukosidik.
b. Molekul gula dengan 5 atom C (pentosa). Pada ribonucleic acid (RNA) gulanya adalah
ribosa, sedangkan pada DNA gulanya adalah deoksiribosa.
c. Gugus fosfat yang terikat pada atam C nomor 5 melalui ikatan fosfoester.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik
dnegan metode PCR (polymerase chain reaction) atau mnggunakan enzim endonuklease
restriksi (DNA fingerprinting). Sampel yang dapat digunakan untuk isolasi DNA adalah semua
bahan bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang,
liur dan lain-lain. Hasil pemeriksaan dari PCR dan DNA fingerprinting dapat digunakan untuk:
Diagnosis penyakit infeksi akibat virus atau bakteri
Mendeteksi adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan atau penyakit
herediter
Menentukan jenis kelamin prenatal
Sebagai alat bantu dalam bidang kedokteran kehakiman
Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak
mengandung DNA genom harus dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA, yaitu
16

deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga
dapat mengurangi aktivitas DNAse yang terdapat di dalam sel. Bila perlu, dapat ditambahkan
RNAse untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.
Selanjutnya dengan presipitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan
inti. Akhirnya, DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali
endapan yang terbentuk dengan larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet
DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan
DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai
kemurnian DNA.
Cara kerja:
1) Sebanyak 450 L cell lysis solution dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge steril.
2) Ditambahkan 150 L darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi.
3) Campuran di atas diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruang.
4) Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang
selama 1 menit.
5) Supernatant dibuang tanpa menggangu pellet.
6) Kemudian ditambahkan 150 L nuclei lysis solution ke pellet.
7) RNase solution ditambahkan sebanyak 0,75 L dan dicampurkan dengan cara
membolak-balik tabung.
8) Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.
9) Protein precipitation solution ditambahkan sebanyak 50 L ke dalam lisate dan di-vortex
selama 20 detik.
10) Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu
ruang.
11) Supernatan dipindahkan ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 500
L isopropanol.
12) Tabung dibolak-balik secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).
13) Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit.
17

14) Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 200 L alkohol 70% dingin.
15) Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2-3 menit pada suhu ruang,
sampai DNA berubah menjadi transparan.
16) Supernatan dibuang dan dikeringkan pada suhu ruang 5-10 menit.
17) DNA dilarutkan dengan 50 L rehydration solution.
18) DNA disimpan pada suhu -20 C.










18

Polymerase Chain Reaction
Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai polymerase chain reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.
Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti
di perusahaan CETUS Corporation. Kelompok CETUS pada tahun 1985 menemukan bahwa
DNA yang dicampur dengan deoksiribonukleotida trifosfat atau dNTP (yang terdiri dari ATP,
CTP, TTP dan GTP), enzim polimerase DNA dan sepasang primer jika dipanaskan, didinginkan
lalu dipanaskan lagi akan memperbanyak diri dua kali lipat. Jika siklus ini diulang sebanyak n
kali, maka DNA akan memperbanyak diri 2
n
kali lipat. PCR merupakan cara yang sensitif,
selektif dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuens DNA yang diinginkan. Sensitivitas
tersebut membuatnya dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Empat
komponen utama pada proses PCR adalah:
1. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan
2. Oligonuleotida primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek (15-25 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA
3. Deoksiribonuleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan
4. Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA.
Komplemen lain yang juga penting adalah senyawa buffer.
Proses PCR merupakan suatu siklus yang berulang, meliputi denaturasi, annealing adalah
langkah pengenalan primer ke pita DNA yang sesuai dan ekstensi oleh enzim DNA
polimerase.
Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai
sekuens yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan
oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuens pada ujung 3-OH rantai DNA cetakan
yang lain. Primer adalah fragmen DNA untai tunggal yang sengaja dibuat dan merupakan
komplemen dari bagian ujung DNA yang akan diperbanyak, sehingga dapat diibaratkan
sebagai patok pembatas bagian DNA yang akan diperbanyak.
Setelah primer disintesis dan menempel (anneal) pada DNA cetakan, kemudian dilakukan
sintesis DNA baru. Molekul primer digunakan untuk menempelkan nukleotida pertama pada
19

untaian DNA baru. Untaian DNA yang baru disintesis dengan menggunakan DNA cetakan
(DNA induk) sebagai acuan sehingga DNA baru bersifat komplementer dengan cetakannya.
Jika pada untaian DNA cetakan ada nukleotida A misalnya, maka akan diikatkan nukleotida T
pada ujung 3-OH primer, sedang jika pada cetakan ada nukleotida C maka akan diikatkan
nukleotida G. Demikian selanjutnya akan dilakukan pengikatan nukleotidanukleotida pada
ujung 3- OH yang komplementer dengan cetakannya sehingga terjadi pemanjangan untaian
DNA baru.

Tahapan PCR:
1. Denaturasi DNA meningkatkan temperatur hingga kurang lebih 94C selama 1 menit
sehingga terjadi pemisahan dari kedua untai DNA dupleks.
2. Annealing/hibridisasi suhu reaksi diturunkan menjadi 50C hingga 62C selama 1 menit
agar oligonukleotida dapat menempel pada DNA
3. Pemanjangan rantai (ekstensi) memanaskan kembali komponen reaksi pada suhu
72C selama 1 menit sehingga primer dapat diperpanjang oleh enzim DNA polimerase
hingga mencapai seluruh panjnag dari DNA sasaran.
Ketiga tahap ini diulang sebanya 25 hingga 35 kali.



20

Cara kerja:
1) Tabung PCR 0,2 mL disiapkan untuk setiap sampel dan dimasukkan dalam pemegang
(holder) mini sentrifuge, diposisikan pada pecahan es batu halus, agar suhu terjaga
dingin.
2) Ke dalam setiap tabung dimasukkan 1,25 L Primer Forward secara tepat di dasar
tabung.
3) Ditambahkan 6,25 L GoTaq Green Master Mix di atas Primer Forward pada tiap tabung.
4) Sampel DNA sebanyak 2 L dimasukkan ke tiap tabung di atas GoTaq Green Master Mix.
5) Di atas sampel DNA dimasukkan 16,5 L campuran buffer pH 8 + MgCl2 + air + Primer
Reverse.
6) Mesin PCR serta laptop yang sudah membuka software disiapkan.
7) Segera dimasukkan sampel pada PCR 36-well serta dipasang pengaman tutup tabung
dan ditempatkan kembali ke dalam wadah pecahan es batu.
8) PCR dijalankan sebanyak 40 siklus dengan suhu denaturasi 95
0
C, suhu annealing dan
ektensi 68,5
0
C.














21


Short Tandem Repeat
STR adalah bagian DNA manusia yang pendekpendek berupa 2-6 basa nitrogen yang
berulang dan bersifat sangat variatif (polimorfik), sehingga sangat cocok digunakan untuk
identifikasi personal dan kasus paternitas. STR merupakan DNA inti, sehingga diturunkan
dari kedua orang tua kepada anaknya menurut hukum mendel. STR mirip dengan VNTR dan
prinsip-prinsip umum untuk menggunakan mereka adalah sama. STR yang divisualisasikan
menggunakan teknik inovatif yang ditemukan pada tahun 1986 yang disebut Polymerase
Chain Reaction (PCR), memungkinkan amplifikasi DNA untuk pertama kalinya. Secara singkat
PCR memungkinkan DNA dari suatu daerah terpilih diamplifikasi hingga miliar kali lipat,
dengan ketentuan bahwa setidaknya ada beberapa bagian dari urutan nukleotida yang
dikenal.
Daerah DNA dengan unit berulang antara 2-6 pasang basa disebut mikrosatelit, urutan
pengulangan sederhana, atau short tandem repeats (STR). Teknologi STR digunakan untuk
mengevaluasi wilayah tertentu (lokus) dalam DNA inti. Variabilitas dalam regio STR dapat
digunakan untuk membedakan satu profil DNA dari yang lain. Pada tahun 1996, pemeriksaan
terhadap 13 lokus STR (yang dikenal sebagai Combined DNA Index System 13 atau CODIS 13)
dianjurkan oleh FBI digunakan pada kasus forensik untuk penyelesaian kasus korban tidak
dikenal (identifikasi personal), kasus paternitas maupun pelacakan sumber bahan biologis.
STR memilki keistimewaan karena memiliki variasi alel yang banyak, mudah digandakan di
laboratorium dan cepat analisisnya. Melakukan pemeriksaan dengan CODIS 13, identifikasi
individu dapat disimpulkan dengan ketepatan mendekati 100%.
Penggunaan PCR dalam analisis STR memungkinkan jumlah yang sangat kecil dari DNA,
seperti yang ditemukan pada secangkir prangko, puntung rokok, atau kopi, dapat diperkuat
untuk menghasilkan sejumlah besar DNA yang cukup untuk dianalisis. Secara singkat PCR
memungkinkan DNA dari suatu daerah terpilih diamplifikasi hingga miliar kali lipat, dengan
ketentuan bahwa setidaknya ada beberapa bagian dari urutan nukleotida yang dikenal.
Dalam pelaksanaan STR, dibutuhkan suatu elektroforesis. Elektroforesis DNA adalah
suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannnya, dengan
22

menggunakan metode listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,
ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Teknik elektroforesis dapat digunakan
untuk analisis DNA, RNA maupun protein. Untuk asam nukleat, jarak yang ditempuh molekul
itu ketika diberi arus berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya.
Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar
dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya positif. Bila
berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi
ke elektroda negatif dan demikian pula sebaliknya. Oleh karena DNA bermuatan negatif
maka molekulmolekul DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Posisi molekul yang
memisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi ataupun
dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Teknik elektroforesis DNA pun berkembang sehingga analisis molekul DNA tidak hanya
dilakukan dengan prinsip elektroforesis linear. Beberapa teknik baru dikembangkan,
misalnya teknik Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE), Orthogonal Field Alternation Gel
Electrophoresis (OFAGE), Transverse Alternating Field Electrophoresis (TAGE) dan lain-lain.
Disamping itu, untuk keperluan tertentu, misalnya untuk penetuan urutan basa DNA (DNA
sequencing), elektroforesis DNA dilakukan dengan menggunakan gel yang berbeda yaitu gel
poliakrilamid atau Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Sistem ini menunjukkan tiga
keunggulan daripada gel agarosa:
1. Kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa
dalam 500 pasang basa.
2. Sistem ini dapat menampung jumlah sampel lebih besar daripada agarosa.
3. DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat
digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus.
Cara kerja:
a. Elektroforesis
1) Marker disiapkan dengan mencampur 5 L marker + 1 L loading dye, kemudian
disentrifugasi selama 20 detik.
23

2) Gel poliakrilamida (PAGE) disiapkan pada chamber, lalu disemprotkan 1 mL buffer dari
chamber atas ke dalam setiap kolom, masing-masing 2 kali hingga setiap kolom
terhubung dengan buffer atas dengan genangan buffer.
3) Setiap kolom diisi dengan marker 6 L serta hasil PCR sebanyak 10 L.
4) Elektroforesis dijalankan dengan tegangan 100 V selama 60 menit.
b. Pewarnaan (staining)
1) Kaca PAGE dibuka secara hati-hati agar gel tidak robek, kemudian gel yang menempel
pada 1 sisi kaca dilepas menggunakan stik hitam.
2) Gel ditempatkan pada wadah pewarnaan dan diisi fiksator (asam asetat+metanol) 100
mL, kemudian di-steering selama 30 menit.
3) Larutan dibuang dan dicuci dengan aquades 200 mL, di-steering 10 menit. Selanjutnya
aquades dibuang dan dicuci kembali dengan aquades baru sebanyak 200 mL dan di-
steering selama 3 menit.
4) Aquades dibuang, lalu dimasukkan 100 mL perak (AgNO
3
) dan di-steering 20-30 menit.
5) Perak (AgNO
3
) dibuang dan dicuci dengan aquades 250 mL, lalu di-steering selama 20
detik.
6) Aquades dibuang, kemudian dimasukkan pengembang (Na
2
CO
3
) sebanyak 100 mL,
digoyang-goyang menggunakan tangan selama 3-5 menit.
7) Kertas seukuran gel dimasukkan ke dalam larutan tepat di bawah gel, kemudian diangkat
jika sepenuhnya kertas telah menjadi alas bagi gel.
8) Panjang lintasan diukur dari dasar kolom hingga garis pita dengan akurasi 0,05 cm,
demikian juga pita tiap marker.
9) Dihitung panjang basa dan alelnya.
Sekian tentirnya, semoga apa yang dipelajari dapat bermanfaat. Kalau bisa baca lagi literatur
lain selain tentir ini.
Semoga bermanfaat.
-RP-